引用本文： 張立超, 王晨宇, 劉博, 周元龍, 馬利鋒, 李濤, 劉懷軍. 白藜蘆醇對梗阻性黃疸大鼠中樞神經系統氧化應激損傷的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(1): 42-47. doi: 10.7507/1007-9424.20160011 復制
梗阻性黃疸可以導致機體氧化應激反應[1]，導致各器官如肝臟、腎臟、大腦等氧化應激損傷。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種在葡萄和紅酒中大量存在的一種黃酮類多酚化合物，是一種重要的植物抗毒素和抗氧化劑。研究[2]證實它在體內和體外均有廣泛的生物學效應和藥學活性作用，可以抵御活性自由基對機體細胞DNA的損傷并且防止細胞膜發生脂質過氧化反應。本研究通過觀察梗阻性黃疸大鼠大腦皮質中氧化應激指標表達水平的變化，以探討Res在梗阻性黃疸大鼠中樞神經系統氧化應激損傷過程中的作用及其機理。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
實驗動物健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠由河北醫科大學實驗動物中心提供，共32只，鼠齡6周，體質量260～300 g，飼養室溫（22±1）℃，相對濕度（50±5）%，人工晝夜各12 h，常規攝食及飲水，所有大鼠適應性喂養1周后再進行實驗。32只大鼠按隨機數字表法隨機均分為假手術組（SO組）、梗阻性黃疸組（OJ組）、梗阻性黃疸+低劑量白藜蘆醇（L-Res）處理組（OJ+L-Res組）和梗阻性黃疸+高劑量白藜蘆醇（H-Res）處理組（OJ+H-Res組）4組。模型制作成功后將大鼠置于室溫23～26℃、相對濕度40%～60%、安靜并且通風的環境中分籠喂養。SO組大鼠的體質量為（221±19.4）g（207～243 g），OJ組大鼠的體質量為（223±19.9）g（213～245 g），OJ+L-Res組大鼠的體質量為（220±22.1）g（207～244 g），OJ+H-Res組大鼠的體質量為（224±21.9）g（210～249 g），4組大鼠在鼠齡、體質量及飼養方法方面的差異均無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。
1.2 主要實驗材料、試劑和儀器
細胞裂解液及蛋白酶抑制劑(PMSF)，sigma公司；HRP兔二抗，Abcam公司；兔抗HO-1多克隆抗體及兔抗GAPDH多克隆抗體，Santa Cruz公司；丙二醛（MDA）試劑盒及總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒，南京建成試劑公司。臺式高速低溫離心機（Fresco17）及酶標儀，Thermo公司；電動勻漿機，德國MACS公司；半干式蛋白質印跡轉膜槽，美國Bio-Rad公司；PVDF膜，Millipore公司。
1.3 模型制作
大鼠術前需禁食12 h，禁水4 h。氯胺酮（20 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后取上腹正中切口長約1 cm，顯露肝十二指腸韌帶，并于近肝門處找到膽總管。OJ組、OJ+L-Res組和OJ+H-Res組大鼠游離膽總管滿意后于十二指腸上緣約1 cm處用可吸收線雙重結扎膽總管，于結扎線中間將膽總管橫斷[3]，建立OJ模型；SO組則只游離膽總管但不結扎。隨后用4-0及2-0絲線間斷縫合腹壁。術后第2天起，OJ+L-Res組和OJ+H-Res組大鼠分別給予Res混懸液10 mg / (kg· d）或20 mg / (kg· d）灌胃，連續14 d；SO組和OJ組大鼠以等體積的1%羧甲基纖維素鈉灌胃。適應期間及實驗過程中動物給予普飼料喂養并給予自由飲水。
1.4 取材
4組大鼠于建模術后14 d在處死前禁食12 h，自下腔靜脈采集全血2 mL，置于裝有促凝劑的離心管，于40℃以3 000r/min（離心半徑10 cm）離心15 min分離血清，然后將血清移入到普通Eppendorf管內，置于-20℃低溫冰箱內保存，用于檢測肝功能等各項指標。然后用20%的烏拉坦（0.12 g/100 g）腹腔注射麻醉、脫臼法處死大鼠，取出大腦組織，用4℃預冷生理鹽水沖洗后，立即置于液氮中，然后于-80℃保存備檢。
1.5 檢測指標及方法
1.5.1 標本處理
①取樣：從-80℃冰箱取出凍存的腦組織，稱量腦組織重量（≤100 mg），然后剪碎放入試管中。②水解：按樣本重量（mg）:堿液體積（μL）=1: 3的比例，取堿液加入試管中，沸水浴20 min，然后用流水冷卻至常溫。
1.5.2 腦組織中丙二醛（MDA）含量測定
應用南京建成總超氧化物歧化酶試劑盒說明書檢測，根據脂質過氧化產物MDA與硫代巴比妥酸縮合后形成紅色產物，這種物質在532 nm處有最大吸收峰的原理，用分光光度計測定此產物在532 nm下的吸光度值（A值）。實驗操作嚴格按照南京建成MDA試劑盒說明書進行。結果以每毫克樣本蛋白含有的MDA的納摩爾數表示（nmol/mg prot）。
1.5.3 腦組織中總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性測定
應用南京建成總超氧化物歧化酶試劑盒說明書檢測。將每毫克組織蛋白在1 mL反應液中T-SOD活性的抑制率達到50%時所對應的T-SOD的量定為1個T-SOD活性單位（U），結果以每毫克樣本蛋白含有的酶活性單位來表示（U/mg prot）。
1.5.4 腦組織中血紅素氧合酶-1（HO-1）蛋白表達的檢測
用Western bolt方法檢測腦組織中HO-1蛋白的表達。具體方法如下：稱取100 mg大鼠腦組織，加入總蛋白裂解液中，冰浴30 min，使用勻漿機攪拌，間斷混勻，離心后收集上清進行蛋白定量，剩余的分裝放-80℃凍存備用。取含相同量蛋白質溶液，用5×SDS上樣緩沖溶液（0.1 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8；20%甘油；0.1 %溴酚藍；10 %β-巰基乙醇；4% SDS）按照1 : 4比例稀釋，混合均勻，100℃水浴加熱5 min使蛋白充分變性，冷卻備用。配膠、電泳、轉膜后，取出PVDF膜，置于封閉液中，于室溫封閉2 h。將封閉好的膜，按比例加入兔抗HO-1多克隆抗體（1 : 500），用壓膜機將塑料小袋封好，4℃搖床過夜。然后取出PVDF膜放入盛有適量TPBS的平皿中，室溫洗膜，每次5 min，共4次，洗去未結合的一抗。將PVDF膜置入用TPBS 1 : 2 000稀釋的抗兔化學二抗溶液中，室溫1 h后取出PVDF膜放入盛有適量TPBS的平皿中，室溫洗膜，每次5 min，共4次，洗去未結合的二抗。再用PBS洗5 min，共1次。將PVDF膜用化學發光儀進行掃描，檢測抗體結合條帶，并保存結果。將掃描后的PVDF膜用TPBS洗過夜，封閉液重新封閉。再重新用GAPDH一抗封閉，4℃孵育過夜，洗膜，發光。將化學發光儀掃描出的照片條帶進行灰度值掃描，計算目的基因與內參基因條帶的灰度值，以目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值作為目的蛋白水平的相對表達量。采用Vilber Lourmat公司（美國）1D數碼成像分析軟件對Western blot顯色區帶的信號強度進行相對定量分析，HO-1蛋白相對表達量用光密度百分比（HO-1/GAPDH）表示。
1.6 統計學方法
實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。對測定結果進行正態性與方差齊性檢驗；計量資料采用均數±標準差（
2 結果
2.1 OJ大鼠動物模型建立情況
SO組大鼠與手術前相比無明顯變化，活動、進食及大小便均正常。另外3組大鼠在膽總管結扎48 h后其尿液顏色開始變黃，3 d后全身皮毛開始變黃，并出現食欲減退、精神萎靡，嗜睡，反應遲鈍且活動明顯減少；建模術后2周取大腦皮質標本時剖開腹腔，見OJ大鼠結扎線以上膽總管明顯擴張，肝臟淤膽明顯，呈黃褐色，且彌漫性腫大。
2.2 肝功能變化
建模術后14 d，OJ組、OJ+L-Res組及OJ+H-Res組大鼠的總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）水平均較SO組顯著升高(P < 0.05)；OJ+L-Res組及OJ+H-Res組大鼠的TBIL和DBIL水平與OJ組相比差異無統計學意義（P > 0.05），但ALT及AST水平明顯降低(P < 0.05)；OJ+L-Res組和OJ+H-Res組大鼠上述各指標比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
4組大鼠肝功能指標檢測結果（2.3 腦組織中MDA含量及T-SOD活性檢測結果
建模術后14 d，OJ組、OJ+L-Res組及OJ+H-Res組大鼠大腦皮質的MDA水平和T-SOD活性明顯高于或低于SO組（P < 0.05）；而OJ+L-Res組及OJ+H-Res組大鼠大腦皮質的MDA水平較OJ組降低（P < 0.05），但Res治療2組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；OJ+L-Res組及OJ+H-Res組大鼠大腦皮質中T-SOD活性增加，與OJ組相比差異有統計學意義（P < 0.05），且OJ+H-Res組T-SOD水平高于OJ+L-Res組，差異具有統計學意義（P < 0.05），見表 2。
表2
4組大鼠腦組織中MDA、T-SOD及HO-1檢測結果（2.4 腦組織中HO-1蛋白表達水平檢測結果
Westem blot印跡分析顯示，在相對分子質量為32×103處可見雜交蛋白條帶（HO-1），見圖 1。建模術后14 d，OJ組、OJ+H-Res組及OJ+L-Res組的HO-1蛋白相對表達量（光密度百分比：HO-1/GAPDH)均高于SO組（P < 0.05）；Res治療2組的HO-1蛋白相對表達量又高于OJ組，而OJ+H-Res組又高于OJ+L-Res組，其差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
圖1
4組大鼠腦組織中HO-1蛋白表達電泳結果。1：SO組；2：OJ組；3：OJ+L-Res組；4：OJ+H-Res組
3 討論
膽道系統梗阻時可發生梗阻性黃疸，高濃度的血清膽紅素可損傷中樞神經系統的血腦屏障，使血腦屏障中的閉合蛋白下降從而其通透性增加[4]，高膽紅素血癥最終導致體內活性氧自由基蓄積并對機體產生氧化應激損傷，而氧化應激損傷可以導致促炎性因子的釋放，而促炎性因子又可以反過來增加機體的氧化應激損傷，形成惡性循環[5]。同時由于肝臟膽汁淤積，肝細胞破壞，進而導致肝功能受損。
Res即3，5，8.三羥基二苯乙烯(3，5，4’-trihydroxystilbene)，有研究[6]表明，Res對許多器官、組織和細胞都具有清除羥氧基、過氧化物和金屬自由基以及抑制核轉錄因子-κB（NF-κB）激活的抗氧化作用。Res的作用機理包括：抑制脂質過氧化、銅離子螯合作用、清除自由基以及調節脂肪和脂蛋白的代謝[7]，從而保護由氧自由基(ROS)引起的脂質過氧化和DNA損傷[8]。
本研究采用梗阻性黃疸實驗模型制備的方法對4組大鼠在不同條件下對氧化應激損傷的作用進行了觀察，并以血清AST、ALT、DBIL和TBIL的水平變化來了解Res對肝功能的保護效果。結果發現：建模術后14 d，SO組大鼠的上述指標水平最低，OJ組、OJ+L-Res組及OJ+H-Res組的ALT、AST、TBIL和DBIL水平均較SO組明顯升高（P < 0.05），后3組之間TBIL及DBIL水平差異無統計學意義，而OJ+H-Res組和OJ+L-Res組的ALT和AST水平則明顯低于OJ組（P < 0.05），提示Res對血液中膽紅素的影響不大，不能降低黃疸程度，但可以保護肝臟功能，其機理可能在于Res同時增強了肝臟組織SOD、HO-1等抗氧化物的水平，提高了肝臟組織清除自由基的能力，減少了自由基對肝臟組織的攻擊，保護了肝細胞膜結構的完整性，肝臟組織破壞減少，從而降低血清中ALT及AST水平[9]。但不同劑量的Res對ALT及AST水平變化的影響也不大（P > 0.05）。
研究[10]發現，Res可以減輕脂質的過氧化程度并降低細胞內MDA的水平，提高肝細胞的抗氧化應激能力，使SOD與谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性升高，從而進一步發揮Res對肝細胞的保護作用。MDA是體內氧化應激反應時脂質過氧化的終末產物之一，可與機體中蛋白質、核酸等生物大分子結合并形成復合物，最終導致蛋白酶和DNA修復障礙，因此MDA常用于反映體內脂質過氧化的程度，測定MDA含量可間接反映氧自由基對細胞的損傷程度[11]。本研究中，結扎膽總管后大鼠的MDA水平上升，與ALT及AST的變化一致，OJ+L-Res組及OJ+H-Res組的MDA與OJ組相比明顯下降（P < 0.05）。SOD是機體的抗氧化物質，其活力的高低可間接反映機體清除氧自由基的能力[12]。在OJ+L-Res組及OJ+H-Res組，MDA水平較OJ組下降，但2組間的差異無統計學意義（P > 0.05）；而T-SOD水平則較OJ組上升，且OJ+H-Res組又高于OJ+L-Res組（P < 0.05），表明Res具有良好的抗氧化性，可提高大鼠中樞神經系統的抗氧化應激損傷能力。
HO是血紅素分解起始代謝的限速酶。HO-1為HO中可誘導型[13-14]，HO-1大量表達可以對抗氧化應激的損傷[15-16]。HO-1不僅可以通過產生抗氧化劑來發揮它的細胞保護作用，而且可以通過促進鐵蛋白的合成來維持內環境中鐵離子的平衡，進而來防止鐵離子成為氧化劑應激反應的催化劑。體外實驗證明，Res可以誘導神經元細胞的內源性HO-1表達增加[17]并通過誘導HO-1的表達表現出廣泛的生物作用，包括抗過敏、抗癌及抗炎癥作用[18]、神經保護作用[19]、化療導致的機體氧化應激損傷毒性[20]以及抗氧化應激損傷作用。Huang等[21]研究發現，Res通過NF-κB途徑刺激HO-1表達增加，并且呈濃度依賴性。Sakata等[22]發現，Res以時間和劑量依賴性促進大鼠脊髓神經元細胞HO-1的生成，這樣就能提供神經保護作用并使神經細胞免受自由基和毒性的損傷。但是當給予HO-1抗體時，這種保護作用即消失，說明Res對氧化應激的保護作用至少在部分上是從HO-1途徑起效的。有研究[23]發現，Res發生抗氧化作可能同過誘導型一氧化氮合成酶而起作用的。應用Res可減輕活性氮簇的水平[24]。同時，Res自身也可以修飾HO-1的活性。Sakata等[22]的研究發現，HO-1可能是Res誘導機體產生內源性應激保護作用的唯一參與者。HO-1途徑可以解釋Res在中樞神經系統中的保護作用機理。本研究試圖利用Res可以誘導HO-l的增加這一機理來觀察其對梗阻性黃疸大鼠的大腦損傷的保護作用。結果發現，OJ組大鼠在建模術后14 d時HO-1表達增高，而OJ+L-Res組及OJ+H-Res組的HO-1較OJ組明顯升高，各組間的HO-1水平呈現SO組< OJ組< OJ+L-Res組< OJ+H-Res組的趨勢。該結果提示，梗阻性黃疸大鼠中樞神經系統內發生氧化應激損傷，而機體則相應提高了HO-1水平以增強抗氧化應激能力；應用Res后，進一步提升了HO-1水平說明Res成功誘導OJ大鼠大腦皮質HO-1的高表達，其中以OJ+H-Res組升高明顯，提示在梗阻性黃疸引起的中樞神經系統氧化應激反應中，Res可以提高機體抗氧化應激損傷能力。然而目前Res提高HO-1表達的具體分子機理仍不清楚，有研究[25]推測Res的保護作用可能是通過抗衰老酶（sirtuins）引起的，但是一般情況下抗衰老酶是對小鼠致死的, 所以這個推斷也有待進一步驗證。
研究證實梗阻性黃疸時機體存在氧化應激反應，中樞神經系統同樣也是。因而抗氧化劑在改善機體的氧化應激能力、維持內環境穩定以及在腦損傷保護方面的應用顯得尤為重要。清除自由基和抗氧化應激損傷作用是符合處理梗阻性黃疸時中樞神經系統氧化應激損傷的一條可行途徑。Res作為抗氧化劑在多種疾病的氧化應激損傷中對機體各個器官的保護作用已經被不斷證實。本研究證實由梗阻性黃疸引起的中樞神經系統氧化應激損傷可以通過應用Res來減輕，而且此作用至少有部分是通過誘導HO-1及SOD的表達增加來實現的。同時Res還有保護肝功能的作用，但是Res對梗阻性黃疸時血液中膽紅素水平的影響不大。期待該實驗結果能為梗阻性黃疸患者的臨床診療提供新思路及依據。
梗阻性黃疸可以導致機體氧化應激反應[1]，導致各器官如肝臟、腎臟、大腦等氧化應激損傷。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種在葡萄和紅酒中大量存在的一種黃酮類多酚化合物，是一種重要的植物抗毒素和抗氧化劑。研究[2]證實它在體內和體外均有廣泛的生物學效應和藥學活性作用，可以抵御活性自由基對機體細胞DNA的損傷并且防止細胞膜發生脂質過氧化反應。本研究通過觀察梗阻性黃疸大鼠大腦皮質中氧化應激指標表達水平的變化，以探討Res在梗阻性黃疸大鼠中樞神經系統氧化應激損傷過程中的作用及其機理。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
實驗動物健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠由河北醫科大學實驗動物中心提供，共32只，鼠齡6周，體質量260～300 g，飼養室溫（22±1）℃，相對濕度（50±5）%，人工晝夜各12 h，常規攝食及飲水，所有大鼠適應性喂養1周后再進行實驗。32只大鼠按隨機數字表法隨機均分為假手術組（SO組）、梗阻性黃疸組（OJ組）、梗阻性黃疸+低劑量白藜蘆醇（L-Res）處理組（OJ+L-Res組）和梗阻性黃疸+高劑量白藜蘆醇（H-Res）處理組（OJ+H-Res組）4組。模型制作成功后將大鼠置于室溫23～26℃、相對濕度40%～60%、安靜并且通風的環境中分籠喂養。SO組大鼠的體質量為（221±19.4）g（207～243 g），OJ組大鼠的體質量為（223±19.9）g（213～245 g），OJ+L-Res組大鼠的體質量為（220±22.1）g（207～244 g），OJ+H-Res組大鼠的體質量為（224±21.9）g（210～249 g），4組大鼠在鼠齡、體質量及飼養方法方面的差異均無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。
1.2 主要實驗材料、試劑和儀器
細胞裂解液及蛋白酶抑制劑(PMSF)，sigma公司；HRP兔二抗，Abcam公司；兔抗HO-1多克隆抗體及兔抗GAPDH多克隆抗體，Santa Cruz公司；丙二醛（MDA）試劑盒及總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒，南京建成試劑公司。臺式高速低溫離心機（Fresco17）及酶標儀，Thermo公司；電動勻漿機，德國MACS公司；半干式蛋白質印跡轉膜槽，美國Bio-Rad公司；PVDF膜，Millipore公司。
1.3 模型制作
大鼠術前需禁食12 h，禁水4 h。氯胺酮（20 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后取上腹正中切口長約1 cm，顯露肝十二指腸韌帶，并于近肝門處找到膽總管。OJ組、OJ+L-Res組和OJ+H-Res組大鼠游離膽總管滿意后于十二指腸上緣約1 cm處用可吸收線雙重結扎膽總管，于結扎線中間將膽總管橫斷[3]，建立OJ模型；SO組則只游離膽總管但不結扎。隨后用4-0及2-0絲線間斷縫合腹壁。術后第2天起，OJ+L-Res組和OJ+H-Res組大鼠分別給予Res混懸液10 mg / (kg· d）或20 mg / (kg· d）灌胃，連續14 d；SO組和OJ組大鼠以等體積的1%羧甲基纖維素鈉灌胃。適應期間及實驗過程中動物給予普飼料喂養并給予自由飲水。
1.4 取材
4組大鼠于建模術后14 d在處死前禁食12 h，自下腔靜脈采集全血2 mL，置于裝有促凝劑的離心管，于40℃以3 000r/min（離心半徑10 cm）離心15 min分離血清，然后將血清移入到普通Eppendorf管內，置于-20℃低溫冰箱內保存，用于檢測肝功能等各項指標。然后用20%的烏拉坦（0.12 g/100 g）腹腔注射麻醉、脫臼法處死大鼠，取出大腦組織，用4℃預冷生理鹽水沖洗后，立即置于液氮中，然后于-80℃保存備檢。
1.5 檢測指標及方法
1.5.1 標本處理
①取樣：從-80℃冰箱取出凍存的腦組織，稱量腦組織重量（≤100 mg），然后剪碎放入試管中。②水解：按樣本重量（mg）:堿液體積（μL）=1: 3的比例，取堿液加入試管中，沸水浴20 min，然后用流水冷卻至常溫。
1.5.2 腦組織中丙二醛（MDA）含量測定
應用南京建成總超氧化物歧化酶試劑盒說明書檢測，根據脂質過氧化產物MDA與硫代巴比妥酸縮合后形成紅色產物，這種物質在532 nm處有最大吸收峰的原理，用分光光度計測定此產物在532 nm下的吸光度值（A值）。實驗操作嚴格按照南京建成MDA試劑盒說明書進行。結果以每毫克樣本蛋白含有的MDA的納摩爾數表示（nmol/mg prot）。
1.5.3 腦組織中總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性測定
應用南京建成總超氧化物歧化酶試劑盒說明書檢測。將每毫克組織蛋白在1 mL反應液中T-SOD活性的抑制率達到50%時所對應的T-SOD的量定為1個T-SOD活性單位（U），結果以每毫克樣本蛋白含有的酶活性單位來表示（U/mg prot）。
1.5.4 腦組織中血紅素氧合酶-1（HO-1）蛋白表達的檢測
用Western bolt方法檢測腦組織中HO-1蛋白的表達。具體方法如下：稱取100 mg大鼠腦組織，加入總蛋白裂解液中，冰浴30 min，使用勻漿機攪拌，間斷混勻，離心后收集上清進行蛋白定量，剩余的分裝放-80℃凍存備用。取含相同量蛋白質溶液，用5×SDS上樣緩沖溶液（0.1 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8；20%甘油；0.1 %溴酚藍；10 %β-巰基乙醇；4% SDS）按照1 : 4比例稀釋，混合均勻，100℃水浴加熱5 min使蛋白充分變性，冷卻備用。配膠、電泳、轉膜后，取出PVDF膜，置于封閉液中，于室溫封閉2 h。將封閉好的膜，按比例加入兔抗HO-1多克隆抗體（1 : 500），用壓膜機將塑料小袋封好，4℃搖床過夜。然后取出PVDF膜放入盛有適量TPBS的平皿中，室溫洗膜，每次5 min，共4次，洗去未結合的一抗。將PVDF膜置入用TPBS 1 : 2 000稀釋的抗兔化學二抗溶液中，室溫1 h后取出PVDF膜放入盛有適量TPBS的平皿中，室溫洗膜，每次5 min，共4次，洗去未結合的二抗。再用PBS洗5 min，共1次。將PVDF膜用化學發光儀進行掃描，檢測抗體結合條帶，并保存結果。將掃描后的PVDF膜用TPBS洗過夜，封閉液重新封閉。再重新用GAPDH一抗封閉，4℃孵育過夜，洗膜，發光。將化學發光儀掃描出的照片條帶進行灰度值掃描，計算目的基因與內參基因條帶的灰度值，以目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值作為目的蛋白水平的相對表達量。采用Vilber Lourmat公司（美國）1D數碼成像分析軟件對Western blot顯色區帶的信號強度進行相對定量分析，HO-1蛋白相對表達量用光密度百分比（HO-1/GAPDH）表示。
1.6 統計學方法
實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。對測定結果進行正態性與方差齊性檢驗；計量資料采用均數±標準差（
2 結果
2.1 OJ大鼠動物模型建立情況
SO組大鼠與手術前相比無明顯變化，活動、進食及大小便均正常。另外3組大鼠在膽總管結扎48 h后其尿液顏色開始變黃，3 d后全身皮毛開始變黃，并出現食欲減退、精神萎靡，嗜睡，反應遲鈍且活動明顯減少；建模術后2周取大腦皮質標本時剖開腹腔，見OJ大鼠結扎線以上膽總管明顯擴張，肝臟淤膽明顯，呈黃褐色，且彌漫性腫大。
2.2 肝功能變化
建模術后14 d，OJ組、OJ+L-Res組及OJ+H-Res組大鼠的總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）水平均較SO組顯著升高(P < 0.05)；OJ+L-Res組及OJ+H-Res組大鼠的TBIL和DBIL水平與OJ組相比差異無統計學意義（P > 0.05），但ALT及AST水平明顯降低(P < 0.05)；OJ+L-Res組和OJ+H-Res組大鼠上述各指標比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
4組大鼠肝功能指標檢測結果（2.3 腦組織中MDA含量及T-SOD活性檢測結果
建模術后14 d，OJ組、OJ+L-Res組及OJ+H-Res組大鼠大腦皮質的MDA水平和T-SOD活性明顯高于或低于SO組（P < 0.05）；而OJ+L-Res組及OJ+H-Res組大鼠大腦皮質的MDA水平較OJ組降低（P < 0.05），但Res治療2組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）；OJ+L-Res組及OJ+H-Res組大鼠大腦皮質中T-SOD活性增加，與OJ組相比差異有統計學意義（P < 0.05），且OJ+H-Res組T-SOD水平高于OJ+L-Res組，差異具有統計學意義（P < 0.05），見表 2。
表2
4組大鼠腦組織中MDA、T-SOD及HO-1檢測結果（2.4 腦組織中HO-1蛋白表達水平檢測結果
Westem blot印跡分析顯示，在相對分子質量為32×103處可見雜交蛋白條帶（HO-1），見圖 1。建模術后14 d，OJ組、OJ+H-Res組及OJ+L-Res組的HO-1蛋白相對表達量（光密度百分比：HO-1/GAPDH)均高于SO組（P < 0.05）；Res治療2組的HO-1蛋白相對表達量又高于OJ組，而OJ+H-Res組又高于OJ+L-Res組，其差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
圖1
4組大鼠腦組織中HO-1蛋白表達電泳結果。1：SO組；2：OJ組；3：OJ+L-Res組；4：OJ+H-Res組
3 討論
膽道系統梗阻時可發生梗阻性黃疸，高濃度的血清膽紅素可損傷中樞神經系統的血腦屏障，使血腦屏障中的閉合蛋白下降從而其通透性增加[4]，高膽紅素血癥最終導致體內活性氧自由基蓄積并對機體產生氧化應激損傷，而氧化應激損傷可以導致促炎性因子的釋放，而促炎性因子又可以反過來增加機體的氧化應激損傷，形成惡性循環[5]。同時由于肝臟膽汁淤積，肝細胞破壞，進而導致肝功能受損。
Res即3，5，8.三羥基二苯乙烯(3，5，4’-trihydroxystilbene)，有研究[6]表明，Res對許多器官、組織和細胞都具有清除羥氧基、過氧化物和金屬自由基以及抑制核轉錄因子-κB（NF-κB）激活的抗氧化作用。Res的作用機理包括：抑制脂質過氧化、銅離子螯合作用、清除自由基以及調節脂肪和脂蛋白的代謝[7]，從而保護由氧自由基(ROS)引起的脂質過氧化和DNA損傷[8]。
本研究采用梗阻性黃疸實驗模型制備的方法對4組大鼠在不同條件下對氧化應激損傷的作用進行了觀察，并以血清AST、ALT、DBIL和TBIL的水平變化來了解Res對肝功能的保護效果。結果發現：建模術后14 d，SO組大鼠的上述指標水平最低，OJ組、OJ+L-Res組及OJ+H-Res組的ALT、AST、TBIL和DBIL水平均較SO組明顯升高（P < 0.05），后3組之間TBIL及DBIL水平差異無統計學意義，而OJ+H-Res組和OJ+L-Res組的ALT和AST水平則明顯低于OJ組（P < 0.05），提示Res對血液中膽紅素的影響不大，不能降低黃疸程度，但可以保護肝臟功能，其機理可能在于Res同時增強了肝臟組織SOD、HO-1等抗氧化物的水平，提高了肝臟組織清除自由基的能力，減少了自由基對肝臟組織的攻擊，保護了肝細胞膜結構的完整性，肝臟組織破壞減少，從而降低血清中ALT及AST水平[9]。但不同劑量的Res對ALT及AST水平變化的影響也不大（P > 0.05）。
研究[10]發現，Res可以減輕脂質的過氧化程度并降低細胞內MDA的水平，提高肝細胞的抗氧化應激能力，使SOD與谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性升高，從而進一步發揮Res對肝細胞的保護作用。MDA是體內氧化應激反應時脂質過氧化的終末產物之一，可與機體中蛋白質、核酸等生物大分子結合并形成復合物，最終導致蛋白酶和DNA修復障礙，因此MDA常用于反映體內脂質過氧化的程度，測定MDA含量可間接反映氧自由基對細胞的損傷程度[11]。本研究中，結扎膽總管后大鼠的MDA水平上升，與ALT及AST的變化一致，OJ+L-Res組及OJ+H-Res組的MDA與OJ組相比明顯下降（P < 0.05）。SOD是機體的抗氧化物質，其活力的高低可間接反映機體清除氧自由基的能力[12]。在OJ+L-Res組及OJ+H-Res組，MDA水平較OJ組下降，但2組間的差異無統計學意義（P > 0.05）；而T-SOD水平則較OJ組上升，且OJ+H-Res組又高于OJ+L-Res組（P < 0.05），表明Res具有良好的抗氧化性，可提高大鼠中樞神經系統的抗氧化應激損傷能力。
HO是血紅素分解起始代謝的限速酶。HO-1為HO中可誘導型[13-14]，HO-1大量表達可以對抗氧化應激的損傷[15-16]。HO-1不僅可以通過產生抗氧化劑來發揮它的細胞保護作用，而且可以通過促進鐵蛋白的合成來維持內環境中鐵離子的平衡，進而來防止鐵離子成為氧化劑應激反應的催化劑。體外實驗證明，Res可以誘導神經元細胞的內源性HO-1表達增加[17]并通過誘導HO-1的表達表現出廣泛的生物作用，包括抗過敏、抗癌及抗炎癥作用[18]、神經保護作用[19]、化療導致的機體氧化應激損傷毒性[20]以及抗氧化應激損傷作用。Huang等[21]研究發現，Res通過NF-κB途徑刺激HO-1表達增加，并且呈濃度依賴性。Sakata等[22]發現，Res以時間和劑量依賴性促進大鼠脊髓神經元細胞HO-1的生成，這樣就能提供神經保護作用并使神經細胞免受自由基和毒性的損傷。但是當給予HO-1抗體時，這種保護作用即消失，說明Res對氧化應激的保護作用至少在部分上是從HO-1途徑起效的。有研究[23]發現，Res發生抗氧化作可能同過誘導型一氧化氮合成酶而起作用的。應用Res可減輕活性氮簇的水平[24]。同時，Res自身也可以修飾HO-1的活性。Sakata等[22]的研究發現，HO-1可能是Res誘導機體產生內源性應激保護作用的唯一參與者。HO-1途徑可以解釋Res在中樞神經系統中的保護作用機理。本研究試圖利用Res可以誘導HO-l的增加這一機理來觀察其對梗阻性黃疸大鼠的大腦損傷的保護作用。結果發現，OJ組大鼠在建模術后14 d時HO-1表達增高，而OJ+L-Res組及OJ+H-Res組的HO-1較OJ組明顯升高，各組間的HO-1水平呈現SO組< OJ組< OJ+L-Res組< OJ+H-Res組的趨勢。該結果提示，梗阻性黃疸大鼠中樞神經系統內發生氧化應激損傷，而機體則相應提高了HO-1水平以增強抗氧化應激能力；應用Res后，進一步提升了HO-1水平說明Res成功誘導OJ大鼠大腦皮質HO-1的高表達，其中以OJ+H-Res組升高明顯，提示在梗阻性黃疸引起的中樞神經系統氧化應激反應中，Res可以提高機體抗氧化應激損傷能力。然而目前Res提高HO-1表達的具體分子機理仍不清楚，有研究[25]推測Res的保護作用可能是通過抗衰老酶（sirtuins）引起的，但是一般情況下抗衰老酶是對小鼠致死的, 所以這個推斷也有待進一步驗證。
研究證實梗阻性黃疸時機體存在氧化應激反應，中樞神經系統同樣也是。因而抗氧化劑在改善機體的氧化應激能力、維持內環境穩定以及在腦損傷保護方面的應用顯得尤為重要。清除自由基和抗氧化應激損傷作用是符合處理梗阻性黃疸時中樞神經系統氧化應激損傷的一條可行途徑。Res作為抗氧化劑在多種疾病的氧化應激損傷中對機體各個器官的保護作用已經被不斷證實。本研究證實由梗阻性黃疸引起的中樞神經系統氧化應激損傷可以通過應用Res來減輕，而且此作用至少有部分是通過誘導HO-1及SOD的表達增加來實現的。同時Res還有保護肝功能的作用，但是Res對梗阻性黃疸時血液中膽紅素水平的影響不大。期待該實驗結果能為梗阻性黃疸患者的臨床診療提供新思路及依據。
