引用本文： 王康武, 劉學剛, 王祖義, 尹成果, 丁力, 刁文杰. Nkx2.5基因在肺血減少型先天性心臟病右心室流出道心肌突變及表達中的意義. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(1): 44-49. doi: 10.7507/1007-4848.20160011 復制
近年來，先天性心臟病（先心病）中Nkx2.5基因（同源盒轉錄因子）突變不斷地被發現，通過對新發現的Nkx2.5基因突變進行功能上的研究，有助于了解該基因在心臟中的功能。繼續尋找新的Nkx2.5基因突變成為一種趨勢[1-2]。目前，調控右心室流出道梗阻的基因及相關分子機制成為研究熱點[3-5]。本研究通過收集肺血減少型先天性心臟病患者及室間隔缺損患者的外周靜脈血及心肌組織標本，從分子水平探討Nkx2.5基因突變及其表達水平的變化與肺血減少型先天性心臟病的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2012年5月至2014年5月蚌埠醫學院第一附屬醫院與安徽省立兒童醫院心臟外科收治的56例肺血減少型先天性心臟病患者為試驗組，同期收治的63例室間隔缺損患者為對照組。兩組患者均經心臟超聲檢查和手術確診，無先天性心臟病家族史；智力發育均正常，面容無明顯異常；通過心臟超聲及胸部X線片等常規檢查均未發現合并其他主要臟器的畸形；手術均在體外循環輔助下進行。
試驗組選擇肺血減少型先天性心臟病患者，共56例，男30例、女26例，年齡6個月～14 （5.82±4.23）歲；體重5.8～33.2 （18.45±0.69）kg。其中法洛四聯癥42例（合并卵圓孔未閉9例、房間隔缺損6例），右心室雙出口（法四型）5例，房間隔缺損合并肺動脈狹窄5例，單心室合并肺動脈狹窄2例，三尖瓣閉鎖+大動脈轉位+肺動脈狹窄2例。患者術前均有不同程度的紫紺、缺氧、活動耐量降低等表現，體格檢查均有不同程度的肺動脈第二聽診音（P2）降低，輔助檢查：動脈血氧分壓（PaO2）（52.9±8.7）mm Hg、動脈血氧飽和度（SaO2）85.6%±6.4%、紅細胞壓積（HCT）49.8%±4.3%、血紅蛋白（Hb）（16.6±1.4）g/d l。
對照組63例，男36例、女27例，年齡6個月～14 （6.93±4.56）歲，體重6.3～35.5 （19.87±0.63）kg。對照組入組患者需滿足條件：（1）室間隔缺損小于1 cm；（2）胸部X線片示心胸比率≤0.6；（3）動脈血氧飽和度≥95%。
兩組患者性別、年齡、體重等一般資料差異均無統計學意義（P > 0.05）。本研究經蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會討論批準，并征得患者監護人知情同意，簽署知情同意書。
1.2 主要儀器和試劑
主要儀器和試劑包括紫外分光光度儀（Eppendorf公司）、PCR擴增儀（東勝國際貿易有限公司）、水平電泳槽和電泳儀（北京六一儀器廠）、實時定量PCR儀（Step One Plus，ABI公司）、全自動凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）、SYBR? Premix Ex Taq、M-MLV反轉錄酶（Fermentas公司）、DNA Ladder Marker、DNA提取試劑盒和非離心柱試劑盒（北京TIANGEN公司）、GAPDH內參照（上海生工生物工程股份有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 標本留取
兩組均在體外循環下行心臟直視手術，采集其術前外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸二鈉抗凝，-20℃冰箱凍存備用。取術中右心室流出道肥厚心肌組織0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，將心肌組織置于Trizol液中，組織勻漿機打碎組織，-80℃凍存備用。
1.3.2 基因組DNA的制備
取周圍靜脈血2 ml, 按非離心柱試劑盒步驟提取基因組DNA。
1.3.3 PCR反應及產物鑒定
根據已知該基因兩個外顯子的序列, 按引物設計原則進行引物設計。將2個外顯子（exon）分為4部分, 4對引物（表 1）。引物由上海生工生物公司合成。25μl PCR反應體系（即PCR的混合物）中，基因組DNA 1μl，10×Buffer（10倍稀釋的磷酸緩沖液）215μl，215 mol/L，dNTP2μl，10μmol/L上、下游引物各1μl，DNA聚合酶1125 U。PCR反應條件：預變性95℃3 min，變性95℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃45 s，終延伸72℃8 min，共40個循環。產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外光下鑒定產物。
表1
NKX2.5基因外顯子的名稱、序列及片段大小（bp）
1.3.4 PCR-DNA測序技術
應用美國ABI 310遺傳分析儀進行毛細管電泳，按照操作程序將PCR產物放入分析儀中自動進行測序。測序進行完畢后，利用GENERUNR及VNTI軟件程序予以分析，并把測序結果與美國國立醫學圖書館中的國家生物技術信息中心（NCBI）和PubMed文獻數據庫、單核苷酸多態性（SNP）數據庫已發表的Nkx2.5基因變異位點進行比較，并觀察每一個測序的峰型。如果出現測序結果的雜帶較多者，予以分析原因，并排除影響的因素后予以第2次正向測序；如果出現測序結果異常者，需行反向測序及重復PCR擴增測序證實。
1.4 實時熒光定量PCR
應用Trizol試劑按常規方法提取心肌組織總RNA，轉錄成cDNA，以GAPDH為內參照，引物釆用Primers軟件設計（目的基因的標準序列來自美國國立衛生研究院維護的基因序列數據庫：NICIGenBank? ），交由上海生工生物工程股份有限公司合成（表 2），引物合成后用純超水溶解，充分震蕩5～10 min，放置-20℃保存備用。
表2
各引物的名稱、序列及產物長度（bp）
針對所要測量的目的基因Nkx2.5與內參照基因GAPDH，選擇cDNA模板進行反應，PCR反應條件如上，引物見表 2，將PCR產物進行10倍的梯度稀釋：設定PCR產物濃度為1，分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4和10-5梯度濃度，每個副孔重復3次，梯度稀釋的DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置Real-time PCR反應體系，反應體系為20μl，Real-time PCR反應條件：預變性95℃30 s，PCR反應95℃5 s，收集熒光55℃30 s，40個循環。溶解曲線分析：95℃15 s，55℃60 s，95℃15 s。
反應結束后，首先應觀察并確認PCR產物的溶解曲線，觀察其有無非特異性的擴增以及引物二聚體現象的發生；然后由擴增曲線所在對數增長期確定其熒光閾值(Ct值），釆用2-ΔΔCt法計算其結果(相對定量)。以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）為內參照計算Nkx2.5基因的相對表達量，即ΔCt=CtNkx2.5-CtGAPDH為每個樣本的ΔCt，而ΔΔCt=ΔCt試驗組-ΔCt對照組。
1.5 統計學分析
應用SPSS17.0統計軟件進行數據處理。對數據進行正態分布檢驗和方差齊性檢驗，正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。同一組內處理前后的資料采用配對t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 PCR擴增結果
所有PCR產物均經瓊脂糖凝膠電泳驗證。全自動凝膠成像系統紫外光源下觀察，與DNA marker比照，所得PCR擴增產物的長度與設計的片段長度相吻合，其特異性亦較理想。M為分子量標記（圖 1）。
圖1
Nkx2.5外顯子的PCR產物電泳圖
注：M: 100bp DNA ladder maker；1：Nkx2.5-Exon 1-1；251bp；2：Nkx2.5-Exon 2-1，469bp；3：Nkx2.5-Exon 1-2，285bp；4：Nkx2.5-Exon 2-2，442bp
2.2 測序結果
所有試驗組和對照組進行Nkx2.5基因序列測定后，均未發現Nkx2.5基因突變。
2.3 總RNA提取電泳圖檢測
提取的心肌組織RNA使用紫外分光光度儀測定濃度及光密度（optical density，OD）值，所提取的RNAOD260/280值在1.8～2.0之間，表明提取的總RNA純度較高可用于后續試驗。0.5X: 0.045 mol/LTBE液配制瓊脂糖凝膠電泳，可見兩條清晰條帶，為28S和18S，隱約可見的條帶為5S，表明所提取的RNA很完整，沒有被降解和污染（圖 2）。
圖2
心肌組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖
2.4 實時熒光定量PCR檢測結果
擴增曲線（圖 3）示所有樣品均已進入擴增平臺期，說明反應條件設定準確。本試驗溶解曲線（圖 4）示均形成單峰，說明擴增產物為一種物質，具有特異性，無引物二聚體等非特異擴增出現。根據擴增曲線得到GAPDH的Ct值，用2-ΔΔCt進行相對定量的前提是目的基因的擴增效率與內參的擴增效率基本一致，在cDNA對數濃度與ΔCt關系曲線中，斜率為-0.0488，接近于0，說明內參GAPDH與Nkx2.5基因的擴增效率基本一致；Nkx2.5與GAPDH對應的相關系數分別為0.9987和0.9992，斜率分別為-3.3728和-3.4017，擴增效率分別為97%和98%，表明Nkx2.5與GAPDH兩者間有良好的線性關系。
圖3
內參照GAPDH和Nkx2.5基因的擴增曲線
圖4
內參照GAPDH和Nkx2.5基因的溶解曲線
注：a為內參照GAPDH溶解曲線，b為Nkx2.5基因的溶解曲線，c為內參照GAPDH和Nkx2.5基因的溶解曲線
試驗組Nkx2.5基因的相對表達量為2.9277±1.2865，對照組Nkx2.5基因的相對表達量為6.3647±1.5302，試驗組中Nkx2.5基因mRNA表達明顯低于對照組，差異有統計學意義（t=-6.83，P < 0.01，圖 5）。
圖5
試驗組與對照組的Nkx2.5基因mRNA的相對表達水平
注：A為對照組B:為試驗組
3 討論
Nkx2.5基因作為心臟前體細胞分化最早期的標志之一[6]，其外顯子與側翼序列間存在許多啟動子、增強子、抑制因子及自動調節因子，在基因調控中具有重要功能。一方面，這些元件在不同時空上調控Nkx2.5基因本身的表達，使其在心臟與其它器官的發育過程中起著復雜的調節作用；另一方面，Nkx2.5基因作為其上游的主基因，參與調控下游許多基因的表達，其下游基因包括BMP、ANF、Nmyc、MLC2V、Msx2、MEF2C及dHAND。當NKX2-5基因發生異常時，該類基因在心臟中的表達將會有所改變[7-9]。Nkx2.5基因主要是通過目的基因中的相應順式作用元件與同源結構域結合，作為轉錄因子并啟動下游基因的轉錄。Nkx2.5基因不僅引起BMP10的表達量明顯增加進而導致心室肌的增厚，并且可引起許多其他的基因表達異常[10]。另外，Nkx2.5基因的編碼蛋白具有4個高度保守的結構域，即N端的tin結構域、由60個氨基酸構成的同源盒結構域、下游的NK2-SD及含有17個氨基酸組成的GI-RAW保守序列的C-末端結構域[11-13]。其中，目的基因相應的啟動子可以與Nkx2.5基因的編碼蛋白結合，對這種蛋白質-DNA的結合作用具有意義的氨基酸包括Asn、Arg、Glu、Gln、Lys等，這些氨基酸的變化將引起蛋白質-DNA間親和力的改變，并且影響基因的轉錄，產生相關的蛋白缺陷，最終導致畸形[14-15]。
本試驗應用PCR-DNA直接測序的方法對56例肺血減少型先心病患者和63例室間隔缺損患者術前外周靜脈血進行Nkx2.5基因的全部外顯子進行檢測。結果在所有肺血減少型先心病和單純型室間隔缺損患者中沒有發現關于Nkx2.5基因外顯子發生突變，可能原因包括：第一，該基因的體細胞突變率發生低，在肺血減少型先心病中基因突變率低，可能是收集的樣本例數太少。因為樣本數量的限制而沒有發現突變，因此有待于進一步加大樣本量進行研究。第二，Nkx2.5基因的編碼區發生突變，可能不是引起肺血減少型先心病體細胞突變的致病基因，該基因其他位置堿基的改變，如編碼區外基因的突變、基因表達的異常，也可能引起心臟畸形的發生。因此，通過檢測Nkx2.5基因的表達情況具有非常重要的實際意義。第三，通過對外周血中體細胞突變進行篩查，雖然沒有發現異常突變，但不排除有生殖細胞突變的可能，所以下一步通過對肺血減少型先心病家系進行基因突變篩查非常有必要。與此同時，我們更認識到先心病的發生是由多基因突變所致。
本試驗應用實時熒光定量PCR技術是在PCR反應的體系里加入熒光基團，利用熒光信號積累實現實時監測整個PCR的進程，再通過繪制標準曲線對未知的模板進行定量的分析方法。以往研究Nkx2.5基因表達的主要方法是免疫組化，使用實時熒光定量與熒光原位雜交的較少。熒光原位雜交方法雖然準確性較高，但試驗步驟復雜并繁瑣[16]。實時熒光定量PCR與前兩種方法相比具有獨特的優勢，該方法可以對每一個樣本的目的基因表達水平進行精確測量，并且具有較寬的動力學范圍和高通量處理樣本的能力，能有效實現操作的自動化，并能有效避免試驗過程中的交叉污染，具有較高的靈敏度，目前己得到廣泛的應用[17]。實時熒光定量PCR包括絕對定量和相對定量兩種。相對定量方法較為簡單、經濟，也比較可靠和準確。基于反應體系中存在各種干擾因素，包括不同批次的試劑、樣本的純度不夠等因素影響，均可通過持家基因，如GAPDH作為內參進行校正并去除，從而得到可靠結果。Moskowitz等[18]設計了一種比較閾值的方法來測定目的基因的相對表，可以根據數學推導而得出目的基因的相對表達量=2-ΔΔCt。該公式中，C代表cycle即循環數，t代表閾值，Ct值的定義是指在PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環次數。以內參照計算目的基因的相對表達量，即每個樣本的ΔCt=Ct目的基因-Ct內參照，ΔΔCt=ΔCt試驗組-ΔCt對照組。因此，2-ΔΔCt表示的是試驗組Nkx2.5的表達相對于對照組Nkx2.5的變化倍數，這種方法比絕對定量更簡便省時[19-21]。本試驗統計學結果也表明，這一方法所獲得的結果是相當可靠的。本試驗根據目的基因Nkx2.5和內參照GAPDH的Ct值，計算Nkx2.5基因表達的變化倍數，由此可準確獲得Nkx2.5基因在肺血減少型先天性心臟病組及對照組心肌組織表達的強弱，其結果可直接計算得出。
本試驗研究的結果顯示，肺血減少型先天性心臟病Nkx2.5基因的表達水平相對于對照組的Nkx2.5表達水平呈下降趨勢，說明Nkx2.5基因存在轉錄水平的異常，并對編碼蛋白質產物的功能產生影響，導致肺血減少型先天性心臟病的可能發生。因此，Nkx2.5基因的轉錄水平異常可能成為該基因參與先天性心臟病形成的潛在發病機制，分析其轉錄水平異常的原因可能有：第一，Nkx2.5基因的調控區域，其堿基序列發生了改變，出現堿基的缺失、點突變等異常，進而引起轉錄水平發生異常，以致蛋白質的合成發生改變，最終引發轉錄水平發生異常。因此，下一步研究可針對該基因的調控區域進行突變篩查，進一步探討Nkx2.5基因表達下降的可能原因。第二，Nkx2.5基因調控區以外的其他轉錄因子可能存在異常，從而影響Nkx2.5基因的調控區，導致基因調控區功能的失調，影響其表達水平的下降。第三，Nkx2.5基因的啟動子區域可能存在異常的甲基化，Nkx2.5基因的3-UTR的micro RNA異常等也可造成Nkx2.5基因表達下調。通過以上原因的分析將有助于理解Nkx2.5基因表達下調的機制。此外，試驗組中的法洛四聯癥與其他肺血減少型先天性心臟病間比較其Nkx2.5表達水平無明顯差異，但不能排除是樣本量較少引起的誤差。因此，需加大樣本量進一步探討肺血減少型先天性心臟病的發病機制。
近年來，先天性心臟病（先心病）中Nkx2.5基因（同源盒轉錄因子）突變不斷地被發現，通過對新發現的Nkx2.5基因突變進行功能上的研究，有助于了解該基因在心臟中的功能。繼續尋找新的Nkx2.5基因突變成為一種趨勢[1-2]。目前，調控右心室流出道梗阻的基因及相關分子機制成為研究熱點[3-5]。本研究通過收集肺血減少型先天性心臟病患者及室間隔缺損患者的外周靜脈血及心肌組織標本，從分子水平探討Nkx2.5基因突變及其表達水平的變化與肺血減少型先天性心臟病的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2012年5月至2014年5月蚌埠醫學院第一附屬醫院與安徽省立兒童醫院心臟外科收治的56例肺血減少型先天性心臟病患者為試驗組，同期收治的63例室間隔缺損患者為對照組。兩組患者均經心臟超聲檢查和手術確診，無先天性心臟病家族史；智力發育均正常，面容無明顯異常；通過心臟超聲及胸部X線片等常規檢查均未發現合并其他主要臟器的畸形；手術均在體外循環輔助下進行。
試驗組選擇肺血減少型先天性心臟病患者，共56例，男30例、女26例，年齡6個月～14 （5.82±4.23）歲；體重5.8～33.2 （18.45±0.69）kg。其中法洛四聯癥42例（合并卵圓孔未閉9例、房間隔缺損6例），右心室雙出口（法四型）5例，房間隔缺損合并肺動脈狹窄5例，單心室合并肺動脈狹窄2例，三尖瓣閉鎖+大動脈轉位+肺動脈狹窄2例。患者術前均有不同程度的紫紺、缺氧、活動耐量降低等表現，體格檢查均有不同程度的肺動脈第二聽診音（P2）降低，輔助檢查：動脈血氧分壓（PaO2）（52.9±8.7）mm Hg、動脈血氧飽和度（SaO2）85.6%±6.4%、紅細胞壓積（HCT）49.8%±4.3%、血紅蛋白（Hb）（16.6±1.4）g/d l。
對照組63例，男36例、女27例，年齡6個月～14 （6.93±4.56）歲，體重6.3～35.5 （19.87±0.63）kg。對照組入組患者需滿足條件：（1）室間隔缺損小于1 cm；（2）胸部X線片示心胸比率≤0.6；（3）動脈血氧飽和度≥95%。
兩組患者性別、年齡、體重等一般資料差異均無統計學意義（P > 0.05）。本研究經蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會討論批準，并征得患者監護人知情同意，簽署知情同意書。
1.2 主要儀器和試劑
主要儀器和試劑包括紫外分光光度儀（Eppendorf公司）、PCR擴增儀（東勝國際貿易有限公司）、水平電泳槽和電泳儀（北京六一儀器廠）、實時定量PCR儀（Step One Plus，ABI公司）、全自動凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）、SYBR? Premix Ex Taq、M-MLV反轉錄酶（Fermentas公司）、DNA Ladder Marker、DNA提取試劑盒和非離心柱試劑盒（北京TIANGEN公司）、GAPDH內參照（上海生工生物工程股份有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 標本留取
兩組均在體外循環下行心臟直視手術，采集其術前外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸二鈉抗凝，-20℃冰箱凍存備用。取術中右心室流出道肥厚心肌組織0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，將心肌組織置于Trizol液中，組織勻漿機打碎組織，-80℃凍存備用。
1.3.2 基因組DNA的制備
取周圍靜脈血2 ml, 按非離心柱試劑盒步驟提取基因組DNA。
1.3.3 PCR反應及產物鑒定
根據已知該基因兩個外顯子的序列, 按引物設計原則進行引物設計。將2個外顯子（exon）分為4部分, 4對引物（表 1）。引物由上海生工生物公司合成。25μl PCR反應體系（即PCR的混合物）中，基因組DNA 1μl，10×Buffer（10倍稀釋的磷酸緩沖液）215μl，215 mol/L，dNTP2μl，10μmol/L上、下游引物各1μl，DNA聚合酶1125 U。PCR反應條件：預變性95℃3 min，變性95℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃45 s，終延伸72℃8 min，共40個循環。產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外光下鑒定產物。
表1
NKX2.5基因外顯子的名稱、序列及片段大小（bp）
1.3.4 PCR-DNA測序技術
應用美國ABI 310遺傳分析儀進行毛細管電泳，按照操作程序將PCR產物放入分析儀中自動進行測序。測序進行完畢后，利用GENERUNR及VNTI軟件程序予以分析，并把測序結果與美國國立醫學圖書館中的國家生物技術信息中心（NCBI）和PubMed文獻數據庫、單核苷酸多態性（SNP）數據庫已發表的Nkx2.5基因變異位點進行比較，并觀察每一個測序的峰型。如果出現測序結果的雜帶較多者，予以分析原因，并排除影響的因素后予以第2次正向測序；如果出現測序結果異常者，需行反向測序及重復PCR擴增測序證實。
1.4 實時熒光定量PCR
應用Trizol試劑按常規方法提取心肌組織總RNA，轉錄成cDNA，以GAPDH為內參照，引物釆用Primers軟件設計（目的基因的標準序列來自美國國立衛生研究院維護的基因序列數據庫：NICIGenBank? ），交由上海生工生物工程股份有限公司合成（表 2），引物合成后用純超水溶解，充分震蕩5～10 min，放置-20℃保存備用。
表2
各引物的名稱、序列及產物長度（bp）
針對所要測量的目的基因Nkx2.5與內參照基因GAPDH，選擇cDNA模板進行反應，PCR反應條件如上，引物見表 2，將PCR產物進行10倍的梯度稀釋：設定PCR產物濃度為1，分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4和10-5梯度濃度，每個副孔重復3次，梯度稀釋的DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置Real-time PCR反應體系，反應體系為20μl，Real-time PCR反應條件：預變性95℃30 s，PCR反應95℃5 s，收集熒光55℃30 s，40個循環。溶解曲線分析：95℃15 s，55℃60 s，95℃15 s。
反應結束后，首先應觀察并確認PCR產物的溶解曲線，觀察其有無非特異性的擴增以及引物二聚體現象的發生；然后由擴增曲線所在對數增長期確定其熒光閾值(Ct值），釆用2-ΔΔCt法計算其結果(相對定量)。以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）為內參照計算Nkx2.5基因的相對表達量，即ΔCt=CtNkx2.5-CtGAPDH為每個樣本的ΔCt，而ΔΔCt=ΔCt試驗組-ΔCt對照組。
1.5 統計學分析
應用SPSS17.0統計軟件進行數據處理。對數據進行正態分布檢驗和方差齊性檢驗，正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。同一組內處理前后的資料采用配對t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 PCR擴增結果
所有PCR產物均經瓊脂糖凝膠電泳驗證。全自動凝膠成像系統紫外光源下觀察，與DNA marker比照，所得PCR擴增產物的長度與設計的片段長度相吻合，其特異性亦較理想。M為分子量標記（圖 1）。
圖1
Nkx2.5外顯子的PCR產物電泳圖
注：M: 100bp DNA ladder maker；1：Nkx2.5-Exon 1-1；251bp；2：Nkx2.5-Exon 2-1，469bp；3：Nkx2.5-Exon 1-2，285bp；4：Nkx2.5-Exon 2-2，442bp
2.2 測序結果
所有試驗組和對照組進行Nkx2.5基因序列測定后，均未發現Nkx2.5基因突變。
2.3 總RNA提取電泳圖檢測
提取的心肌組織RNA使用紫外分光光度儀測定濃度及光密度（optical density，OD）值，所提取的RNAOD260/280值在1.8～2.0之間，表明提取的總RNA純度較高可用于后續試驗。0.5X: 0.045 mol/LTBE液配制瓊脂糖凝膠電泳，可見兩條清晰條帶，為28S和18S，隱約可見的條帶為5S，表明所提取的RNA很完整，沒有被降解和污染（圖 2）。
圖2
心肌組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖
2.4 實時熒光定量PCR檢測結果
擴增曲線（圖 3）示所有樣品均已進入擴增平臺期，說明反應條件設定準確。本試驗溶解曲線（圖 4）示均形成單峰，說明擴增產物為一種物質，具有特異性，無引物二聚體等非特異擴增出現。根據擴增曲線得到GAPDH的Ct值，用2-ΔΔCt進行相對定量的前提是目的基因的擴增效率與內參的擴增效率基本一致，在cDNA對數濃度與ΔCt關系曲線中，斜率為-0.0488，接近于0，說明內參GAPDH與Nkx2.5基因的擴增效率基本一致；Nkx2.5與GAPDH對應的相關系數分別為0.9987和0.9992，斜率分別為-3.3728和-3.4017，擴增效率分別為97%和98%，表明Nkx2.5與GAPDH兩者間有良好的線性關系。
圖3
內參照GAPDH和Nkx2.5基因的擴增曲線
圖4
內參照GAPDH和Nkx2.5基因的溶解曲線
注：a為內參照GAPDH溶解曲線，b為Nkx2.5基因的溶解曲線，c為內參照GAPDH和Nkx2.5基因的溶解曲線
試驗組Nkx2.5基因的相對表達量為2.9277±1.2865，對照組Nkx2.5基因的相對表達量為6.3647±1.5302，試驗組中Nkx2.5基因mRNA表達明顯低于對照組，差異有統計學意義（t=-6.83，P < 0.01，圖 5）。
圖5
試驗組與對照組的Nkx2.5基因mRNA的相對表達水平
注：A為對照組B:為試驗組
3 討論
Nkx2.5基因作為心臟前體細胞分化最早期的標志之一[6]，其外顯子與側翼序列間存在許多啟動子、增強子、抑制因子及自動調節因子，在基因調控中具有重要功能。一方面，這些元件在不同時空上調控Nkx2.5基因本身的表達，使其在心臟與其它器官的發育過程中起著復雜的調節作用；另一方面，Nkx2.5基因作為其上游的主基因，參與調控下游許多基因的表達，其下游基因包括BMP、ANF、Nmyc、MLC2V、Msx2、MEF2C及dHAND。當NKX2-5基因發生異常時，該類基因在心臟中的表達將會有所改變[7-9]。Nkx2.5基因主要是通過目的基因中的相應順式作用元件與同源結構域結合，作為轉錄因子并啟動下游基因的轉錄。Nkx2.5基因不僅引起BMP10的表達量明顯增加進而導致心室肌的增厚，并且可引起許多其他的基因表達異常[10]。另外，Nkx2.5基因的編碼蛋白具有4個高度保守的結構域，即N端的tin結構域、由60個氨基酸構成的同源盒結構域、下游的NK2-SD及含有17個氨基酸組成的GI-RAW保守序列的C-末端結構域[11-13]。其中，目的基因相應的啟動子可以與Nkx2.5基因的編碼蛋白結合，對這種蛋白質-DNA的結合作用具有意義的氨基酸包括Asn、Arg、Glu、Gln、Lys等，這些氨基酸的變化將引起蛋白質-DNA間親和力的改變，并且影響基因的轉錄，產生相關的蛋白缺陷，最終導致畸形[14-15]。
本試驗應用PCR-DNA直接測序的方法對56例肺血減少型先心病患者和63例室間隔缺損患者術前外周靜脈血進行Nkx2.5基因的全部外顯子進行檢測。結果在所有肺血減少型先心病和單純型室間隔缺損患者中沒有發現關于Nkx2.5基因外顯子發生突變，可能原因包括：第一，該基因的體細胞突變率發生低，在肺血減少型先心病中基因突變率低，可能是收集的樣本例數太少。因為樣本數量的限制而沒有發現突變，因此有待于進一步加大樣本量進行研究。第二，Nkx2.5基因的編碼區發生突變，可能不是引起肺血減少型先心病體細胞突變的致病基因，該基因其他位置堿基的改變，如編碼區外基因的突變、基因表達的異常，也可能引起心臟畸形的發生。因此，通過檢測Nkx2.5基因的表達情況具有非常重要的實際意義。第三，通過對外周血中體細胞突變進行篩查，雖然沒有發現異常突變，但不排除有生殖細胞突變的可能，所以下一步通過對肺血減少型先心病家系進行基因突變篩查非常有必要。與此同時，我們更認識到先心病的發生是由多基因突變所致。
本試驗應用實時熒光定量PCR技術是在PCR反應的體系里加入熒光基團，利用熒光信號積累實現實時監測整個PCR的進程，再通過繪制標準曲線對未知的模板進行定量的分析方法。以往研究Nkx2.5基因表達的主要方法是免疫組化，使用實時熒光定量與熒光原位雜交的較少。熒光原位雜交方法雖然準確性較高，但試驗步驟復雜并繁瑣[16]。實時熒光定量PCR與前兩種方法相比具有獨特的優勢，該方法可以對每一個樣本的目的基因表達水平進行精確測量，并且具有較寬的動力學范圍和高通量處理樣本的能力，能有效實現操作的自動化，并能有效避免試驗過程中的交叉污染，具有較高的靈敏度，目前己得到廣泛的應用[17]。實時熒光定量PCR包括絕對定量和相對定量兩種。相對定量方法較為簡單、經濟，也比較可靠和準確。基于反應體系中存在各種干擾因素，包括不同批次的試劑、樣本的純度不夠等因素影響，均可通過持家基因，如GAPDH作為內參進行校正并去除，從而得到可靠結果。Moskowitz等[18]設計了一種比較閾值的方法來測定目的基因的相對表，可以根據數學推導而得出目的基因的相對表達量=2-ΔΔCt。該公式中，C代表cycle即循環數，t代表閾值，Ct值的定義是指在PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環次數。以內參照計算目的基因的相對表達量，即每個樣本的ΔCt=Ct目的基因-Ct內參照，ΔΔCt=ΔCt試驗組-ΔCt對照組。因此，2-ΔΔCt表示的是試驗組Nkx2.5的表達相對于對照組Nkx2.5的變化倍數，這種方法比絕對定量更簡便省時[19-21]。本試驗統計學結果也表明，這一方法所獲得的結果是相當可靠的。本試驗根據目的基因Nkx2.5和內參照GAPDH的Ct值，計算Nkx2.5基因表達的變化倍數，由此可準確獲得Nkx2.5基因在肺血減少型先天性心臟病組及對照組心肌組織表達的強弱，其結果可直接計算得出。
本試驗研究的結果顯示，肺血減少型先天性心臟病Nkx2.5基因的表達水平相對于對照組的Nkx2.5表達水平呈下降趨勢，說明Nkx2.5基因存在轉錄水平的異常，并對編碼蛋白質產物的功能產生影響，導致肺血減少型先天性心臟病的可能發生。因此，Nkx2.5基因的轉錄水平異常可能成為該基因參與先天性心臟病形成的潛在發病機制，分析其轉錄水平異常的原因可能有：第一，Nkx2.5基因的調控區域，其堿基序列發生了改變，出現堿基的缺失、點突變等異常，進而引起轉錄水平發生異常，以致蛋白質的合成發生改變，最終引發轉錄水平發生異常。因此，下一步研究可針對該基因的調控區域進行突變篩查，進一步探討Nkx2.5基因表達下降的可能原因。第二，Nkx2.5基因調控區以外的其他轉錄因子可能存在異常，從而影響Nkx2.5基因的調控區，導致基因調控區功能的失調，影響其表達水平的下降。第三，Nkx2.5基因的啟動子區域可能存在異常的甲基化，Nkx2.5基因的3-UTR的micro RNA異常等也可造成Nkx2.5基因表達下調。通過以上原因的分析將有助于理解Nkx2.5基因表達下調的機制。此外，試驗組中的法洛四聯癥與其他肺血減少型先天性心臟病間比較其Nkx2.5表達水平無明顯差異，但不能排除是樣本量較少引起的誤差。因此，需加大樣本量進一步探討肺血減少型先天性心臟病的發病機制。
