引用本文： 唐彪, 段群歡. COPS3在肝癌中的表達. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(12): 1507-1509. doi: 10.7507/1007-9424.20150391 復制
原發性肝癌（以下簡稱“肝癌”）是消化系統常見的惡性腫瘤之一，其臨床療效欠佳。我國是肝癌高發國家，死亡率逐年升高[1]。目前人們對肝癌的發生機制仍不清楚，但普遍認為癌基因的激活和抑癌基因的失活是肝癌發生的基礎。構成型光形態建成同源亞基3（COPS3）是構成型光形態建成9（COP9）信號復合體的第3個亞基，是一種蛋白激酶。近年來研究[2]證實，COPS3可分解p53蛋白，從而導致其下游基因的改變，引起基因組突變。COPS3蛋白在骨肉瘤組織中高表達，其在骨肉瘤中以原癌基因的形式發揮效應[3]。但是，COPS3在原發性肝癌發生和發展中的作用機制尚不清楚。本研究旨在研究COPS3在肝癌組織中的表達情況，為肝癌分子靶向治療尋找新的分子靶標提供研究基礎。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2010年1月至2014年6月期間于我院接受手術治療的肝癌患者的臨床病理資料保存完整的肝癌組織標本共30例，其中男16例，女14例；年齡35～73歲，（59.5±13.1）歲。所有病例術前均未行放療、化療。30例肝癌患者的外周血及肝癌組織呈HBsAg（+）。同時選取30例乙型肝炎肝硬變患者肝臟組織（肝臟穿刺組織和手術存檔標本）及30例正常組織（肝移植病理檢查存檔標本）作為對照，所有的標本均經患者及其家屬同意，并簽署知情同意書。上述所有組織均由兩位資深的病理科醫師閱片明確診斷。
1.2 免疫組織化學方法檢測各組織中COPS3蛋白的表達
1.2.1 方法
取新鮮組織標本，10%甲醛浸泡12 h后，用15% EDTA浸泡，其間每周更換EDTA溶液1次，3周左右時間，用大頭針檢查標本的脫鈣情況，然后進行封蠟。連續切片，厚度4μm，貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片，60℃烘烤2 h。采用免疫組織化學SP法，兔抗人COPS3單克隆抗體購自Abcam公司，工作濃度1：100，SP免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，實驗步驟按試劑盒說明書進行。
1.2.2 結果判定
細胞內出現棕色或褐色顆粒者為染色陽性依據。根據Shimizu等[4]的標準，隨機選取10個高倍視野，計算每1 000個細胞中染色細胞的數量。陽性細胞百分率=陽性細胞數/總細胞數×100%。根據染色細胞百分率計分標準：0分為≤10%，1分為11%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為> 75%；染色強度的計分標準：無著色計為0分，淺棕色計為1分，棕色計為2分，深棕色計為3分。根據染色陽性細胞百分率的分值和染色強度的分值之和判斷其結果：0分為（-），2～3分為（+），4分為（++），5～6分為（+++）。評分之和2分以上均為陽性。
1.3 -RT-PCR檢測各組織中COPS3 mRNA的表達
將組織剪碎后提取總RNA，按照試劑盒說明書步驟進行RT-PCR檢測，利用GeneSnap軟件對成像進行分析。計算各組條帶的灰度值，以GAPDH內參的表達作為對照。
1.4 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件包進行數據分析，計數資料采用百分率（%）表示，3組間比較采用F檢驗，2組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 COPS3蛋白在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的表達情況
免疫組織化學染色結果見圖 1。COPS3蛋白可表達于細胞核或細胞漿中，呈均質性或顆粒狀著色，淡黃至棕褐色，在正常肝臟組織中幾乎不表達，肝硬變組織中弱表達，肝癌組織中強表達。COPS3蛋白表達陽性率在肝癌組織中明顯高于肝硬變組織（χ2=4.979，P=0.026）和正常肝組織（χ2=5.654，P=0.017），在肝硬變組織中與正常肝臟組織的比較差異無統計學意義（χ2=1.375，P=0.241）。在肝癌組織中，COPS3在細胞核中的表達陽性率明顯高于其在細胞漿中的表達陽性率（χ2=6.674，P=0.009）。見表 1。
圖1
COPS3蛋白在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的表達（SP×200）。1A：正常肝組織；1B：肝硬變組織；1C：肝癌組織
表1
COPS3蛋白在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的陽性表達情況〔例（%）〕
2.2 COPS3 mRNA在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的表達情況
根據GeneSnap軟件分析提示，肝癌組織中COPS3 mRNA的轉錄水平明顯高于肝硬變和正常肝組織，差異有統計學意義（P < 0 05），見圖 2。
圖2
COPS3 mRNA在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的表達情況。2A：定性結果。M：DNA marker；1：肝硬變；2：肝癌；3：正常肝組織。2B：半定量結果。與肝硬變組織和正常肝臟組織比較，* P < 0.05
3 討論
肝癌是世界上惡性程度較高且治療效果較差的惡性腫瘤之一。目前我國肝癌死亡率已處于惡性腫瘤死亡率的第2位并呈逐年上升趨勢[1-2]，肝癌被認為是多基因、多步驟相互協同、相互作用的細胞癌變過程。COPS3是COP9信號復合體（CSN）的第3個亞基[5]。COP9是光介導發育過程中的重要調節因子[6]，在泛素-26S蛋白酶體介導的蛋白降解過程中發揮重要作用[7]。對Jun、p53、p27基因也具有調節作用[8-9]。目前研究證實，COPS3在骨肉瘤組織中高表達。Henriksen等[10]研究結果提示，23例骨肉瘤細胞系中10例存在COPS3擴增或過表達，3種出現泛素蛋白連接酶鼠雙微粒體（MDM2）高表達，因此他認為COPS3、MDM與骨肉瘤的發生和發展有密切聯系，但Yan等[11]研究發現，COPS3的擴增和p53的突變可同時存在于惡性骨肉瘤中，而且兩者同時存在，在一定時間內可帶來更嚴重的結果，同時導致染色體高度不穩性，這一研究結果對骨肉瘤的發生、發展以及早期診斷和治療具有一定的潛在意義。2011年Yan等[9]報道了COPS3基因表達與腫瘤轉移的關系，對65例骨肉瘤的樣本（37例無轉移，28例轉移）進行COPS3免疫組織化學染色，57.1%（16/28）有轉移的患者標本和18.9%（7/37）無轉移患者標本表現為COPS3染色強陽性；COPS3惰性轉移骨肉瘤細胞株（SAOS-2）和高轉移骨肉瘤細胞株（HOS）之間的表達比較，HOS細胞株表現出較強的COPS3表達；siRNA抑制COPS3功能，能減少HOS細胞株的增殖和遷移，COPS3 MAPK信號通路下調，后者在骨肉瘤轉移中起重要作用的一個基因，結果表明，過度表達的COPS3基因可能在骨肉瘤細胞轉移中起重要作用。這些研究結果COPS3對骨肉瘤的發生、發展以及早期診斷和治療具有潛在的意義。
目前對于COPS3與肝癌組織關系的文獻報道極少。在本研究中我們利用免疫組織化學SP方法觀察了COPS3在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的表達，希望為下一步研究提供依據。結果表明，COPS3蛋白表達陽性率在肝癌組織中明顯高于肝硬變組織及正常肝組織，差異具有統計學意義；COPS3蛋白在肝癌組織中主要表達于細胞核，而在正常肝組織中主要在細胞漿。肝癌組織中COPS3 mRNA的轉錄水平明顯高于肝硬變、正常肝組織，差異具有統計學意義（P < 0.05），結果提示，COPS3在肝癌組織中表達水平和定位均發生改變，初步提示其可能參與了肝癌的發生和發展過程。上述研究結果提示，COPS3的表達和細胞內定位在正常肝組織、肝硬變和肝癌組織中存在不同，COPS3蛋白在肝癌中可能受到某些因子的刺激，發生基因轉錄和翻譯水平的異常，導致表達水平上調和細胞分布改變。
綜上所述，COPS3在肝癌組織中高表達，可能參與肝癌的發生、發展過程，本實驗的結果也為深入研究COPS3基因在肝癌中作用提供了實驗基礎。
原發性肝癌（以下簡稱“肝癌”）是消化系統常見的惡性腫瘤之一，其臨床療效欠佳。我國是肝癌高發國家，死亡率逐年升高[1]。目前人們對肝癌的發生機制仍不清楚，但普遍認為癌基因的激活和抑癌基因的失活是肝癌發生的基礎。構成型光形態建成同源亞基3（COPS3）是構成型光形態建成9（COP9）信號復合體的第3個亞基，是一種蛋白激酶。近年來研究[2]證實，COPS3可分解p53蛋白，從而導致其下游基因的改變，引起基因組突變。COPS3蛋白在骨肉瘤組織中高表達，其在骨肉瘤中以原癌基因的形式發揮效應[3]。但是，COPS3在原發性肝癌發生和發展中的作用機制尚不清楚。本研究旨在研究COPS3在肝癌組織中的表達情況，為肝癌分子靶向治療尋找新的分子靶標提供研究基礎。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2010年1月至2014年6月期間于我院接受手術治療的肝癌患者的臨床病理資料保存完整的肝癌組織標本共30例，其中男16例，女14例；年齡35～73歲，（59.5±13.1）歲。所有病例術前均未行放療、化療。30例肝癌患者的外周血及肝癌組織呈HBsAg（+）。同時選取30例乙型肝炎肝硬變患者肝臟組織（肝臟穿刺組織和手術存檔標本）及30例正常組織（肝移植病理檢查存檔標本）作為對照，所有的標本均經患者及其家屬同意，并簽署知情同意書。上述所有組織均由兩位資深的病理科醫師閱片明確診斷。
1.2 免疫組織化學方法檢測各組織中COPS3蛋白的表達
1.2.1 方法
取新鮮組織標本，10%甲醛浸泡12 h后，用15% EDTA浸泡，其間每周更換EDTA溶液1次，3周左右時間，用大頭針檢查標本的脫鈣情況，然后進行封蠟。連續切片，厚度4μm，貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片，60℃烘烤2 h。采用免疫組織化學SP法，兔抗人COPS3單克隆抗體購自Abcam公司，工作濃度1：100，SP免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，實驗步驟按試劑盒說明書進行。
1.2.2 結果判定
細胞內出現棕色或褐色顆粒者為染色陽性依據。根據Shimizu等[4]的標準，隨機選取10個高倍視野，計算每1 000個細胞中染色細胞的數量。陽性細胞百分率=陽性細胞數/總細胞數×100%。根據染色細胞百分率計分標準：0分為≤10%，1分為11%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為> 75%；染色強度的計分標準：無著色計為0分，淺棕色計為1分，棕色計為2分，深棕色計為3分。根據染色陽性細胞百分率的分值和染色強度的分值之和判斷其結果：0分為（-），2～3分為（+），4分為（++），5～6分為（+++）。評分之和2分以上均為陽性。
1.3 -RT-PCR檢測各組織中COPS3 mRNA的表達
將組織剪碎后提取總RNA，按照試劑盒說明書步驟進行RT-PCR檢測，利用GeneSnap軟件對成像進行分析。計算各組條帶的灰度值，以GAPDH內參的表達作為對照。
1.4 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件包進行數據分析，計數資料采用百分率（%）表示，3組間比較采用F檢驗，2組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 COPS3蛋白在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的表達情況
免疫組織化學染色結果見圖 1。COPS3蛋白可表達于細胞核或細胞漿中，呈均質性或顆粒狀著色，淡黃至棕褐色，在正常肝臟組織中幾乎不表達，肝硬變組織中弱表達，肝癌組織中強表達。COPS3蛋白表達陽性率在肝癌組織中明顯高于肝硬變組織（χ2=4.979，P=0.026）和正常肝組織（χ2=5.654，P=0.017），在肝硬變組織中與正常肝臟組織的比較差異無統計學意義（χ2=1.375，P=0.241）。在肝癌組織中，COPS3在細胞核中的表達陽性率明顯高于其在細胞漿中的表達陽性率（χ2=6.674，P=0.009）。見表 1。
圖1
COPS3蛋白在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的表達（SP×200）。1A：正常肝組織；1B：肝硬變組織；1C：肝癌組織
表1
COPS3蛋白在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的陽性表達情況〔例（%）〕
2.2 COPS3 mRNA在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的表達情況
根據GeneSnap軟件分析提示，肝癌組織中COPS3 mRNA的轉錄水平明顯高于肝硬變和正常肝組織，差異有統計學意義（P < 0 05），見圖 2。
圖2
COPS3 mRNA在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的表達情況。2A：定性結果。M：DNA marker；1：肝硬變；2：肝癌；3：正常肝組織。2B：半定量結果。與肝硬變組織和正常肝臟組織比較，* P < 0.05
3 討論
肝癌是世界上惡性程度較高且治療效果較差的惡性腫瘤之一。目前我國肝癌死亡率已處于惡性腫瘤死亡率的第2位并呈逐年上升趨勢[1-2]，肝癌被認為是多基因、多步驟相互協同、相互作用的細胞癌變過程。COPS3是COP9信號復合體（CSN）的第3個亞基[5]。COP9是光介導發育過程中的重要調節因子[6]，在泛素-26S蛋白酶體介導的蛋白降解過程中發揮重要作用[7]。對Jun、p53、p27基因也具有調節作用[8-9]。目前研究證實，COPS3在骨肉瘤組織中高表達。Henriksen等[10]研究結果提示，23例骨肉瘤細胞系中10例存在COPS3擴增或過表達，3種出現泛素蛋白連接酶鼠雙微粒體（MDM2）高表達，因此他認為COPS3、MDM與骨肉瘤的發生和發展有密切聯系，但Yan等[11]研究發現，COPS3的擴增和p53的突變可同時存在于惡性骨肉瘤中，而且兩者同時存在，在一定時間內可帶來更嚴重的結果，同時導致染色體高度不穩性，這一研究結果對骨肉瘤的發生、發展以及早期診斷和治療具有一定的潛在意義。2011年Yan等[9]報道了COPS3基因表達與腫瘤轉移的關系，對65例骨肉瘤的樣本（37例無轉移，28例轉移）進行COPS3免疫組織化學染色，57.1%（16/28）有轉移的患者標本和18.9%（7/37）無轉移患者標本表現為COPS3染色強陽性；COPS3惰性轉移骨肉瘤細胞株（SAOS-2）和高轉移骨肉瘤細胞株（HOS）之間的表達比較，HOS細胞株表現出較強的COPS3表達；siRNA抑制COPS3功能，能減少HOS細胞株的增殖和遷移，COPS3 MAPK信號通路下調，后者在骨肉瘤轉移中起重要作用的一個基因，結果表明，過度表達的COPS3基因可能在骨肉瘤細胞轉移中起重要作用。這些研究結果COPS3對骨肉瘤的發生、發展以及早期診斷和治療具有潛在的意義。
目前對于COPS3與肝癌組織關系的文獻報道極少。在本研究中我們利用免疫組織化學SP方法觀察了COPS3在肝癌、肝硬變及正常肝組織中的表達，希望為下一步研究提供依據。結果表明，COPS3蛋白表達陽性率在肝癌組織中明顯高于肝硬變組織及正常肝組織，差異具有統計學意義；COPS3蛋白在肝癌組織中主要表達于細胞核，而在正常肝組織中主要在細胞漿。肝癌組織中COPS3 mRNA的轉錄水平明顯高于肝硬變、正常肝組織，差異具有統計學意義（P < 0.05），結果提示，COPS3在肝癌組織中表達水平和定位均發生改變，初步提示其可能參與了肝癌的發生和發展過程。上述研究結果提示，COPS3的表達和細胞內定位在正常肝組織、肝硬變和肝癌組織中存在不同，COPS3蛋白在肝癌中可能受到某些因子的刺激，發生基因轉錄和翻譯水平的異常，導致表達水平上調和細胞分布改變。
綜上所述，COPS3在肝癌組織中高表達，可能參與肝癌的發生、發展過程，本實驗的結果也為深入研究COPS3基因在肝癌中作用提供了實驗基礎。
