引用本文： 林炳煌, 黃榮金, 何清安, 李艷芳, 王進勝, 楊藝宏, 洪朝輝. ALCAM/CD166在乳腺癌組織中表達及意義以及其與Bcl-2、Ki-67的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(12): 1466-1470. doi: 10.7507/1007-9424.20150383 復制
乳腺癌是一種嚴重危害女性身心健康的最常見惡性腫瘤，在西方國家或地區其發病率和死亡率均居女性惡性腫瘤之首；乳腺癌亦是我國女性發病率最高的惡性腫瘤，近幾年更是逐年遞增且呈年輕化趨勢[1]。乳腺癌的療效及預后與癌細胞的增殖和凋亡失衡、侵襲和轉移潛能密切相關，這些惡性生物學行為是一個極其復雜的多步驟過程，其中涉及多種基因的異常表達，通過直接或間接激活相應的細胞內信號轉導途徑來實現，因而，研究尋求乳腺癌早期檢測指標及更有效的診治手段極為重要。活化白細胞黏附分子（ALCAM/CD166）是細胞表面的免疫球蛋白超家族成員，通過同嗜性和異嗜性黏附作用介導細胞與細胞的相互作用，參與機體多種病理生理過程[2-4]。ALCAM已被證實在包括乳腺癌等多種體內外腫瘤細胞中表達增加，參與腫瘤的發生、發展，且與腫瘤侵襲、轉移、復發及預后密切相關，其可作為乳腺癌的診斷及預后評價指標之一，深化ALCAM作用機制的研究，有助于啟發人們進一步探討腫瘤干預治療的新策略。因而本研究擬應用免疫組織化學方法檢測乳腺浸潤性導管癌組織及其癌旁非瘤上皮組織（鏡下無癌）中ALCAM的表達情況及其與患者臨床病理參數的關系，同時分析其與凋亡抑制蛋白Bcl-2及增殖細胞核抗原Ki-67的相關性，探討ALCAM蛋白表達在乳腺癌發生、發展中的作用，為更加有效的臨床治療手段、預后判斷等提供參考。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取泉州醫學高等專科學校附屬人民醫院病理科2008～2011年期間存檔的手術切除的普通型乳腺浸潤性導管癌標本96例。全部病例均經常規病理切片，由兩位高年資病理醫生確診并復查無誤。所有患者術前未接受放療、化療及內分泌治療。患者均為女性，年齡29～83歲，中位年齡56歲。< 60歲51例，≥60歲45例；腫瘤直徑≤2 cm有37例，2～5 cm有34例，≥5 cm有25例；有腋窩淋巴結轉移者45例，無腋窩淋巴結轉移者51例；乳腺浸潤性導管癌的組織病理學分級采用Bloom-Richardson系統Nottingham修正方案[5]，分為G1（3～5分）12例，G2（6～7分）46例，G3（8～9分）38例；乳腺癌臨床分期采用1988年國際抗癌聯盟（UICC）提出的TNM分期法Ⅰ+Ⅱ期63例，Ⅲ+Ⅳ期33例。另外選取遠離腫瘤部位（>5 cm）的非瘤乳腺上皮組織（鏡下無癌）即癌旁正常乳腺組織標本30例作為對照組。
1.2 免疫組織化學染色檢測ALCAM/CD166和Bcl-2、Ki-67蛋白的表達
所有新鮮標本均經10%甲醛固定，48 h內取材，石蠟包埋，以4μm厚度連續切片。采用免疫組織化學ElivisionTM Plus法檢測乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM和Bcl-2、Ki-67蛋白的表達。鼠抗人ALCAM（克隆號：MOG/07），購自美國Abcam公司；Bcl-2單克隆抗體（克隆號：100/D5）及Ki-67單克隆抗體（克隆號：MBI.1），購自美國NeoMarkers公司；DAB酶底物顯色劑及ElivisionTM Plus檢測試劑盒為福州邁新公司產品。主要操作步驟如下：石蠟切片，烘烤，脫蠟，梯度乙醇水化。然后置100 mmol/L過氧化氫10 min，消除組織內源性過氧化酶，枸櫞酸鹽溶液高壓修復7 min后，冷卻，滴加一抗（ALCAM為濃縮型、工作濃度1：100，Bcl-2及Ki-67為即用型），4℃過夜。室溫下PBS沖洗5 min×3，滴加二抗ElivisionTM Plus檢測試劑A、B，室溫下各孵育20 min、30 min后DAB顯色，蘇木精復染，透明，中性樹膠封片觀察。所有標本均用已知陽性片做陽性對照，同時用PBS代替一抗做陰性對照。
1.3 結果判斷標準
由兩位高年資病理醫師獨立觀察，用帶有10×10計數網格的顯微鏡，200倍鏡下計數任意數格中陽性和陰性細胞數，乘以相應倍數得到網格里總細胞數后計算陽性細胞百分比。隨機采集10個具有代表性視野進行重復計數，取平均數值。陽性細胞必須具備：細胞結構清晰，陽性染色定位準確，著色明顯高于背景，具體評分標準如下。
1.3.1 ALCAM
免疫組織化學染色以組織細胞膜或細胞質中出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性顯色[6]。依著色深淺記分，無染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分，再按陽性細胞百分比記分，無陽性細胞為0分、1%～20%為1分、21%～50%為2分、51%～80%為3分、≥81%為4分，最后根據二者免疫反應評分（immunoreactive score，IRS）乘積劃分等級，0分為陰性，1～6分為弱陽性，7～12分為強陽性。
1.3.2 Bcl-2
免疫組織化學染色陽性反應以細胞膜和細胞質出現棕黃色顆粒沉著，依著色深淺記分，無染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分，再按陽性細胞百分比記分，無陽性細胞為0分、1%～10%為1分、11%～50%為2分、≥51%為3分，最后根據二者IRS乘積劃分等級，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），2～4分為中陽性（++），≥4分為強陽性（+++）。
1.3.3 Ki-67
免疫組織化學染色結果以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞，依陽性細胞百分比判定陽性強度，陽性細胞百分比< 20%為陰性（-），21～25%為弱陽性（+），26%～50%為中陽性（++），≥51%為強陽性（+++）。
1.4 統計學方法
應用IBM SPSS Statistics 20統計軟件包進行統計學分析。ALCAM/CD166、Bcl-2及Ki-67表達陽性率比較采用χ2檢驗。組間比較采用有序等級資料的非參數秩和檢驗。兩指標間采用有序分組資料的Kendall等級相關分析。檢驗水準α=0.05，P值為雙側效能檢驗。
2 結果
2.1 免疫組織化學檢測結果
2.1.1 ALCAM蛋白表達
ALCAM蛋白表達陽性定位于細胞膜或細胞漿中，呈棕黃色顆粒狀染色，因為其僅細胞漿染色無法精確界定，故本研究未區分ALCAM細胞膜和細胞漿染色。在癌旁正常乳腺組織中ALCAM蛋白表達呈陰性或弱陽性（IRS中位數為2分，圖 1），而乳腺浸潤性導管癌組織中可見細胞膜或細胞漿陽性染色，細胞間質未見陽性染色（IRS中位數為6分，圖 2）。ALCAM蛋白在乳腺浸潤性導管癌上皮組織中的表達陽性率為79.2%（76/96），明顯高于其在癌旁正常乳腺組織中的表達陽性率〔10.0%（3/30）〕，差異有統計學意義（χ2=46.755，P < 0.01）。
圖1
乳腺浸潤性導管癌癌旁正常乳腺組織中ALCAM/CD166蛋白的表達（ElivisionTM Plus×100）??圖 2乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM/CD166蛋白的表達（ElivisionTM Plus×200）。2A：無腋窩淋巴結轉移乳腺癌組織；2B：有腋窩淋巴結轉移乳腺癌組織
2.1.2 Bcl-2和Ki-67蛋白表達
Bcl-2蛋白陽性表達定位于細胞漿或細胞膜，乳腺浸潤性導管癌組織中Bcl-2蛋白表達陽性率為74.0%（71/96），明顯高于其在癌旁正常乳腺組織中的表達〔20.0%（6/30）〕，差異有統計學意義（χ2=28.002，P < 0.01）。Ki-67蛋白陽性表達位于乳腺上皮組織細胞核中，乳腺浸潤性導管癌組織中Ki-67蛋白表達陽性率為75.0%（72/96），明顯高于其在癌旁正常乳腺組織中的表達〔26.7%（8/30）〕，差異有統計學意義（χ2=23.036，P < 0.01）。
2.2 乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM/CD166蛋白表達與患者臨床病理參數的關系
乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM蛋白表達與患者年齡、腫瘤直徑、病理學分級及TNM分期無關（P>0.05）。ALCAM蛋白陽性表達在有腋窩淋巴結轉移組明顯高于無腋窩淋巴結轉移組，經統計學檢驗結果差異有統計學意義（P=0.013）。見表 1。
表1
乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM/CD166蛋白表達與患者臨床病理參數的關系（例）
2.3 乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM/CD166蛋白表達與Bcl-2、Ki-67蛋白表達的關系
經有序等級資料的Kendall等級相關分析，ALCAM及Bcl-2在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達呈正相關性（rs=0.307，P=0.001），ALCAM與Ki-67在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達強度沒有相關性（rs=0.064，P=0.475），見表 2。
表2
乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM/CD166蛋白表達與Bcl-2、Ki-67的相關性分析結果（例）
3 討論
ALCAM是一種細胞表面免疫球蛋白基因超家族成員，廣泛表達于人體各個組織器官，包括胸腺上皮細胞、活化的白細胞和上皮細胞、骨髓細胞、成纖維細胞、胰腺腺泡和胰島細胞、神經元、肝和骨髓，通過同嗜性和異嗜性黏附作用介導細胞與細胞的相互作用[7-9]。多項研究[10-13]結果表明，ALCAM異常表達存在于多種人類惡性腫瘤如黑色素瘤、胃癌、結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱浸潤性尿路上皮癌、食道鱗狀細胞癌等，參與腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移。但不同實驗室在研究不同腫瘤類型時，即使同一腫瘤采用不同方法在不同基因表達水平的檢測，所得到的結論并不一致。
特別地，ALCAM在乳腺癌細胞增殖與侵襲轉移中的作用，目前仍存在較大爭議。Burkhardt等[14]發現，乳腺癌組織中ALCAM高表達，并認為其在乳腺癌中有細胞膜染色和細胞漿染色兩種表達模式，細胞膜ALCAM高表達與乳腺癌預后呈正相關，細胞漿ALCAM高表達與早期腫瘤侵襲高度相關，細胞漿高表達患者無病生存期明顯縮短。Hein等[6]通過體外細胞株試驗與免疫組織化學方法證實上述結果。Piao等[15]研究發現，伴有淋巴結轉移的乳腺癌組織中ALCAM表達明顯升高，而且細胞質ALCAM高表達提示早期腫瘤復發及生存期縮短。王斌斌等[16]的研究亦顯示，乳腺癌組織中ALCAM蛋白表達水平較正常乳腺組織高，其高表達可以作為一種不良預后的預測指標。然而，King等[17]發現，ALCAM在惡性程度高的腫瘤細胞的表達水平低于惡性程度較低的腫瘤細胞，死于乳腺癌的患者體內細胞中ALCAM基因的表達水平比腫瘤未轉移或局部復發的患者低很多，表明ALCAM的表達水平低預示著腫瘤的惡性程度較高并很可能發生轉移；Jezierska等[18]證實ALCAM表達與乳腺癌廣泛侵襲、淋巴結轉移和遠處轉移呈負相關；其后，Davies等[19]通過檢測血清ALCAM及體外細胞株試驗與免疫組織化學方法都發現低水平表達ALCAM的乳腺癌患者更容易發生骨骼轉移。
本研究結果發現，乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM蛋白表達陽性率明顯高于其癌旁正常乳腺組織（P < 0.05），表明ALCAM的高表達是乳腺癌發生過程中重要的促進因素。本研究結果同時顯示，細胞質、細胞膜ALCAM蛋白表達在有腋窩淋巴結轉移者中明顯高于無腋窩淋巴結轉移者（P < 0.05），與Piao等[15]的研究結果一致，提示ALCAM的表達增加、異常活化對乳腺癌的侵襲、轉移具有促進作用。ALCAM可能通過以下分子機制調控惡性腫瘤浸潤和轉移行為：①Lunter等[20]研究發現，廣泛的細胞間接觸、細胞與基質間的相互作用以及野生型ALCAM是前體基質金屬蛋白酶（MMP）-2向其活化形式MMP-2轉變的必要條件，而侵襲性腫瘤生長往往伴隨著MMP的激活和蛋白水解作用，表明ALCAM可能通過上述機制增強腫瘤侵襲行為。②Burkhardt等[14]提出，α-連環蛋白喪失導致ALCAM胞漿定位而使腫瘤更具侵襲性，表明腫瘤細胞膜上的ALCAM表達降低可能使腫瘤細胞黏附能力減弱，促進腫瘤遠處轉移，而ALCAM胞漿異位定位增強腫瘤的侵襲能力，從而促進腫瘤的發生、發展。
Jezierska等[21]發現，ALCAM過表達的乳腺癌細胞系中亦過表達Bcl-2，而Bcl-2是抑制乳腺癌細胞凋亡的主要抑制因子，表明高表達ALCAM乳腺癌細胞系通過上調Bcl-2水平參與乳腺癌細胞增殖，他們同時應用siRNA技術敲除ALCAM基因后，Bcl-2蛋白表達明顯降低，從而誘導乳腺癌細胞發生程序性細胞死亡，進一步論證了上述觀點。本研究中分析了乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM蛋白表達水平與Bcl-2關系，結果顯示，ALCAM蛋白表達水平增強，Bcl-2表達水平亦明顯增強，二者呈正相關，結果提示，ALCAM可能通過調控Bcl-2表達，抑制乳腺癌細胞凋亡，導致癌細胞異常增殖促進乳腺癌的發生、發展。但我們在乳腺浸潤性導管癌組織中未發現ALCAM表達與Ki-67存在相關性。Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的標志性核抗原，于G1期開始表達、G2～M期表達最強、M期后遞減、G0期不表達，其可作為反映乳腺癌細胞增殖水平的有效指標。也許深入挖掘ALCAM如何與相應配體作用及其抗凋亡過程可闡明其分子機制。
總之，本研究對乳腺浸潤性導管癌標本的研究結果顯示，ALCAM是乳腺癌凋亡抑制及侵襲轉移能力的一個正調控因子，故其有望成為腫瘤分子診斷標志物及臨床預后判斷指標之一。
乳腺癌是一種嚴重危害女性身心健康的最常見惡性腫瘤，在西方國家或地區其發病率和死亡率均居女性惡性腫瘤之首；乳腺癌亦是我國女性發病率最高的惡性腫瘤，近幾年更是逐年遞增且呈年輕化趨勢[1]。乳腺癌的療效及預后與癌細胞的增殖和凋亡失衡、侵襲和轉移潛能密切相關，這些惡性生物學行為是一個極其復雜的多步驟過程，其中涉及多種基因的異常表達，通過直接或間接激活相應的細胞內信號轉導途徑來實現，因而，研究尋求乳腺癌早期檢測指標及更有效的診治手段極為重要。活化白細胞黏附分子（ALCAM/CD166）是細胞表面的免疫球蛋白超家族成員，通過同嗜性和異嗜性黏附作用介導細胞與細胞的相互作用，參與機體多種病理生理過程[2-4]。ALCAM已被證實在包括乳腺癌等多種體內外腫瘤細胞中表達增加，參與腫瘤的發生、發展，且與腫瘤侵襲、轉移、復發及預后密切相關，其可作為乳腺癌的診斷及預后評價指標之一，深化ALCAM作用機制的研究，有助于啟發人們進一步探討腫瘤干預治療的新策略。因而本研究擬應用免疫組織化學方法檢測乳腺浸潤性導管癌組織及其癌旁非瘤上皮組織（鏡下無癌）中ALCAM的表達情況及其與患者臨床病理參數的關系，同時分析其與凋亡抑制蛋白Bcl-2及增殖細胞核抗原Ki-67的相關性，探討ALCAM蛋白表達在乳腺癌發生、發展中的作用，為更加有效的臨床治療手段、預后判斷等提供參考。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取泉州醫學高等專科學校附屬人民醫院病理科2008～2011年期間存檔的手術切除的普通型乳腺浸潤性導管癌標本96例。全部病例均經常規病理切片，由兩位高年資病理醫生確診并復查無誤。所有患者術前未接受放療、化療及內分泌治療。患者均為女性，年齡29～83歲，中位年齡56歲。< 60歲51例，≥60歲45例；腫瘤直徑≤2 cm有37例，2～5 cm有34例，≥5 cm有25例；有腋窩淋巴結轉移者45例，無腋窩淋巴結轉移者51例；乳腺浸潤性導管癌的組織病理學分級采用Bloom-Richardson系統Nottingham修正方案[5]，分為G1（3～5分）12例，G2（6～7分）46例，G3（8～9分）38例；乳腺癌臨床分期采用1988年國際抗癌聯盟（UICC）提出的TNM分期法Ⅰ+Ⅱ期63例，Ⅲ+Ⅳ期33例。另外選取遠離腫瘤部位（>5 cm）的非瘤乳腺上皮組織（鏡下無癌）即癌旁正常乳腺組織標本30例作為對照組。
1.2 免疫組織化學染色檢測ALCAM/CD166和Bcl-2、Ki-67蛋白的表達
所有新鮮標本均經10%甲醛固定，48 h內取材，石蠟包埋，以4μm厚度連續切片。采用免疫組織化學ElivisionTM Plus法檢測乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM和Bcl-2、Ki-67蛋白的表達。鼠抗人ALCAM（克隆號：MOG/07），購自美國Abcam公司；Bcl-2單克隆抗體（克隆號：100/D5）及Ki-67單克隆抗體（克隆號：MBI.1），購自美國NeoMarkers公司；DAB酶底物顯色劑及ElivisionTM Plus檢測試劑盒為福州邁新公司產品。主要操作步驟如下：石蠟切片，烘烤，脫蠟，梯度乙醇水化。然后置100 mmol/L過氧化氫10 min，消除組織內源性過氧化酶，枸櫞酸鹽溶液高壓修復7 min后，冷卻，滴加一抗（ALCAM為濃縮型、工作濃度1：100，Bcl-2及Ki-67為即用型），4℃過夜。室溫下PBS沖洗5 min×3，滴加二抗ElivisionTM Plus檢測試劑A、B，室溫下各孵育20 min、30 min后DAB顯色，蘇木精復染，透明，中性樹膠封片觀察。所有標本均用已知陽性片做陽性對照，同時用PBS代替一抗做陰性對照。
1.3 結果判斷標準
由兩位高年資病理醫師獨立觀察，用帶有10×10計數網格的顯微鏡，200倍鏡下計數任意數格中陽性和陰性細胞數，乘以相應倍數得到網格里總細胞數后計算陽性細胞百分比。隨機采集10個具有代表性視野進行重復計數，取平均數值。陽性細胞必須具備：細胞結構清晰，陽性染色定位準確，著色明顯高于背景，具體評分標準如下。
1.3.1 ALCAM
免疫組織化學染色以組織細胞膜或細胞質中出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性顯色[6]。依著色深淺記分，無染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分，再按陽性細胞百分比記分，無陽性細胞為0分、1%～20%為1分、21%～50%為2分、51%～80%為3分、≥81%為4分，最后根據二者免疫反應評分（immunoreactive score，IRS）乘積劃分等級，0分為陰性，1～6分為弱陽性，7～12分為強陽性。
1.3.2 Bcl-2
免疫組織化學染色陽性反應以細胞膜和細胞質出現棕黃色顆粒沉著，依著色深淺記分，無染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分，再按陽性細胞百分比記分，無陽性細胞為0分、1%～10%為1分、11%～50%為2分、≥51%為3分，最后根據二者IRS乘積劃分等級，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），2～4分為中陽性（++），≥4分為強陽性（+++）。
1.3.3 Ki-67
免疫組織化學染色結果以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞，依陽性細胞百分比判定陽性強度，陽性細胞百分比< 20%為陰性（-），21～25%為弱陽性（+），26%～50%為中陽性（++），≥51%為強陽性（+++）。
1.4 統計學方法
應用IBM SPSS Statistics 20統計軟件包進行統計學分析。ALCAM/CD166、Bcl-2及Ki-67表達陽性率比較采用χ2檢驗。組間比較采用有序等級資料的非參數秩和檢驗。兩指標間采用有序分組資料的Kendall等級相關分析。檢驗水準α=0.05，P值為雙側效能檢驗。
2 結果
2.1 免疫組織化學檢測結果
2.1.1 ALCAM蛋白表達
ALCAM蛋白表達陽性定位于細胞膜或細胞漿中，呈棕黃色顆粒狀染色，因為其僅細胞漿染色無法精確界定，故本研究未區分ALCAM細胞膜和細胞漿染色。在癌旁正常乳腺組織中ALCAM蛋白表達呈陰性或弱陽性（IRS中位數為2分，圖 1），而乳腺浸潤性導管癌組織中可見細胞膜或細胞漿陽性染色，細胞間質未見陽性染色（IRS中位數為6分，圖 2）。ALCAM蛋白在乳腺浸潤性導管癌上皮組織中的表達陽性率為79.2%（76/96），明顯高于其在癌旁正常乳腺組織中的表達陽性率〔10.0%（3/30）〕，差異有統計學意義（χ2=46.755，P < 0.01）。
圖1
乳腺浸潤性導管癌癌旁正常乳腺組織中ALCAM/CD166蛋白的表達（ElivisionTM Plus×100）??圖 2乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM/CD166蛋白的表達（ElivisionTM Plus×200）。2A：無腋窩淋巴結轉移乳腺癌組織；2B：有腋窩淋巴結轉移乳腺癌組織
2.1.2 Bcl-2和Ki-67蛋白表達
Bcl-2蛋白陽性表達定位于細胞漿或細胞膜，乳腺浸潤性導管癌組織中Bcl-2蛋白表達陽性率為74.0%（71/96），明顯高于其在癌旁正常乳腺組織中的表達〔20.0%（6/30）〕，差異有統計學意義（χ2=28.002，P < 0.01）。Ki-67蛋白陽性表達位于乳腺上皮組織細胞核中，乳腺浸潤性導管癌組織中Ki-67蛋白表達陽性率為75.0%（72/96），明顯高于其在癌旁正常乳腺組織中的表達〔26.7%（8/30）〕，差異有統計學意義（χ2=23.036，P < 0.01）。
2.2 乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM/CD166蛋白表達與患者臨床病理參數的關系
乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM蛋白表達與患者年齡、腫瘤直徑、病理學分級及TNM分期無關（P>0.05）。ALCAM蛋白陽性表達在有腋窩淋巴結轉移組明顯高于無腋窩淋巴結轉移組，經統計學檢驗結果差異有統計學意義（P=0.013）。見表 1。
表1
乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM/CD166蛋白表達與患者臨床病理參數的關系（例）
2.3 乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM/CD166蛋白表達與Bcl-2、Ki-67蛋白表達的關系
經有序等級資料的Kendall等級相關分析，ALCAM及Bcl-2在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達呈正相關性（rs=0.307，P=0.001），ALCAM與Ki-67在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達強度沒有相關性（rs=0.064，P=0.475），見表 2。
表2
乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM/CD166蛋白表達與Bcl-2、Ki-67的相關性分析結果（例）
3 討論
ALCAM是一種細胞表面免疫球蛋白基因超家族成員，廣泛表達于人體各個組織器官，包括胸腺上皮細胞、活化的白細胞和上皮細胞、骨髓細胞、成纖維細胞、胰腺腺泡和胰島細胞、神經元、肝和骨髓，通過同嗜性和異嗜性黏附作用介導細胞與細胞的相互作用[7-9]。多項研究[10-13]結果表明，ALCAM異常表達存在于多種人類惡性腫瘤如黑色素瘤、胃癌、結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱浸潤性尿路上皮癌、食道鱗狀細胞癌等，參與腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移。但不同實驗室在研究不同腫瘤類型時，即使同一腫瘤采用不同方法在不同基因表達水平的檢測，所得到的結論并不一致。
特別地，ALCAM在乳腺癌細胞增殖與侵襲轉移中的作用，目前仍存在較大爭議。Burkhardt等[14]發現，乳腺癌組織中ALCAM高表達，并認為其在乳腺癌中有細胞膜染色和細胞漿染色兩種表達模式，細胞膜ALCAM高表達與乳腺癌預后呈正相關，細胞漿ALCAM高表達與早期腫瘤侵襲高度相關，細胞漿高表達患者無病生存期明顯縮短。Hein等[6]通過體外細胞株試驗與免疫組織化學方法證實上述結果。Piao等[15]研究發現，伴有淋巴結轉移的乳腺癌組織中ALCAM表達明顯升高，而且細胞質ALCAM高表達提示早期腫瘤復發及生存期縮短。王斌斌等[16]的研究亦顯示，乳腺癌組織中ALCAM蛋白表達水平較正常乳腺組織高，其高表達可以作為一種不良預后的預測指標。然而，King等[17]發現，ALCAM在惡性程度高的腫瘤細胞的表達水平低于惡性程度較低的腫瘤細胞，死于乳腺癌的患者體內細胞中ALCAM基因的表達水平比腫瘤未轉移或局部復發的患者低很多，表明ALCAM的表達水平低預示著腫瘤的惡性程度較高并很可能發生轉移；Jezierska等[18]證實ALCAM表達與乳腺癌廣泛侵襲、淋巴結轉移和遠處轉移呈負相關；其后，Davies等[19]通過檢測血清ALCAM及體外細胞株試驗與免疫組織化學方法都發現低水平表達ALCAM的乳腺癌患者更容易發生骨骼轉移。
本研究結果發現，乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM蛋白表達陽性率明顯高于其癌旁正常乳腺組織（P < 0.05），表明ALCAM的高表達是乳腺癌發生過程中重要的促進因素。本研究結果同時顯示，細胞質、細胞膜ALCAM蛋白表達在有腋窩淋巴結轉移者中明顯高于無腋窩淋巴結轉移者（P < 0.05），與Piao等[15]的研究結果一致，提示ALCAM的表達增加、異常活化對乳腺癌的侵襲、轉移具有促進作用。ALCAM可能通過以下分子機制調控惡性腫瘤浸潤和轉移行為：①Lunter等[20]研究發現，廣泛的細胞間接觸、細胞與基質間的相互作用以及野生型ALCAM是前體基質金屬蛋白酶（MMP）-2向其活化形式MMP-2轉變的必要條件，而侵襲性腫瘤生長往往伴隨著MMP的激活和蛋白水解作用，表明ALCAM可能通過上述機制增強腫瘤侵襲行為。②Burkhardt等[14]提出，α-連環蛋白喪失導致ALCAM胞漿定位而使腫瘤更具侵襲性，表明腫瘤細胞膜上的ALCAM表達降低可能使腫瘤細胞黏附能力減弱，促進腫瘤遠處轉移，而ALCAM胞漿異位定位增強腫瘤的侵襲能力，從而促進腫瘤的發生、發展。
Jezierska等[21]發現，ALCAM過表達的乳腺癌細胞系中亦過表達Bcl-2，而Bcl-2是抑制乳腺癌細胞凋亡的主要抑制因子，表明高表達ALCAM乳腺癌細胞系通過上調Bcl-2水平參與乳腺癌細胞增殖，他們同時應用siRNA技術敲除ALCAM基因后，Bcl-2蛋白表達明顯降低，從而誘導乳腺癌細胞發生程序性細胞死亡，進一步論證了上述觀點。本研究中分析了乳腺浸潤性導管癌組織中ALCAM蛋白表達水平與Bcl-2關系，結果顯示，ALCAM蛋白表達水平增強，Bcl-2表達水平亦明顯增強，二者呈正相關，結果提示，ALCAM可能通過調控Bcl-2表達，抑制乳腺癌細胞凋亡，導致癌細胞異常增殖促進乳腺癌的發生、發展。但我們在乳腺浸潤性導管癌組織中未發現ALCAM表達與Ki-67存在相關性。Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的標志性核抗原，于G1期開始表達、G2～M期表達最強、M期后遞減、G0期不表達，其可作為反映乳腺癌細胞增殖水平的有效指標。也許深入挖掘ALCAM如何與相應配體作用及其抗凋亡過程可闡明其分子機制。
總之，本研究對乳腺浸潤性導管癌標本的研究結果顯示，ALCAM是乳腺癌凋亡抑制及侵襲轉移能力的一個正調控因子，故其有望成為腫瘤分子診斷標志物及臨床預后判斷指標之一。
