引用本文： 黃濤, 爾啟東, 鄧鋒, 畢旭東. 高滲鹽水預處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷血清一氧化氮和內皮素-1表達水平的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(11): 1323-1326. doi: 10.7507/1007-9424.20150346 復制
肝臟缺血再灌注損傷是一個有多種細胞參與、多種介質共同作用、氧自由基形成、鈣離子超載、微循環紊亂、能量耗竭等多因素形成的復雜病理生理過程。因此，對肝臟缺血再灌注損傷作用機制及防治的研究具有很重要的臨床意義。近年來研究[1-4]表明，高滲鹽水對缺血再灌注導致的炎癥損傷有顯著的保護作用。本研究將高滲鹽水應用于大鼠肝臟缺血再灌注損傷中，以探討缺血再灌注損傷時血清一氧化氮（nitric oxide，NO）和內皮素-1（endothelin-1，ET-1）的水平變化及其對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物分組及動物模型制作
1.1.1 實驗動物及分組
選取清潔健康雄性SD大鼠45只，體質量250～280 g。按完全隨機化法隨機分成3組：假手術組、肝臟缺血再灌注組、高滲鹽水預處理組，每組15只。
1.1.2 動物模型制作
所有大鼠術前禁食12 h，自由飲水。Pringle’s法復制肝臟缺血模型：游離大鼠肝臟，分離出門靜脈、肝動脈和膽總管，使用無創微血管夾予以阻斷，在缺血30 min后松開血管夾形成再灌注。假手術組：單純麻醉和分離肝臟血流，但不鉗夾肝臟血管；肝臟缺血再灌注組：在阻斷肝臟血流前30 min經大鼠陰莖背靜脈緩慢注射無菌生理鹽水（10 mL/kg）；高滲鹽水預處理組：同法緩慢注射7.5%氯化鈉注射液（10 mL/kg）。
1.2 檢測指標及方法
各組分別于缺血再灌注1、6、24 h后（每個時點5只大鼠）自腹主動脈取血4 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min（r=10 cm）離心30 min，提取血清標本于-20℃保存待測NO和ET-1水平。
1.2.1 血清NO水平的測定
采用硝酸還原酶法，按試劑盒說明書進行。NO試劑盒購于南京建成生物工程研究所。
1.2.2 血清ET-1水平的測定
采用放射免疫法，按試劑盒說明書進行。ET-1試劑盒購于中國人民解放軍總醫院科技開發中心放免研究所。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0統計軟件進行統計分析，所有數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 血清NO和ET-1水平
肝臟缺血30 min再灌注1、6、24 h后缺血再灌注組和高滲鹽水預處理組血清NO水平均明顯低于假手術組，差異具有統計學意義（P < 0.01），而血清ET-1水平則均明顯高于假手術組，差異亦具有統計學意義（P < 0.01）；高滲鹽水預處理組血清NO水平明顯高于缺血再灌注組，差異具有統計學意義（P < 0.01），而血清ET-1水平則明顯低于缺血再灌注組，差異具有統計學意義（P < 0.01）。血清NO和ET-1水平在1、6、24 h之間的變化以6 h最為明顯。見表 1。
表1
各組大鼠血清不同時間NO和ET-1水平變化（2.2 缺血再灌注組缺血再灌注6 h時NO與ET-1水平的相關性分析結果
缺血再灌注組缺血再灌注6 h時NO與ET-1水平的相關性分析結果顯示，大鼠血清NO與ET-1水平量呈負相關（r=-0.970，P < 0.01），即血清NO含量增加時，ET-1含量是減少的；而血清NO含量減少時，ET-1含量是增加的，見圖 1。
圖1
缺血再灌注組缺血再灌注6 h時NO與ET-1水平的相關性分析結
3 討論
肝臟缺血再灌注損傷涉及多而復雜的病理生理過程，在臨床治療過程中，如原位肝移植、復雜肝切除手術、休克復蘇等會不可避免地導致肝臟缺血再灌注損傷。有研究[5-7]表明，肝臟缺血再灌注后3～6 h，各種炎癥因子顯著升高，對肝臟損害較大，出現明顯的肝臟功能損害。
臨床上，減輕肝臟缺血再灌注損傷的方法有很多，如缺血預處理[8-9]、缺血后處理[10-11]、間斷低氧預適應[12-13]、藥物預處理[2, 14]等。目前以藥物預處理的研究較為突出，探討合適的藥物預處理防治肝臟缺血再灌注損傷是目前研究的熱點。現有許多研究已經證實高滲鹽水對缺血再灌注損傷具有一定程度的保護作用。缺血再灌注可以明顯誘導心肌組織的炎癥反應[15]，而高滲鹽水預處理通過抑制炎癥因子的釋放和調節氧化應激對大鼠心肌缺血再灌注損傷產生保護作用[3]；高滲鹽水還可以復蘇缺血小腸，有效地保護小腸免疫屏障，抑制全身炎性反應綜合征[16]，為臨床嚴重感染、大出血、大面積燒傷后腸道功能障礙患者液體復蘇提供治療方法；高滲鹽水還可以通過抑制小膠質細胞釋放腫瘤壞死因子-α，減輕缺血再灌注損傷所致腦水腫[17]，降低顱高壓的同時還能增加腦灌注壓、改善腦組織灌注，從而避免腦損傷[18]；也有研究[19]證實，小劑量的高滲鹽水可以間接改善失血性休克鼠網狀內皮細胞吞噬功能并降低感染的易感性。本研究通過將高滲鹽水預處理應用于大鼠肝臟缺血再灌注損傷中，以探討肝臟缺血再灌注損傷中NO和ET-1的水平變化及其相關性分析。
ET-1和NO為血管內皮細胞分泌的兩種效應相反的血管活性物質，在生理情況下，兩者之間可通過負反饋調節保持動態平衡[20]，NO可以舒張血管，抑制ET-1收縮血管作用，相對維持動態平衡，從而保證了血管正常的舒縮功能，在應激狀態下，它們的平衡失調可以影響疾病的發生和發展。
ET是由血管內皮細胞產生的一種21氨基酸的多肽，具有縮血管和擴血管作用，分別由相應的ETA受體和ETB受體介導，在肝臟內主要分布于肝星狀細胞和肝細胞，從而調節肝臟血流量的變化[21]。其中，ET-1是目前已知體內作用最強和作用時間最持久的縮血管物質[22]。由此推測，缺血再灌注損傷時，肝細胞受到嚴重的損害，產生大量的ET-1受ETA受體介導，引起肝血管強烈收縮，使肝臟血流循環阻力增加，加重肝瘀血，肝缺血/缺氧狀況更為嚴重，細胞內鈣離子超載、氧自由基、各種炎性因子等大量釋放[8, 15, 22]，引起肝臟缺血再灌注損傷。另外，ET-1還可激活中性粒細胞，增加內皮細胞黏附分子的表達，促進中性粒細胞與內皮細胞的黏附等[4]，從而減少了炎性細胞對肝細胞的損傷作用而起到保護肝臟的作用。
NO是一種具有多種生物活性的小分子物質，是一氧化氮合酶（NOS）的終產物。肝臟是具有多種復雜功能的重要器官，肝臟細胞可生成NO[23]。NO能與肝細胞內細胞色素酶系統結合改變活性來影響肝臟的藥物代謝和生物轉化。Nishida等[24]認為，當內毒素引起肝臟微循環變化時，NO具有穩定微循環、增強肝臟抗缺血和抗氧化的能力。在內毒素水平較低的情況下，肝臟非實質細胞產生大量NO對維持肝臟微循環起重要作用。
本研究中，高滲鹽水預處理后缺血再灌注大鼠血清NO水平明顯升高（P < 0.01），而ET-1水平則明顯降低，差異具有統計學意義（P < 0.01），結果提示，高滲鹽水對大鼠肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用，其作用機理可能是通過某種途徑增加血清NO水平、降低ET-1水平達到的。因為改善ET-1/NO兩者比例失衡是防治肝臟缺血再灌注損傷的一個重要保護機制。ET-1與NO兩者之間處于一種動態平衡關系，這種平衡關系一旦被打破，必然引發某一連串病理生理過程，產生對肝臟的影響。本研究中分析了大鼠肝臟缺血再灌注損傷中NO與ET水平之間的相關性，結果發現，NO和ET-1水平呈負相關（r=-0.970，P < 0.01），即ET濃度明顯增高，而NO濃度明顯降低。ET濃度增高一是因為缺氧及胞質內鈣濃度升高促使內皮細胞產生ET，二是因為在再灌注期內由門靜脈進入肝臟內的腸源性內毒素也可刺激內皮細胞產生ET [24]。病理狀態下的肝臟清除ET-1的能力降低，肝臟微血管收縮，引起肝臟微循環功能障礙[25]，導致肝臟細胞損傷。肝臟缺血再灌注之后，肝竇內皮細胞功能紊亂，ET-1與NO平衡被破壞，合成和釋放NO減少，使其拮抗氧自由基和ET-1作用削弱，ET-1作用增強，進一步加劇內皮細胞損傷[26]，促使肝臟缺血再灌注損傷發生或加重。
綜上所述，高滲鹽水預處理在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用是值得肯定的，本研究初步研究結果顯示，它改變了缺血再灌注損傷后血清NO和ET-1的水平，其作用機理有可能是通過某種途徑激發血清NO的水平、降低ET-1的水平，使兩者的動態平衡向良性方向發展而達到保護作用。總之，高滲鹽水預處理作為藥物預處理的一部分，由于其療效顯著、適應范圍廣且價廉，值得更進一步深入研究，如高滲鹽水的濃度變化對缺血再灌注損傷的影響等。
肝臟缺血再灌注損傷是一個有多種細胞參與、多種介質共同作用、氧自由基形成、鈣離子超載、微循環紊亂、能量耗竭等多因素形成的復雜病理生理過程。因此，對肝臟缺血再灌注損傷作用機制及防治的研究具有很重要的臨床意義。近年來研究[1-4]表明，高滲鹽水對缺血再灌注導致的炎癥損傷有顯著的保護作用。本研究將高滲鹽水應用于大鼠肝臟缺血再灌注損傷中，以探討缺血再灌注損傷時血清一氧化氮（nitric oxide，NO）和內皮素-1（endothelin-1，ET-1）的水平變化及其對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物分組及動物模型制作
1.1.1 實驗動物及分組
選取清潔健康雄性SD大鼠45只，體質量250～280 g。按完全隨機化法隨機分成3組：假手術組、肝臟缺血再灌注組、高滲鹽水預處理組，每組15只。
1.1.2 動物模型制作
所有大鼠術前禁食12 h，自由飲水。Pringle’s法復制肝臟缺血模型：游離大鼠肝臟，分離出門靜脈、肝動脈和膽總管，使用無創微血管夾予以阻斷，在缺血30 min后松開血管夾形成再灌注。假手術組：單純麻醉和分離肝臟血流，但不鉗夾肝臟血管；肝臟缺血再灌注組：在阻斷肝臟血流前30 min經大鼠陰莖背靜脈緩慢注射無菌生理鹽水（10 mL/kg）；高滲鹽水預處理組：同法緩慢注射7.5%氯化鈉注射液（10 mL/kg）。
1.2 檢測指標及方法
各組分別于缺血再灌注1、6、24 h后（每個時點5只大鼠）自腹主動脈取血4 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min（r=10 cm）離心30 min，提取血清標本于-20℃保存待測NO和ET-1水平。
1.2.1 血清NO水平的測定
采用硝酸還原酶法，按試劑盒說明書進行。NO試劑盒購于南京建成生物工程研究所。
1.2.2 血清ET-1水平的測定
采用放射免疫法，按試劑盒說明書進行。ET-1試劑盒購于中國人民解放軍總醫院科技開發中心放免研究所。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0統計軟件進行統計分析，所有數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 血清NO和ET-1水平
肝臟缺血30 min再灌注1、6、24 h后缺血再灌注組和高滲鹽水預處理組血清NO水平均明顯低于假手術組，差異具有統計學意義（P < 0.01），而血清ET-1水平則均明顯高于假手術組，差異亦具有統計學意義（P < 0.01）；高滲鹽水預處理組血清NO水平明顯高于缺血再灌注組，差異具有統計學意義（P < 0.01），而血清ET-1水平則明顯低于缺血再灌注組，差異具有統計學意義（P < 0.01）。血清NO和ET-1水平在1、6、24 h之間的變化以6 h最為明顯。見表 1。
表1
各組大鼠血清不同時間NO和ET-1水平變化（2.2 缺血再灌注組缺血再灌注6 h時NO與ET-1水平的相關性分析結果
缺血再灌注組缺血再灌注6 h時NO與ET-1水平的相關性分析結果顯示，大鼠血清NO與ET-1水平量呈負相關（r=-0.970，P < 0.01），即血清NO含量增加時，ET-1含量是減少的；而血清NO含量減少時，ET-1含量是增加的，見圖 1。
圖1
缺血再灌注組缺血再灌注6 h時NO與ET-1水平的相關性分析結
3 討論
肝臟缺血再灌注損傷涉及多而復雜的病理生理過程，在臨床治療過程中，如原位肝移植、復雜肝切除手術、休克復蘇等會不可避免地導致肝臟缺血再灌注損傷。有研究[5-7]表明，肝臟缺血再灌注后3～6 h，各種炎癥因子顯著升高，對肝臟損害較大，出現明顯的肝臟功能損害。
臨床上，減輕肝臟缺血再灌注損傷的方法有很多，如缺血預處理[8-9]、缺血后處理[10-11]、間斷低氧預適應[12-13]、藥物預處理[2, 14]等。目前以藥物預處理的研究較為突出，探討合適的藥物預處理防治肝臟缺血再灌注損傷是目前研究的熱點。現有許多研究已經證實高滲鹽水對缺血再灌注損傷具有一定程度的保護作用。缺血再灌注可以明顯誘導心肌組織的炎癥反應[15]，而高滲鹽水預處理通過抑制炎癥因子的釋放和調節氧化應激對大鼠心肌缺血再灌注損傷產生保護作用[3]；高滲鹽水還可以復蘇缺血小腸，有效地保護小腸免疫屏障，抑制全身炎性反應綜合征[16]，為臨床嚴重感染、大出血、大面積燒傷后腸道功能障礙患者液體復蘇提供治療方法；高滲鹽水還可以通過抑制小膠質細胞釋放腫瘤壞死因子-α，減輕缺血再灌注損傷所致腦水腫[17]，降低顱高壓的同時還能增加腦灌注壓、改善腦組織灌注，從而避免腦損傷[18]；也有研究[19]證實，小劑量的高滲鹽水可以間接改善失血性休克鼠網狀內皮細胞吞噬功能并降低感染的易感性。本研究通過將高滲鹽水預處理應用于大鼠肝臟缺血再灌注損傷中，以探討肝臟缺血再灌注損傷中NO和ET-1的水平變化及其相關性分析。
ET-1和NO為血管內皮細胞分泌的兩種效應相反的血管活性物質，在生理情況下，兩者之間可通過負反饋調節保持動態平衡[20]，NO可以舒張血管，抑制ET-1收縮血管作用，相對維持動態平衡，從而保證了血管正常的舒縮功能，在應激狀態下，它們的平衡失調可以影響疾病的發生和發展。
ET是由血管內皮細胞產生的一種21氨基酸的多肽，具有縮血管和擴血管作用，分別由相應的ETA受體和ETB受體介導，在肝臟內主要分布于肝星狀細胞和肝細胞，從而調節肝臟血流量的變化[21]。其中，ET-1是目前已知體內作用最強和作用時間最持久的縮血管物質[22]。由此推測，缺血再灌注損傷時，肝細胞受到嚴重的損害，產生大量的ET-1受ETA受體介導，引起肝血管強烈收縮，使肝臟血流循環阻力增加，加重肝瘀血，肝缺血/缺氧狀況更為嚴重，細胞內鈣離子超載、氧自由基、各種炎性因子等大量釋放[8, 15, 22]，引起肝臟缺血再灌注損傷。另外，ET-1還可激活中性粒細胞，增加內皮細胞黏附分子的表達，促進中性粒細胞與內皮細胞的黏附等[4]，從而減少了炎性細胞對肝細胞的損傷作用而起到保護肝臟的作用。
NO是一種具有多種生物活性的小分子物質，是一氧化氮合酶（NOS）的終產物。肝臟是具有多種復雜功能的重要器官，肝臟細胞可生成NO[23]。NO能與肝細胞內細胞色素酶系統結合改變活性來影響肝臟的藥物代謝和生物轉化。Nishida等[24]認為，當內毒素引起肝臟微循環變化時，NO具有穩定微循環、增強肝臟抗缺血和抗氧化的能力。在內毒素水平較低的情況下，肝臟非實質細胞產生大量NO對維持肝臟微循環起重要作用。
本研究中，高滲鹽水預處理后缺血再灌注大鼠血清NO水平明顯升高（P < 0.01），而ET-1水平則明顯降低，差異具有統計學意義（P < 0.01），結果提示，高滲鹽水對大鼠肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用，其作用機理可能是通過某種途徑增加血清NO水平、降低ET-1水平達到的。因為改善ET-1/NO兩者比例失衡是防治肝臟缺血再灌注損傷的一個重要保護機制。ET-1與NO兩者之間處于一種動態平衡關系，這種平衡關系一旦被打破，必然引發某一連串病理生理過程，產生對肝臟的影響。本研究中分析了大鼠肝臟缺血再灌注損傷中NO與ET水平之間的相關性，結果發現，NO和ET-1水平呈負相關（r=-0.970，P < 0.01），即ET濃度明顯增高，而NO濃度明顯降低。ET濃度增高一是因為缺氧及胞質內鈣濃度升高促使內皮細胞產生ET，二是因為在再灌注期內由門靜脈進入肝臟內的腸源性內毒素也可刺激內皮細胞產生ET [24]。病理狀態下的肝臟清除ET-1的能力降低，肝臟微血管收縮，引起肝臟微循環功能障礙[25]，導致肝臟細胞損傷。肝臟缺血再灌注之后，肝竇內皮細胞功能紊亂，ET-1與NO平衡被破壞，合成和釋放NO減少，使其拮抗氧自由基和ET-1作用削弱，ET-1作用增強，進一步加劇內皮細胞損傷[26]，促使肝臟缺血再灌注損傷發生或加重。
綜上所述，高滲鹽水預處理在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用是值得肯定的，本研究初步研究結果顯示，它改變了缺血再灌注損傷后血清NO和ET-1的水平，其作用機理有可能是通過某種途徑激發血清NO的水平、降低ET-1的水平，使兩者的動態平衡向良性方向發展而達到保護作用。總之，高滲鹽水預處理作為藥物預處理的一部分，由于其療效顯著、適應范圍廣且價廉，值得更進一步深入研究，如高滲鹽水的濃度變化對缺血再灌注損傷的影響等。
