引用本文： 盧思聰, 盧海明, 張其順. 卡馬西平促進大鼠肝臟術后肝臟再生長的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(11): 1319-1322. doi: 10.7507/1007-9424.20150345 復制
在實施肝葉切除術后，肝臟細胞增殖是肝臟再生的關鍵因素。肝臟細胞增殖能力如果不夠代償損失的肝臟組織，即有可能發生術后肝功能衰竭，肝功能衰竭是困擾臨床多年嚴重的肝臟術后并發癥[1]。為了克服這一難題，必須尋找提高肝臟再生能力的方法。卡馬西平為廣譜抗癲癇藥，而抗癲癇藥已被證明對神經細胞有保護及促進生長的作用[2]。近年來有學者[3]報道，卡馬西平對肝臟纖維化有一定的治療作用，而肝臟纖維化是導致肝功能衰竭的原因之一，故此推測卡馬西平可能對肝臟再生有一定的促進作用，于是我們將通過大鼠部分肝臟切除的動物模型來探討卡馬西平對肝臟再生的調控作用。
1 材料與方法
1.1 主要材料
SPF級雄性SD大鼠60只，體重200～250 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心。卡馬西平，江蘇黃河藥業股份有限公司；二甲基亞砜，天津市百世化工有限公司；Ki-67試劑盒，美國Sigma公司；大鼠肝細胞生長因子（HGF）ELISA試劑盒，R & D公司。
1.2 藥品配制
5%卡馬西平溶液配制：10 g卡馬西平研磨成粉后溶解于200 mL二甲基亞砜溶液中，振蕩混勻，避光保存。
1.3 動物模型的構建
1%戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉；仰臥位，四肢固定于操作臺，腹部備皮，碘伏消毒后，取腹正中白線進腹；按照Mitchell等[4]的方法行70%的肝臟部分切除術，切除大鼠肝中葉、左外葉，保留肝右葉和尾狀葉；術后清醒后予以正常飲水進食。
1.4 實驗動物分組
大鼠按隨機數字表法被隨機分為卡馬西平組和對照組2組，每組30只。卡馬西平組：行肝臟部分切除術前2 h給予5%卡馬西平溶液灌胃，術后每天給予5%卡馬西平溶液灌胃1次，最后1次給藥為標本采集前2 h，每次按體重250 mg/kg給藥。對照組：行肝臟部分切除術前2 h給予等量二甲基亞砜灌胃，術后每天給予等量二甲基亞砜灌胃1次，最后1次給藥為標本采集前2 h。卡馬西平用量根據之前相關文獻[3]確定。
1.5 標本采集
術前1 d、術后1、2、3、5、8 d為標本采集點，每個標本采集點為5只大鼠。在每個觀察時相，大鼠再次稱重，然后1%戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射后解剖大鼠，取下腔靜脈血5 mL，37℃水浴放置30 min后3 000 r/min（r=8.7 cm）離心3 min，提取血清，-20℃冰箱保存備檢測用。切取全部殘余肝臟，稱重后統一取右葉肝臟組織，以10%甲醛固定保存備檢。
1.6 檢測指標
1.6.1 大鼠肝臟重量/體重
在各標本收集點用電子天平稱取肝臟重量，與相應時間點稱得的大鼠體重相比，以百分數表示。
1.6.2 血清丙氨酸轉移酶（ALT）含量的測定
取備用血清常溫下復溫后送我院檢驗科用全自動生化分析儀測定。
1.6.3 血清HGF含量測定
取備用血清常溫下復溫后按相應試劑盒操作說明進行測量。
1.6.4 肝臟組織中Ki-67的檢測
取備用肝臟組織石蠟切片，按相應試劑盒操作說明進行檢測。陽性結果的判定標準：以細胞核呈現界限清楚的棕黃色為陽性。陽性結果計算按以下標準表示：每張切片在5個高倍（×400）視野中分別進行肝臟細胞計數，然后計算其平均陽性率，以百分數表示。
1.7 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析。計量數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 大鼠肝臟重量/體重比值
術前1 d及術后1 d時2組大鼠肝臟重量/體重比值比較差異無統計學意義（P > 0.05）。術后2、3、5 d時卡馬西平組中大鼠肝臟重量/體重比值明顯高于對照組（P < 0.05），到術后第8 d時2組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 1。結果提示，卡馬西平對大鼠術后肝臟再生的速度高于對照組。
表1
鼠肝臟重量/體重比值的比較（%，2.2 大鼠血清ALT水平
在各觀察點，卡馬西平組大鼠血清ALT水平與對照組比較差異均無統計學意義（P > 0.05），見表 2。結果提示，卡馬西平對肝臟功能無影響。
表2
大鼠血清ALT水平比較（U/L，2.3 大鼠血清中HGF水平
術前1 d時2組大鼠血清HGF水平比較差異無統計學意義（P > 0.05），術后第1、2、3 d時卡馬西平組血清HGF水平明顯高于對照組（P < 0.05），術后第5、8 d時2組HGF水平比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 3。
表3
大鼠血清HGF水平比較（pg/mL，2.4 大鼠肝臟組織中Ki-67的表達水平
術后2 d時卡馬西平組大鼠肝臟組織中Ki-67的表達水平明顯高于對照組（P < 0.05），其余時間點2組大鼠肝臟組織中Ki-67的表達水平比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 4。
表4
大鼠肝臟組織中Ki-67的表達水平比較（%，3 討論
大鼠行70%的肝臟部分切除是安全的，如果行大于70%的肝臟部分切除術，由于大鼠的殘肝過少而無法代償，即會誘發急性肝功能衰竭，導致死亡率顯著升高[5]。中國是世界肝癌發病率最高的國家，肝切除術是其唯一可能的根治性治療手段[6]。臨床上，嚴重肝功能衰竭發生率隨著擴大范圍切除肝臟組織的增多而顯著升高，導致術后并發癥的增多[7]，因此盡快恢復肝臟體積，使其能盡快代償肝臟功能，是降低肝臟部分切除術后并發癥發生率及死亡率的關鍵。
肝臟在行外科手術部分切除后或損傷后的再生是一個復雜的過程，主要依賴于肝臟細胞的增殖。在本研究中我們發現卡馬西平一個新的作用，對于行部分肝臟切除術的大鼠可以促進殘肝的再生，卡馬西平組大鼠術后第2、3、5 d時肝臟重量/體重比值顯著高于對照組，證實卡馬西平可以促進部分肝臟切除術后大鼠的殘肝生長；在術后第8 d時，卡馬西平組大鼠肝臟重量/體重比值與對照組比較差異無統計學意義，這可能是由于2組大鼠肝臟再生過程均已基本完成，結果提示，卡馬西平只是加快了肝臟再生的過程并不能增加肝臟再生的程度。
研究[8]表明，肝臟部分切除術后，肝臟細胞即通過免疫、激素、代謝等途徑激活多個信號通路促使肝臟細胞增殖。影響肝臟再生的因素很多，HGF是現已知促進肝臟細胞再生最重要的物質[9]。HGF是多向性多肽因子，具有多種生物學活性，在肝臟中的主要作用是肝臟細胞強有力的有絲分裂原。mTOR是調節細胞生長和血管形成的信號蛋白。肝臟部分切除術后，肝臟干細胞即分泌HGF，其通過上調肝臟內mTOR信號通路促進肝臟再生，HGF在血中的水平一般在肝臟部分切除術后24 h內達到高峰，之后逐漸降至正常水平[10]。本研究中，卡馬西平組大鼠術后第1、2、3 d時血清HGF明顯高于對照組（P < 0.05），證實卡馬西平能促進HGF的分泌，從而促進肝臟細胞的增殖。增殖細胞核抗原Ki-67是一種與細胞周期相關的蛋白質，Ki-67作為細胞增殖指數，能夠標記G和S期的細胞，增殖活性較大的細胞會強表達。因此Ki-67在國內外研究[11-12]肝臟再生的試驗中作為反映肝臟再生情況的指標被普遍運用。本研究中，術后第2 d時卡馬西平組大鼠殘肝中的Ki-67明顯高于對照組（P < 0.05），證明卡馬西平組大鼠的肝臟細胞增殖程度高于對照組。目前評價肝臟功能損害程度較好的指標是ALT，因為其只有在肝臟細胞破壞后才能在血清中高表達，且受到干擾較小[13]。在本研究中，卡馬西平組大鼠術后ALT與對照組比較差異無統計學意義，說明卡馬西平并無保護殘余肝臟細胞的作用，也無損害肝臟功能的作用。
目前很多學者在探索增強肝臟再生功能的治療方法，但很少能應用于臨床或被臨床所接受。眾所周知，一種新藥或治療方法的誕生到臨床的運用需要非常長的周期及大量的金錢[14-15]，而卡馬西平已經是被廣泛運用的臨床藥物。本研究結果表明，卡馬西平對促進肝臟再生有一定的運用，或許其能在臨床上用于肝臟部分切除術后患者，降低術后并發癥，提高生存率，且對肝臟功能無影響，當然這還需要進一步的臨床試驗。
在實施肝葉切除術后，肝臟細胞增殖是肝臟再生的關鍵因素。肝臟細胞增殖能力如果不夠代償損失的肝臟組織，即有可能發生術后肝功能衰竭，肝功能衰竭是困擾臨床多年嚴重的肝臟術后并發癥[1]。為了克服這一難題，必須尋找提高肝臟再生能力的方法。卡馬西平為廣譜抗癲癇藥，而抗癲癇藥已被證明對神經細胞有保護及促進生長的作用[2]。近年來有學者[3]報道，卡馬西平對肝臟纖維化有一定的治療作用，而肝臟纖維化是導致肝功能衰竭的原因之一，故此推測卡馬西平可能對肝臟再生有一定的促進作用，于是我們將通過大鼠部分肝臟切除的動物模型來探討卡馬西平對肝臟再生的調控作用。
1 材料與方法
1.1 主要材料
SPF級雄性SD大鼠60只，體重200～250 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心。卡馬西平，江蘇黃河藥業股份有限公司；二甲基亞砜，天津市百世化工有限公司；Ki-67試劑盒，美國Sigma公司；大鼠肝細胞生長因子（HGF）ELISA試劑盒，R & D公司。
1.2 藥品配制
5%卡馬西平溶液配制：10 g卡馬西平研磨成粉后溶解于200 mL二甲基亞砜溶液中，振蕩混勻，避光保存。
1.3 動物模型的構建
1%戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉；仰臥位，四肢固定于操作臺，腹部備皮，碘伏消毒后，取腹正中白線進腹；按照Mitchell等[4]的方法行70%的肝臟部分切除術，切除大鼠肝中葉、左外葉，保留肝右葉和尾狀葉；術后清醒后予以正常飲水進食。
1.4 實驗動物分組
大鼠按隨機數字表法被隨機分為卡馬西平組和對照組2組，每組30只。卡馬西平組：行肝臟部分切除術前2 h給予5%卡馬西平溶液灌胃，術后每天給予5%卡馬西平溶液灌胃1次，最后1次給藥為標本采集前2 h，每次按體重250 mg/kg給藥。對照組：行肝臟部分切除術前2 h給予等量二甲基亞砜灌胃，術后每天給予等量二甲基亞砜灌胃1次，最后1次給藥為標本采集前2 h。卡馬西平用量根據之前相關文獻[3]確定。
1.5 標本采集
術前1 d、術后1、2、3、5、8 d為標本采集點，每個標本采集點為5只大鼠。在每個觀察時相，大鼠再次稱重，然后1%戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射后解剖大鼠，取下腔靜脈血5 mL，37℃水浴放置30 min后3 000 r/min（r=8.7 cm）離心3 min，提取血清，-20℃冰箱保存備檢測用。切取全部殘余肝臟，稱重后統一取右葉肝臟組織，以10%甲醛固定保存備檢。
1.6 檢測指標
1.6.1 大鼠肝臟重量/體重
在各標本收集點用電子天平稱取肝臟重量，與相應時間點稱得的大鼠體重相比，以百分數表示。
1.6.2 血清丙氨酸轉移酶（ALT）含量的測定
取備用血清常溫下復溫后送我院檢驗科用全自動生化分析儀測定。
1.6.3 血清HGF含量測定
取備用血清常溫下復溫后按相應試劑盒操作說明進行測量。
1.6.4 肝臟組織中Ki-67的檢測
取備用肝臟組織石蠟切片，按相應試劑盒操作說明進行檢測。陽性結果的判定標準：以細胞核呈現界限清楚的棕黃色為陽性。陽性結果計算按以下標準表示：每張切片在5個高倍（×400）視野中分別進行肝臟細胞計數，然后計算其平均陽性率，以百分數表示。
1.7 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析。計量數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 大鼠肝臟重量/體重比值
術前1 d及術后1 d時2組大鼠肝臟重量/體重比值比較差異無統計學意義（P > 0.05）。術后2、3、5 d時卡馬西平組中大鼠肝臟重量/體重比值明顯高于對照組（P < 0.05），到術后第8 d時2組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 1。結果提示，卡馬西平對大鼠術后肝臟再生的速度高于對照組。
表1
鼠肝臟重量/體重比值的比較（%，2.2 大鼠血清ALT水平
在各觀察點，卡馬西平組大鼠血清ALT水平與對照組比較差異均無統計學意義（P > 0.05），見表 2。結果提示，卡馬西平對肝臟功能無影響。
表2
大鼠血清ALT水平比較（U/L，2.3 大鼠血清中HGF水平
術前1 d時2組大鼠血清HGF水平比較差異無統計學意義（P > 0.05），術后第1、2、3 d時卡馬西平組血清HGF水平明顯高于對照組（P < 0.05），術后第5、8 d時2組HGF水平比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 3。
表3
大鼠血清HGF水平比較（pg/mL，2.4 大鼠肝臟組織中Ki-67的表達水平
術后2 d時卡馬西平組大鼠肝臟組織中Ki-67的表達水平明顯高于對照組（P < 0.05），其余時間點2組大鼠肝臟組織中Ki-67的表達水平比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 4。
表4
大鼠肝臟組織中Ki-67的表達水平比較（%，3 討論
大鼠行70%的肝臟部分切除是安全的，如果行大于70%的肝臟部分切除術，由于大鼠的殘肝過少而無法代償，即會誘發急性肝功能衰竭，導致死亡率顯著升高[5]。中國是世界肝癌發病率最高的國家，肝切除術是其唯一可能的根治性治療手段[6]。臨床上，嚴重肝功能衰竭發生率隨著擴大范圍切除肝臟組織的增多而顯著升高，導致術后并發癥的增多[7]，因此盡快恢復肝臟體積，使其能盡快代償肝臟功能，是降低肝臟部分切除術后并發癥發生率及死亡率的關鍵。
肝臟在行外科手術部分切除后或損傷后的再生是一個復雜的過程，主要依賴于肝臟細胞的增殖。在本研究中我們發現卡馬西平一個新的作用，對于行部分肝臟切除術的大鼠可以促進殘肝的再生，卡馬西平組大鼠術后第2、3、5 d時肝臟重量/體重比值顯著高于對照組，證實卡馬西平可以促進部分肝臟切除術后大鼠的殘肝生長；在術后第8 d時，卡馬西平組大鼠肝臟重量/體重比值與對照組比較差異無統計學意義，這可能是由于2組大鼠肝臟再生過程均已基本完成，結果提示，卡馬西平只是加快了肝臟再生的過程并不能增加肝臟再生的程度。
研究[8]表明，肝臟部分切除術后，肝臟細胞即通過免疫、激素、代謝等途徑激活多個信號通路促使肝臟細胞增殖。影響肝臟再生的因素很多，HGF是現已知促進肝臟細胞再生最重要的物質[9]。HGF是多向性多肽因子，具有多種生物學活性，在肝臟中的主要作用是肝臟細胞強有力的有絲分裂原。mTOR是調節細胞生長和血管形成的信號蛋白。肝臟部分切除術后，肝臟干細胞即分泌HGF，其通過上調肝臟內mTOR信號通路促進肝臟再生，HGF在血中的水平一般在肝臟部分切除術后24 h內達到高峰，之后逐漸降至正常水平[10]。本研究中，卡馬西平組大鼠術后第1、2、3 d時血清HGF明顯高于對照組（P < 0.05），證實卡馬西平能促進HGF的分泌，從而促進肝臟細胞的增殖。增殖細胞核抗原Ki-67是一種與細胞周期相關的蛋白質，Ki-67作為細胞增殖指數，能夠標記G和S期的細胞，增殖活性較大的細胞會強表達。因此Ki-67在國內外研究[11-12]肝臟再生的試驗中作為反映肝臟再生情況的指標被普遍運用。本研究中，術后第2 d時卡馬西平組大鼠殘肝中的Ki-67明顯高于對照組（P < 0.05），證明卡馬西平組大鼠的肝臟細胞增殖程度高于對照組。目前評價肝臟功能損害程度較好的指標是ALT，因為其只有在肝臟細胞破壞后才能在血清中高表達，且受到干擾較小[13]。在本研究中，卡馬西平組大鼠術后ALT與對照組比較差異無統計學意義，說明卡馬西平并無保護殘余肝臟細胞的作用，也無損害肝臟功能的作用。
目前很多學者在探索增強肝臟再生功能的治療方法，但很少能應用于臨床或被臨床所接受。眾所周知，一種新藥或治療方法的誕生到臨床的運用需要非常長的周期及大量的金錢[14-15]，而卡馬西平已經是被廣泛運用的臨床藥物。本研究結果表明，卡馬西平對促進肝臟再生有一定的運用，或許其能在臨床上用于肝臟部分切除術后患者，降低術后并發癥，提高生存率，且對肝臟功能無影響，當然這還需要進一步的臨床試驗。
