引用本文： 姚建鋒, 孫學軍, 閻立昆, 賀賽, 李小軍, 仝聰, 王小強. c-Met在結直腸癌細胞株中的表達及其配體肝細胞生長因子對SW480細胞株增殖和侵襲能力的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(11): 1314-1318. doi: 10.7507/1007-9424.20150344 復制
肝細胞生長因子（HGF）具有強烈促分裂和組織形成、誘導上皮細胞遷移和侵襲、誘導血管生長等作用[1]。c-Met編碼酪氨酸蛋白激酶，是HGF的受體[2]。HGF通過與受體c-Met結合參與了腫瘤細胞增殖與侵襲的信號轉導過程[3]。我們的前期研究[4]結果發現，HGF受體c-Met在結直腸癌組織中高表達，且可能與肝轉移相關。本研究首先驗證HGF受體c-Met在結直腸癌細胞中的表達情況，然后篩選出c-Met高表達結腸癌細胞系SW480，進而通過HGF處理該細胞系，探討HGF對結腸癌細胞系SW480體外增殖、侵襲的作用。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
不同結直腸癌細胞株（LoVo、SW480、SW620、HT-29、HCT116）購自上海吉凱基因公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，HGF和兔抗人c-Met單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology，Inc（CST）公司，基質膠Matrigel購自美國Becton Dickinson公司，DMEM培養基購自Gibco公司，多克隆羊抗兔二抗購自Santa Cruz公司，哺乳動物細胞蛋白裂解液（RIPA）及BCA蛋白定量試劑盒均購自北京中杉生物科技有限公司，c-Met引物由上海吉凱生物工程有限公司合成，SYBR實時定量PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。MTT液購自北京鼎國生物技術有限責任公司，二甲基亞砜（DMSO）購自上海國藥集團。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
LoVo、SW480、SW620、HT-29、HCT116細胞株培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，內加青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/mL，置于5% CO2、飽和濕度、37℃培養箱內培養；取對數生長期細胞用于實驗。
1.2.2 實時定量PCR（real-time PCR）檢測不同細胞株中c-Met mRNA表達水平
先行目的細胞RNA抽取，根據Invitrogen公司Trizol操作說明書進行。反轉錄成cDNA（參照Promega公司m-MLV說明書操作），然后用real-time PCR試劑盒檢測c-Met mRNA表達水平，其中c-Met基因上游引物為5′-AGTCAT-AGGAAGAGGGCATT-3′，下游引物為5’-CTTCACT-TCGCAGGCAGA-3′，擴增片段長度為206 bp；GAPDH基因上游引物為5′-TGACTTCAACAGCGACACCC-A-3′，下游引物為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAA-A-3′，擴增片段長度為121 bp。反應體系為20μL，SYBR Premix Ex Taq 10.0μL，上游引物（2.5μmol/L）0.5μL，下游引物（2.5μmol/L）0.5μL，cDNA 1.0μL，RNase-Free H2O 8.0μL。兩步法進行real-time PCR：95℃預變性30 s；PCR反應，95℃變性5 s，60℃退火30 s，55℃延伸30 s，共45個循環。內參基因為GAPDH，反應體系和條件相同，計算c-Met mRNA的相對表達量，用ΔCt值表示，ΔCt=c-Met基因Ct值-GAPDH基因Ct值。
1.2.3 免疫印跡（Western blot）法檢測不同細胞株中c-Met的蛋白表達水平
RIPA（加蛋白酶及磷酸酶抑制劑）裂解液裂解目的細胞，BCA法測蛋白濃度，5×Buffer加樣緩沖液混合，變性蛋白（100℃5 min），每條8% SDS-PAGE凝膠泳道上樣25μg蛋白，電泳80 V 2 h，轉PVDF膜300 mA 2.5 h，含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉1 h，兔抗人c-Met抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，GAPDH一抗（1∶2 000）4℃過夜，兔二抗（1∶2 000）室溫1 h，增強化學發光法（ECL）顯影，檢測曝光顯影，進行掃描后分析，結果用c-Met灰度值/GAPDH灰度值表示。
1.2.4 采用MTT法檢測細胞增殖實驗
取對數生長期的SW480細胞接種于無菌的96孔微培養板中，每孔100μL，細胞密度為4×103個/孔。分為對照組（0 ng/mL HGF）和不同濃度（20、40、70 ng/mL）的HGF組進行實驗。各組加入不同濃度HGF 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 10μL，孵育4 h，棄上清液，加入100μL/孔的DMSO，微量混合管振蕩5 min，待結晶物完全溶解后，酶標儀測定波長490 nm處吸光度值（A值）。以HGF作用時間為橫坐標，A值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。
1.2.5 Transwell實驗
將HGF處理好的細胞用低血清培養液制成濃度為2×105個/mL的單細胞懸液，取100μL單細胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入600μL含30%胎牛血清培養基，37℃、5% CO2培養箱中培養，6 h后，用棉拭子輕輕移去非轉移細胞，固定下室面細胞后進行結晶紫染色，計數5個不同視野，取平均值分析細胞的穿透能力。
1.3 統計學方法
采用SPSS 16.0統計分析軟件對數據進行分析。本研究中均為計量資料，用均數±標準差（
2 結果
2.1 不同細胞株中c-Met mRNA的表達
在LoVo、SW480、SW620、HT-29、HCT116細胞株中c-Met的mRNA相對表達量結果見圖 1。從圖 1可見，c-Met mRNA在LoVo、SW480、SW620、HT-29、HCT116細胞中均明顯表達（5.750±0.180、4.987±0.289、5.990±0.087、5.827±0.189、5.150±0.080），經過統計學分析，c-Met mRNA在各細胞中的表達量差異無統計學意義（F=0.808，P=0.667）。
圖1
不同細胞株中c-Met的mRNA表達結果
2.2 不同細胞株中c-Met蛋白的表達
在LoVo、SW480、SW620、HT-29、HCT116細胞株中c-Met蛋白表達結果的定性結果見圖 2A，半定量結果見圖 2B。從圖 2B可見，c-Met蛋白在SW480中的表達明顯強于其在Lovo、SW620、HT-29及HCT116細胞中的表達，差異有統計學意義（F=2.106E3，P=0.000）。
圖2
不同細胞株中c-Met蛋白的表達。2A：定性結果；2B：半定量結果。與其余細胞比較，*P < 0.05
2.3 不同濃度HGF對SW480細胞增殖的影響
不同濃度HGF對SW480細胞增殖的影響結果見圖 3。①在同一時間點，與對照組（0 ng/mL HGF）比較，各濃度對SW480細胞生長的增殖作用均明顯增強，且呈一定的量效關系（P < 0.05）；但當HGF濃度超過40 ng/mL后，隨著HGF濃度的增加，其對SW480細胞生長的增殖作用不明顯（P > 0.05）。②在相同濃度組，隨著時間推移，其對細胞的增殖能力均增加（P < 0.05），但到了72 h后，細胞增殖變化不明顯（P > 0.05）。由此看出，各濃度組細胞在48 h增殖能力最強，提示HGF發揮最佳增殖效用的時間為48 h。
圖3
不同濃度HGF對SW480細胞增殖的影響。與0 ng/ml組相應時間點比較，*P < 0.05；與相同濃度前一時相比較，△P < 0.05
2.4 HGF對SW480細胞侵襲能力影響
Transwell實驗結果顯示，不同濃度（0、20、40、70 ng/mL）的外源性HGF對SW480細胞的侵襲能力均具有明顯的促進作用，且隨著HGF濃度的增加，SW480細胞侵襲能力增強，各組間差異具有統計學意義（F=144.621，P=0.000）。見圖 4、5。
圖4
不同濃度HGF作用SW480細胞后的遷移情況（蘇木精染色 ×400）。4A：0 ng/mL HGF；4B：20 ng/mL HGF；4C：40 ng/mL HGF；4D：70 ng/mL HGF
圖5
不同濃度HGF對SW480細胞的侵襲能力影響。不同濃度間比較，*P < 0.05
3 討論
HGF是一種肝細胞特有的血小板衍生促有絲分裂劑，其作為一種可以誘導上皮細胞分散（細胞離散和運動）的成纖維細胞衍生因子，對許多上皮細胞均具有促有絲分裂、誘導形態發生的作用。此外，HGF能刺激血管內皮細胞生長，調節細胞運動、移行、侵襲及刺激血管形成，還可上調與細胞外基質蛋白水解相關的分子及其受體的表達[5]。c-Met蛋白屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族成員，是HGF的上皮特異性受體，參與許多生理發育過程以及腫瘤的侵襲和轉移[6]。近年來研究[7]表明，HGF及其受體是調節腫瘤細胞浸潤、轉移的關鍵細胞因子，HGF可誘導表達c-Met靶細胞的多種作用，包括細胞增殖、分化、侵襲和遷移。HGF/c-Met信號在很多生理過程中發揮重要作用，它們的異常可導致腫瘤形成和轉移的發生。近年研究[8]表明，在某些病理過程中，特別是在一些惡性腫瘤組織中包括結直腸癌在內，HGF/c-Met存在突變、過表達，而且與腫瘤發生、發展、轉移及患者預后有密切關系。我們前期研究文獻[4]曾報道HGF受體c-Met在結直腸癌組織中高表達，且可能與肝轉移相關也證實了這一點。本研究首先應用RT-PCR法、Western blot法檢測c-Met基因和蛋白在不同結直腸癌細胞系中的表達，發現在mRNA基因水平，各腫瘤細胞中均存在c-Met高表達，其差異無統計學意義（P > 0.05）；但在蛋白水平，SW480細胞中c-Met蛋白表達明顯高于其他細胞系，其差異有統計學意義（P < 0.05）。該結果一方面表明，c-Met在SW480細胞中也存在高表達，這與我們前期研究c-Met在結直腸癌組織中高表達的結果相類似；另一方面表明，雖同為結直腸癌細胞，但不同結直腸癌細胞系c-Met的表達也不盡相同。為了更好地研究HGF與c-Met的相互作用對細胞增殖、侵襲能力的影響，本研究選擇了c-Met蛋白較高表達的結腸癌細胞系SW480作為研究對象。
現代腫瘤學研究[9-11]表明，許多細胞因子促進腫瘤生長的機制之一是促進癌細胞的增殖或抑制其凋亡。體外實驗[12]中的結果提示，HGF能夠誘導表達c-Met的靶細胞的多種作用，包括細胞增殖、侵襲、轉移等；王立生等[13]報道，HGF明顯刺激肝癌細胞增殖，其刺激活性具有量效關系，并誘導肝癌細胞從G0/G1期進入S期；Liu等[14]發現，通過干擾c-Met可以有效地抑制HGF誘導的鼻咽癌細胞增殖；石玉生等[15]報道，c-Met siRNA可抑制U87-EGFRvⅢ膠質瘤細胞增殖并誘導其凋亡。本研究中應用HGF對SW480細胞系增殖的促進作用進行了探討，結果發現，HGF對SW480細胞系的增殖有明顯的促進作用，且在一定范圍內隨濃度提高作用增強，呈量效關系，這與上述研究觀點一致，但隨著HGF濃度增加到一定程度，其對SW480細胞系的增殖作用變化不明顯，可能由于該細胞表面受體數量飽和所致，結果進一步提示，HGF可能通過與受體c-Met結合促進了腫瘤細胞增殖。
HGF/c-Met信號轉導通路與多種腫瘤的發生、發展和轉移密切相關。研究[16]發現，在HGF的誘導下，c-Met cDNA可使那些最初對HGF及其受體轉染呈陰性的細胞出現活動能力并易于向基底膜侵襲。Shimizu等[17]證明，轉染c-Met基因能增加癌細胞的腫瘤基因性，使c-Met高表達水平的腫瘤細胞對HGF更敏感和更具侵襲性。體外研究[18]發現，HGF能直接觸發細胞移動及擴散鋪展效應，這種促進運動及促形態發生活性，能直接促進癌細胞黏附、移動和浸潤；Hiscox等[19]通過HGF誘導具有低侵襲性的結直腸癌細胞株Caco-2，發現其上皮細胞表達c-Met并且分泌幾種水解蛋白酶如基質金屬蛋白酶（MMP）-1和MMP-2，故認為外源性HGF通過分解基底膜和增加蛋白水解酶的含量來促進結腸癌細胞的侵襲。Ramanujum等[20]發現，HGF通過作用c-Met下調了MMP-9的表達，同時上調MMP-8的表達，促進了肺癌A549細胞系的侵襲能力。本研究的結果證實，施加外源性的HGF對SW480細胞的干預，腫瘤細胞穿透基底膜的能力較對照組明顯提高，說明HGF促進了SW480細胞的侵襲能力，進一步表明HGF可促進腫瘤細胞的侵襲能力，從而使腫瘤細胞更容易發生侵襲、轉移。
總之，HGF能夠促進SW480細胞的增殖和增加其體外侵襲能力，其機制可能通過與HGF受體c-Met相互作用引起一系列的細胞內信號轉導，而該轉導機制正是我們下一步的研究目標。
肝細胞生長因子（HGF）具有強烈促分裂和組織形成、誘導上皮細胞遷移和侵襲、誘導血管生長等作用[1]。c-Met編碼酪氨酸蛋白激酶，是HGF的受體[2]。HGF通過與受體c-Met結合參與了腫瘤細胞增殖與侵襲的信號轉導過程[3]。我們的前期研究[4]結果發現，HGF受體c-Met在結直腸癌組織中高表達，且可能與肝轉移相關。本研究首先驗證HGF受體c-Met在結直腸癌細胞中的表達情況，然后篩選出c-Met高表達結腸癌細胞系SW480，進而通過HGF處理該細胞系，探討HGF對結腸癌細胞系SW480體外增殖、侵襲的作用。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
不同結直腸癌細胞株（LoVo、SW480、SW620、HT-29、HCT116）購自上海吉凱基因公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，HGF和兔抗人c-Met單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology，Inc（CST）公司，基質膠Matrigel購自美國Becton Dickinson公司，DMEM培養基購自Gibco公司，多克隆羊抗兔二抗購自Santa Cruz公司，哺乳動物細胞蛋白裂解液（RIPA）及BCA蛋白定量試劑盒均購自北京中杉生物科技有限公司，c-Met引物由上海吉凱生物工程有限公司合成，SYBR實時定量PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。MTT液購自北京鼎國生物技術有限責任公司，二甲基亞砜（DMSO）購自上海國藥集團。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
LoVo、SW480、SW620、HT-29、HCT116細胞株培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，內加青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/mL，置于5% CO2、飽和濕度、37℃培養箱內培養；取對數生長期細胞用于實驗。
1.2.2 實時定量PCR（real-time PCR）檢測不同細胞株中c-Met mRNA表達水平
先行目的細胞RNA抽取，根據Invitrogen公司Trizol操作說明書進行。反轉錄成cDNA（參照Promega公司m-MLV說明書操作），然后用real-time PCR試劑盒檢測c-Met mRNA表達水平，其中c-Met基因上游引物為5′-AGTCAT-AGGAAGAGGGCATT-3′，下游引物為5’-CTTCACT-TCGCAGGCAGA-3′，擴增片段長度為206 bp；GAPDH基因上游引物為5′-TGACTTCAACAGCGACACCC-A-3′，下游引物為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAA-A-3′，擴增片段長度為121 bp。反應體系為20μL，SYBR Premix Ex Taq 10.0μL，上游引物（2.5μmol/L）0.5μL，下游引物（2.5μmol/L）0.5μL，cDNA 1.0μL，RNase-Free H2O 8.0μL。兩步法進行real-time PCR：95℃預變性30 s；PCR反應，95℃變性5 s，60℃退火30 s，55℃延伸30 s，共45個循環。內參基因為GAPDH，反應體系和條件相同，計算c-Met mRNA的相對表達量，用ΔCt值表示，ΔCt=c-Met基因Ct值-GAPDH基因Ct值。
1.2.3 免疫印跡（Western blot）法檢測不同細胞株中c-Met的蛋白表達水平
RIPA（加蛋白酶及磷酸酶抑制劑）裂解液裂解目的細胞，BCA法測蛋白濃度，5×Buffer加樣緩沖液混合，變性蛋白（100℃5 min），每條8% SDS-PAGE凝膠泳道上樣25μg蛋白，電泳80 V 2 h，轉PVDF膜300 mA 2.5 h，含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉1 h，兔抗人c-Met抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，GAPDH一抗（1∶2 000）4℃過夜，兔二抗（1∶2 000）室溫1 h，增強化學發光法（ECL）顯影，檢測曝光顯影，進行掃描后分析，結果用c-Met灰度值/GAPDH灰度值表示。
1.2.4 采用MTT法檢測細胞增殖實驗
取對數生長期的SW480細胞接種于無菌的96孔微培養板中，每孔100μL，細胞密度為4×103個/孔。分為對照組（0 ng/mL HGF）和不同濃度（20、40、70 ng/mL）的HGF組進行實驗。各組加入不同濃度HGF 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 10μL，孵育4 h，棄上清液，加入100μL/孔的DMSO，微量混合管振蕩5 min，待結晶物完全溶解后，酶標儀測定波長490 nm處吸光度值（A值）。以HGF作用時間為橫坐標，A值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。
1.2.5 Transwell實驗
將HGF處理好的細胞用低血清培養液制成濃度為2×105個/mL的單細胞懸液，取100μL單細胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入600μL含30%胎牛血清培養基，37℃、5% CO2培養箱中培養，6 h后，用棉拭子輕輕移去非轉移細胞，固定下室面細胞后進行結晶紫染色，計數5個不同視野，取平均值分析細胞的穿透能力。
1.3 統計學方法
采用SPSS 16.0統計分析軟件對數據進行分析。本研究中均為計量資料，用均數±標準差（
2 結果
2.1 不同細胞株中c-Met mRNA的表達
在LoVo、SW480、SW620、HT-29、HCT116細胞株中c-Met的mRNA相對表達量結果見圖 1。從圖 1可見，c-Met mRNA在LoVo、SW480、SW620、HT-29、HCT116細胞中均明顯表達（5.750±0.180、4.987±0.289、5.990±0.087、5.827±0.189、5.150±0.080），經過統計學分析，c-Met mRNA在各細胞中的表達量差異無統計學意義（F=0.808，P=0.667）。
圖1
不同細胞株中c-Met的mRNA表達結果
2.2 不同細胞株中c-Met蛋白的表達
在LoVo、SW480、SW620、HT-29、HCT116細胞株中c-Met蛋白表達結果的定性結果見圖 2A，半定量結果見圖 2B。從圖 2B可見，c-Met蛋白在SW480中的表達明顯強于其在Lovo、SW620、HT-29及HCT116細胞中的表達，差異有統計學意義（F=2.106E3，P=0.000）。
圖2
不同細胞株中c-Met蛋白的表達。2A：定性結果；2B：半定量結果。與其余細胞比較，*P < 0.05
2.3 不同濃度HGF對SW480細胞增殖的影響
不同濃度HGF對SW480細胞增殖的影響結果見圖 3。①在同一時間點，與對照組（0 ng/mL HGF）比較，各濃度對SW480細胞生長的增殖作用均明顯增強，且呈一定的量效關系（P < 0.05）；但當HGF濃度超過40 ng/mL后，隨著HGF濃度的增加，其對SW480細胞生長的增殖作用不明顯（P > 0.05）。②在相同濃度組，隨著時間推移，其對細胞的增殖能力均增加（P < 0.05），但到了72 h后，細胞增殖變化不明顯（P > 0.05）。由此看出，各濃度組細胞在48 h增殖能力最強，提示HGF發揮最佳增殖效用的時間為48 h。
圖3
不同濃度HGF對SW480細胞增殖的影響。與0 ng/ml組相應時間點比較，*P < 0.05；與相同濃度前一時相比較，△P < 0.05
2.4 HGF對SW480細胞侵襲能力影響
Transwell實驗結果顯示，不同濃度（0、20、40、70 ng/mL）的外源性HGF對SW480細胞的侵襲能力均具有明顯的促進作用，且隨著HGF濃度的增加，SW480細胞侵襲能力增強，各組間差異具有統計學意義（F=144.621，P=0.000）。見圖 4、5。
圖4
不同濃度HGF作用SW480細胞后的遷移情況（蘇木精染色 ×400）。4A：0 ng/mL HGF；4B：20 ng/mL HGF；4C：40 ng/mL HGF；4D：70 ng/mL HGF
圖5
不同濃度HGF對SW480細胞的侵襲能力影響。不同濃度間比較，*P < 0.05
3 討論
HGF是一種肝細胞特有的血小板衍生促有絲分裂劑，其作為一種可以誘導上皮細胞分散（細胞離散和運動）的成纖維細胞衍生因子，對許多上皮細胞均具有促有絲分裂、誘導形態發生的作用。此外，HGF能刺激血管內皮細胞生長，調節細胞運動、移行、侵襲及刺激血管形成，還可上調與細胞外基質蛋白水解相關的分子及其受體的表達[5]。c-Met蛋白屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族成員，是HGF的上皮特異性受體，參與許多生理發育過程以及腫瘤的侵襲和轉移[6]。近年來研究[7]表明，HGF及其受體是調節腫瘤細胞浸潤、轉移的關鍵細胞因子，HGF可誘導表達c-Met靶細胞的多種作用，包括細胞增殖、分化、侵襲和遷移。HGF/c-Met信號在很多生理過程中發揮重要作用，它們的異常可導致腫瘤形成和轉移的發生。近年研究[8]表明，在某些病理過程中，特別是在一些惡性腫瘤組織中包括結直腸癌在內，HGF/c-Met存在突變、過表達，而且與腫瘤發生、發展、轉移及患者預后有密切關系。我們前期研究文獻[4]曾報道HGF受體c-Met在結直腸癌組織中高表達，且可能與肝轉移相關也證實了這一點。本研究首先應用RT-PCR法、Western blot法檢測c-Met基因和蛋白在不同結直腸癌細胞系中的表達，發現在mRNA基因水平，各腫瘤細胞中均存在c-Met高表達，其差異無統計學意義（P > 0.05）；但在蛋白水平，SW480細胞中c-Met蛋白表達明顯高于其他細胞系，其差異有統計學意義（P < 0.05）。該結果一方面表明，c-Met在SW480細胞中也存在高表達，這與我們前期研究c-Met在結直腸癌組織中高表達的結果相類似；另一方面表明，雖同為結直腸癌細胞，但不同結直腸癌細胞系c-Met的表達也不盡相同。為了更好地研究HGF與c-Met的相互作用對細胞增殖、侵襲能力的影響，本研究選擇了c-Met蛋白較高表達的結腸癌細胞系SW480作為研究對象。
現代腫瘤學研究[9-11]表明，許多細胞因子促進腫瘤生長的機制之一是促進癌細胞的增殖或抑制其凋亡。體外實驗[12]中的結果提示，HGF能夠誘導表達c-Met的靶細胞的多種作用，包括細胞增殖、侵襲、轉移等；王立生等[13]報道，HGF明顯刺激肝癌細胞增殖，其刺激活性具有量效關系，并誘導肝癌細胞從G0/G1期進入S期；Liu等[14]發現，通過干擾c-Met可以有效地抑制HGF誘導的鼻咽癌細胞增殖；石玉生等[15]報道，c-Met siRNA可抑制U87-EGFRvⅢ膠質瘤細胞增殖并誘導其凋亡。本研究中應用HGF對SW480細胞系增殖的促進作用進行了探討，結果發現，HGF對SW480細胞系的增殖有明顯的促進作用，且在一定范圍內隨濃度提高作用增強，呈量效關系，這與上述研究觀點一致，但隨著HGF濃度增加到一定程度，其對SW480細胞系的增殖作用變化不明顯，可能由于該細胞表面受體數量飽和所致，結果進一步提示，HGF可能通過與受體c-Met結合促進了腫瘤細胞增殖。
HGF/c-Met信號轉導通路與多種腫瘤的發生、發展和轉移密切相關。研究[16]發現，在HGF的誘導下，c-Met cDNA可使那些最初對HGF及其受體轉染呈陰性的細胞出現活動能力并易于向基底膜侵襲。Shimizu等[17]證明，轉染c-Met基因能增加癌細胞的腫瘤基因性，使c-Met高表達水平的腫瘤細胞對HGF更敏感和更具侵襲性。體外研究[18]發現，HGF能直接觸發細胞移動及擴散鋪展效應，這種促進運動及促形態發生活性，能直接促進癌細胞黏附、移動和浸潤；Hiscox等[19]通過HGF誘導具有低侵襲性的結直腸癌細胞株Caco-2，發現其上皮細胞表達c-Met并且分泌幾種水解蛋白酶如基質金屬蛋白酶（MMP）-1和MMP-2，故認為外源性HGF通過分解基底膜和增加蛋白水解酶的含量來促進結腸癌細胞的侵襲。Ramanujum等[20]發現，HGF通過作用c-Met下調了MMP-9的表達，同時上調MMP-8的表達，促進了肺癌A549細胞系的侵襲能力。本研究的結果證實，施加外源性的HGF對SW480細胞的干預，腫瘤細胞穿透基底膜的能力較對照組明顯提高，說明HGF促進了SW480細胞的侵襲能力，進一步表明HGF可促進腫瘤細胞的侵襲能力，從而使腫瘤細胞更容易發生侵襲、轉移。
總之，HGF能夠促進SW480細胞的增殖和增加其體外侵襲能力，其機制可能通過與HGF受體c-Met相互作用引起一系列的細胞內信號轉導，而該轉導機制正是我們下一步的研究目標。
