引用本文： 王路兵, 朱登峰, 黃磊, 張超峰, 姜波健. 胃腺癌患者外周血中基質細胞衍生因子-1α含量檢測及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(11): 1327-1331. doi: 10.7507/1007-9424.20150347 復制
近年來研究[1]發現，基質細胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）/趨化因子受體4（CXCR4）軸在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌等的遷移、侵襲和轉移過程中發揮關鍵作用。在前列腺癌起始細胞的研究[2]中發現，活化的SDF-1α/CXCR4軸維持其腫瘤分化、細胞黏附及致瘤能力。有報道[3-4]稱，CXCR4高表達與膽囊癌淋巴結浸潤和轉移呈正相關，并可作為監測預后的獨立危險因素。在結腸癌中，CXCR4和CD133聯合表達提示高轉移可能性[5]。我們前期研究[6]結果證明，在胃癌KATO-Ⅲ細胞中，SDF-1α/CXCR4軸參與調控CD133（一種潛在的胃癌起始細胞標志物）的表達。還有研究[7-8]表明，SDF-1α/CXCR4軸可能與胃癌淋巴結轉移呈一定的相關性，或可作為胃癌治療的一個潛在靶點。本研究應用酶聯免疫吸附測定技術（ELISA）檢測胃腺癌患者血清中SDF-1α的含量，并分析其與胃腺癌患者臨床病理特征之間的關系，并進一步探討其與胃腺癌患者的生存關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2010年1月至2015年4月期間就診于上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院普外科并實施D2手術和獲得完整隨訪資料的胃腺癌患者90例，其中男42例，女48例；年齡45～85歲，中位年齡60歲。組織學類型：管狀腺癌76例，低分化腺癌4例，印戒細胞腺癌10例。TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期23例，Ⅲ期48例，Ⅳ期12例。淋巴結轉移：有76例，無14例。CT、B超等影像學檢查評估患者術前腫瘤轉移情況，發生遠處轉移患者12例，其中肝轉移5例，腹腔轉移4例，肺轉移3例；無遠處轉移患者78例。所有胃腺癌患者就診前均未采用放化療，除黏膜內癌外，其余全身情況許可者術后均予以5-氟尿嘧啶+草酸鉑+甲酰四氫葉酸鈣治療4～6個療程。選擇25名年齡與胃腺癌患者匹配、體格檢查與常規生化檢查均無明顯異常的健康自愿者作為對照，其中男10例，女15例；年齡38～72歲，中位年齡55歲。隨訪截止日期為2015年4月30日，隨訪率為90%。隨訪方式為電話隨訪或門診隨訪。所有胃腺癌患者和健康自愿者均獲書面知情同意。研究開始前獲醫院倫理委員會審核同意。采集胃腺癌患者治療前及健康自愿者的血清樣本用以檢測血清SDF-1α含量。
1.2 采用ELISA法檢測外周血中SDF-1α含量
分別收集胃腺癌患者和健康自愿者外周血2 mL，放入常規生化檢測管內，在4℃條件下，以3 000 r/min（r=13.5 cm）離心5 min。取上清液500μL存放于-70℃冰箱至檢測。按ELISA試劑盒（Bio-Swamp，上海順元生物科技有限公司，R & D systems）操作。具體步驟為：①加樣：稀釋標準品至不同濃度，每個測試管的密度標準是9 600、4 800、2 400、1 200、600、0 pg/mL。加待檢樣品100μL于反應孔中。②加酶標抗體：于各反應孔中，在標準品和樣本中分別加入抗SDF-1α單抗10μL，置37℃孵育1 h，洗滌。③加底物液顯色：于各反應孔中加入即刻配制的TMB底物溶液（3，3，5，5-Tetramethyl benzidine solution liquid membrane substrate）200μL，置37℃反應30 min。④終止反應：于各反應孔中加入硫酸50μL，使用酶聯免疫分析儀（Bio-Rad Laboratories Inc，Hercules，CA，美國）測定450 nm波長處每孔吸光度值（A值）[9]。以SDF-1α含量中位數為界，大于中位數者為高表達，小于等于中位數者為低表達。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件（Chicago，IL，美國）進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 血清SDF-1α含量比較
健康自愿者的血清中SDF-1α含量為（5 023.7±1 103.8）ng/L，明顯低于胃腺癌患者的（6 950.8±1 131.3）ng/L，差異有統計學意義（P=0.036）。
2.2 胃腺癌患者血清中SDF-1α含量與臨床病理特征的關系
分析胃腺癌患者血清中SDF-1α含量與臨床病例特征的關系顯示，隨著腫瘤浸潤深度（P < 0.001）、淋巴結轉移程度（P=0.018）和TNM分期（P < 0.001）的增加，外周血中SDF-1α含量呈上升趨勢；且有血管浸潤（P=0.001）、淋巴管浸潤（P < 0.001）和遠處轉移（P < 0.001）的胃腺癌患者外周血中SDF-1α含量明顯高于未出現上述情況的患者；但胃腺癌患者的年齡（P=0.282）、性別（P=0.712）、組織學類型（P=0.281）、腫瘤直徑（P=0.627）和組織學分級（P=0.053）與其外周血中SDF-1α含量無關，見表 1。對遠處轉移進一步進行分層分析顯示，有肝轉移和肺轉移的患者外周血中SDF-1α含量均分別明顯高于無肝轉移（P=0.002）和肺轉移（P=0.030）患者，見表 1。
表1
胃腺癌患者血清中SDF-1α含量與臨床病理特征的關系（ng/L，進一步多因素分析發現，腫瘤浸潤深度（OR=14.999，95%可信區間為3.568～75.456，P=0.027）和遠處轉移的發生（OR=0.186，95%可信區間為0.610～2.014，P=0.026）與外周血中SDF-1α含量升高明顯有關，見表 2。
表2
胃腺癌患者血清中SDF-1α含量與臨床病理特征的logistic分析結果
2.3 胃腺癌患者血清中SDF-1α含量對預后的影響
以Kaplan-Meier法繪制的生存曲線見圖 1。
圖1
胃腺癌患者外周血SDF-1α含量高者和含量低者的生存曲線比較
從圖 1可見，經log-rank檢驗，胃腺癌患者外周血中SDF-1α含量低者的生存時間明顯優于含量高的患者（P=0.001）。SDF-1α含量低者的生存時間為（49.55±13.15）個月，明顯優于SDF-1α含量高者的（33.56±16.33）個月（P < 0.001）。
2.4 影響胃腺癌患者預后的因素分析結果
單因素分析結果顯示，胃癌患者腫瘤浸潤越深（P=0.021）、TNM分期越晚（P < 0.001）、遠處轉移（P=0.004）、血管浸潤存在（P=0.002）及外周血SDF-1α含量高表達（P=0.001）的患者的預后越差。進一步Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，腫瘤TNM分期（RR=2.497，95%可信區間為1.987～10.238，P=0.009）、血管浸潤（RR=7.501，95%可信區間為2.086～16.942，P=0.002）及外周血SDF-1α含量高（RR=18.302，95%可信區間為6.895～30.538，P=0.001）分別是影響預后的獨立危險因素，見表 3。
表3
影響胃癌患者預后的Cox比例風險回歸模型分析結果
3 討論
SDF-1α/CXCR4軸是由趨化因子SDF-1α與其特異性受體CXCR4相互作用而構成的一個與細胞間信息傳遞、細胞遷移有密切關系的偶聯分子對[10]，此軸可調控非小細胞肺癌[11]、乳腺癌[12]及結直腸癌[13]的侵襲和轉移。在胃癌中，乏氧環境通過低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）促進CXCR4的表達，從而調控胃癌細胞的生物學特性[14]。CXCR4的表達增強與胃癌患者的預后不良呈正相關[15-16]，激活胃惡性潰瘍微環境中的SDF-1α/CXCR4軸可募集基質細胞誘導胃癌的發生[17]。但是SDF-1α對胃癌細胞侵襲能力的作用，目前相關的研究較少。
Zhi等[18]的研究發現，通過DNA甲基化手段降低胃癌組織中SDF-1α的表達，可顯著抑制胃癌的淋巴結轉移。同樣有研究者[19]利用白花丹素下調SDF-1α受體CXCR4的表達，可抑制乳腺癌細胞發生轉移。在本研究結果中也發現，在發生遠處轉移的胃癌患者的體內血清中SDF-1α含量明顯高于未發生遠處轉移的患者，結果提示，胃癌患者血清中SDF-1α含量可能與胃癌的轉移有關。進一步研究發生遠處轉移的患者，發現只有轉移至肝和肺的胃癌患者，其外周血中SDF-1α水平相較于其未發生轉移的患者顯著增高，而對于發生腹腔轉移的患者，其表達水平較未發生轉移的患者沒有明顯變化。分析其原因可能為：一方面，相較于其他轉移易發生部位，肝和肺器官豐富的血供可保證維持SDF-1α含量在一較高水平，更有利于募集到循環系統中的腫瘤細胞轉移至此，而隨著募集到的腫瘤細胞的增多，可進一步促進腫瘤細胞所處微環境中SDF-1α的分泌，以促進轉移瘤的生長；另一方面，由于腹腔本身沒有肝和肺那樣豐富的血供，所以即便存在較為廣泛的腹腔轉移時，患者血清SDF-1α水平與無腹腔轉移患者相比仍升高不顯著；此外，發生腹腔廣泛轉移的病例數較少或也是導致本研究中出現腹腔轉移患者的SDF-1α表達水平較未發生轉移者無顯著差別的可能原因之一。
趨化因子及其受體與胃癌的發生、進展及轉移有密切聯系，或可作為治療潛在靶點[20]。有研究[21]發現，趨化因子家族的多態性與胃癌的發生和預后息息相關。本課題組前期研究[22]發現，SDF-1受體CXCR4在胃癌組織中的陽性表達與胃癌的侵襲和轉移有關。Wang等[23]比較胃癌患者胃癌組織中和癌旁組織中SDF-1含量發現，SDF-1的表達可作為胃癌患者預后的獨立預測因子，并且與腫瘤的侵襲程度、淋巴結轉移和遠處轉移有關。針對SDF-1α/CXCR4軸及其下游的mTOR通路作為治療靶點可能對于胃癌轉移患者具有一定幫助[24]。本研究進一步探究發現，隨著腫瘤進展程度的增高、淋巴結轉移的廣泛和浸潤深度的加深，外周血中SDF-1α含量升高，提示外周血中SDF-1α可能與胃癌的淋巴結轉移和侵襲轉移有關。Cox回歸分析結果表明，腫瘤分期、血管浸潤和外周血中SDF-1α高表達是胃癌患者預后的獨立危險因素，并且外周血中SDF-1α高表達患者，其術后生存時間短于期低表達患者。
綜上所述，SDF-1α可能在胃癌生長，乃至在肝、肺等器官轉移的發生中發揮重要作用。術后持續隨訪檢測胃癌患者血清中SDF-1α含量對提高胃癌的診斷率、評估患者預后及其特定器官的轉移或許有重要的預測意義，值得進一步的多中心隨機對照研究的驗證。
近年來研究[1]發現，基質細胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）/趨化因子受體4（CXCR4）軸在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌等的遷移、侵襲和轉移過程中發揮關鍵作用。在前列腺癌起始細胞的研究[2]中發現，活化的SDF-1α/CXCR4軸維持其腫瘤分化、細胞黏附及致瘤能力。有報道[3-4]稱，CXCR4高表達與膽囊癌淋巴結浸潤和轉移呈正相關，并可作為監測預后的獨立危險因素。在結腸癌中，CXCR4和CD133聯合表達提示高轉移可能性[5]。我們前期研究[6]結果證明，在胃癌KATO-Ⅲ細胞中，SDF-1α/CXCR4軸參與調控CD133（一種潛在的胃癌起始細胞標志物）的表達。還有研究[7-8]表明，SDF-1α/CXCR4軸可能與胃癌淋巴結轉移呈一定的相關性，或可作為胃癌治療的一個潛在靶點。本研究應用酶聯免疫吸附測定技術（ELISA）檢測胃腺癌患者血清中SDF-1α的含量，并分析其與胃腺癌患者臨床病理特征之間的關系，并進一步探討其與胃腺癌患者的生存關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2010年1月至2015年4月期間就診于上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院普外科并實施D2手術和獲得完整隨訪資料的胃腺癌患者90例，其中男42例，女48例；年齡45～85歲，中位年齡60歲。組織學類型：管狀腺癌76例，低分化腺癌4例，印戒細胞腺癌10例。TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期23例，Ⅲ期48例，Ⅳ期12例。淋巴結轉移：有76例，無14例。CT、B超等影像學檢查評估患者術前腫瘤轉移情況，發生遠處轉移患者12例，其中肝轉移5例，腹腔轉移4例，肺轉移3例；無遠處轉移患者78例。所有胃腺癌患者就診前均未采用放化療，除黏膜內癌外，其余全身情況許可者術后均予以5-氟尿嘧啶+草酸鉑+甲酰四氫葉酸鈣治療4～6個療程。選擇25名年齡與胃腺癌患者匹配、體格檢查與常規生化檢查均無明顯異常的健康自愿者作為對照，其中男10例，女15例；年齡38～72歲，中位年齡55歲。隨訪截止日期為2015年4月30日，隨訪率為90%。隨訪方式為電話隨訪或門診隨訪。所有胃腺癌患者和健康自愿者均獲書面知情同意。研究開始前獲醫院倫理委員會審核同意。采集胃腺癌患者治療前及健康自愿者的血清樣本用以檢測血清SDF-1α含量。
1.2 采用ELISA法檢測外周血中SDF-1α含量
分別收集胃腺癌患者和健康自愿者外周血2 mL，放入常規生化檢測管內，在4℃條件下，以3 000 r/min（r=13.5 cm）離心5 min。取上清液500μL存放于-70℃冰箱至檢測。按ELISA試劑盒（Bio-Swamp，上海順元生物科技有限公司，R & D systems）操作。具體步驟為：①加樣：稀釋標準品至不同濃度，每個測試管的密度標準是9 600、4 800、2 400、1 200、600、0 pg/mL。加待檢樣品100μL于反應孔中。②加酶標抗體：于各反應孔中，在標準品和樣本中分別加入抗SDF-1α單抗10μL，置37℃孵育1 h，洗滌。③加底物液顯色：于各反應孔中加入即刻配制的TMB底物溶液（3，3，5，5-Tetramethyl benzidine solution liquid membrane substrate）200μL，置37℃反應30 min。④終止反應：于各反應孔中加入硫酸50μL，使用酶聯免疫分析儀（Bio-Rad Laboratories Inc，Hercules，CA，美國）測定450 nm波長處每孔吸光度值（A值）[9]。以SDF-1α含量中位數為界，大于中位數者為高表達，小于等于中位數者為低表達。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件（Chicago，IL，美國）進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 血清SDF-1α含量比較
健康自愿者的血清中SDF-1α含量為（5 023.7±1 103.8）ng/L，明顯低于胃腺癌患者的（6 950.8±1 131.3）ng/L，差異有統計學意義（P=0.036）。
2.2 胃腺癌患者血清中SDF-1α含量與臨床病理特征的關系
分析胃腺癌患者血清中SDF-1α含量與臨床病例特征的關系顯示，隨著腫瘤浸潤深度（P < 0.001）、淋巴結轉移程度（P=0.018）和TNM分期（P < 0.001）的增加，外周血中SDF-1α含量呈上升趨勢；且有血管浸潤（P=0.001）、淋巴管浸潤（P < 0.001）和遠處轉移（P < 0.001）的胃腺癌患者外周血中SDF-1α含量明顯高于未出現上述情況的患者；但胃腺癌患者的年齡（P=0.282）、性別（P=0.712）、組織學類型（P=0.281）、腫瘤直徑（P=0.627）和組織學分級（P=0.053）與其外周血中SDF-1α含量無關，見表 1。對遠處轉移進一步進行分層分析顯示，有肝轉移和肺轉移的患者外周血中SDF-1α含量均分別明顯高于無肝轉移（P=0.002）和肺轉移（P=0.030）患者，見表 1。
表1
胃腺癌患者血清中SDF-1α含量與臨床病理特征的關系（ng/L，進一步多因素分析發現，腫瘤浸潤深度（OR=14.999，95%可信區間為3.568～75.456，P=0.027）和遠處轉移的發生（OR=0.186，95%可信區間為0.610～2.014，P=0.026）與外周血中SDF-1α含量升高明顯有關，見表 2。
表2
胃腺癌患者血清中SDF-1α含量與臨床病理特征的logistic分析結果
2.3 胃腺癌患者血清中SDF-1α含量對預后的影響
以Kaplan-Meier法繪制的生存曲線見圖 1。
圖1
胃腺癌患者外周血SDF-1α含量高者和含量低者的生存曲線比較
從圖 1可見，經log-rank檢驗，胃腺癌患者外周血中SDF-1α含量低者的生存時間明顯優于含量高的患者（P=0.001）。SDF-1α含量低者的生存時間為（49.55±13.15）個月，明顯優于SDF-1α含量高者的（33.56±16.33）個月（P < 0.001）。
2.4 影響胃腺癌患者預后的因素分析結果
單因素分析結果顯示，胃癌患者腫瘤浸潤越深（P=0.021）、TNM分期越晚（P < 0.001）、遠處轉移（P=0.004）、血管浸潤存在（P=0.002）及外周血SDF-1α含量高表達（P=0.001）的患者的預后越差。進一步Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，腫瘤TNM分期（RR=2.497，95%可信區間為1.987～10.238，P=0.009）、血管浸潤（RR=7.501，95%可信區間為2.086～16.942，P=0.002）及外周血SDF-1α含量高（RR=18.302，95%可信區間為6.895～30.538，P=0.001）分別是影響預后的獨立危險因素，見表 3。
表3
影響胃癌患者預后的Cox比例風險回歸模型分析結果
3 討論
SDF-1α/CXCR4軸是由趨化因子SDF-1α與其特異性受體CXCR4相互作用而構成的一個與細胞間信息傳遞、細胞遷移有密切關系的偶聯分子對[10]，此軸可調控非小細胞肺癌[11]、乳腺癌[12]及結直腸癌[13]的侵襲和轉移。在胃癌中，乏氧環境通過低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）促進CXCR4的表達，從而調控胃癌細胞的生物學特性[14]。CXCR4的表達增強與胃癌患者的預后不良呈正相關[15-16]，激活胃惡性潰瘍微環境中的SDF-1α/CXCR4軸可募集基質細胞誘導胃癌的發生[17]。但是SDF-1α對胃癌細胞侵襲能力的作用，目前相關的研究較少。
Zhi等[18]的研究發現，通過DNA甲基化手段降低胃癌組織中SDF-1α的表達，可顯著抑制胃癌的淋巴結轉移。同樣有研究者[19]利用白花丹素下調SDF-1α受體CXCR4的表達，可抑制乳腺癌細胞發生轉移。在本研究結果中也發現，在發生遠處轉移的胃癌患者的體內血清中SDF-1α含量明顯高于未發生遠處轉移的患者，結果提示，胃癌患者血清中SDF-1α含量可能與胃癌的轉移有關。進一步研究發生遠處轉移的患者，發現只有轉移至肝和肺的胃癌患者，其外周血中SDF-1α水平相較于其未發生轉移的患者顯著增高，而對于發生腹腔轉移的患者，其表達水平較未發生轉移的患者沒有明顯變化。分析其原因可能為：一方面，相較于其他轉移易發生部位，肝和肺器官豐富的血供可保證維持SDF-1α含量在一較高水平，更有利于募集到循環系統中的腫瘤細胞轉移至此，而隨著募集到的腫瘤細胞的增多，可進一步促進腫瘤細胞所處微環境中SDF-1α的分泌，以促進轉移瘤的生長；另一方面，由于腹腔本身沒有肝和肺那樣豐富的血供，所以即便存在較為廣泛的腹腔轉移時，患者血清SDF-1α水平與無腹腔轉移患者相比仍升高不顯著；此外，發生腹腔廣泛轉移的病例數較少或也是導致本研究中出現腹腔轉移患者的SDF-1α表達水平較未發生轉移者無顯著差別的可能原因之一。
趨化因子及其受體與胃癌的發生、進展及轉移有密切聯系，或可作為治療潛在靶點[20]。有研究[21]發現，趨化因子家族的多態性與胃癌的發生和預后息息相關。本課題組前期研究[22]發現，SDF-1受體CXCR4在胃癌組織中的陽性表達與胃癌的侵襲和轉移有關。Wang等[23]比較胃癌患者胃癌組織中和癌旁組織中SDF-1含量發現，SDF-1的表達可作為胃癌患者預后的獨立預測因子，并且與腫瘤的侵襲程度、淋巴結轉移和遠處轉移有關。針對SDF-1α/CXCR4軸及其下游的mTOR通路作為治療靶點可能對于胃癌轉移患者具有一定幫助[24]。本研究進一步探究發現，隨著腫瘤進展程度的增高、淋巴結轉移的廣泛和浸潤深度的加深，外周血中SDF-1α含量升高，提示外周血中SDF-1α可能與胃癌的淋巴結轉移和侵襲轉移有關。Cox回歸分析結果表明，腫瘤分期、血管浸潤和外周血中SDF-1α高表達是胃癌患者預后的獨立危險因素，并且外周血中SDF-1α高表達患者，其術后生存時間短于期低表達患者。
綜上所述，SDF-1α可能在胃癌生長，乃至在肝、肺等器官轉移的發生中發揮重要作用。術后持續隨訪檢測胃癌患者血清中SDF-1α含量對提高胃癌的診斷率、評估患者預后及其特定器官的轉移或許有重要的預測意義，值得進一步的多中心隨機對照研究的驗證。
