引用本文： 曹子龍, 張卓, 胡建立, 申鉉三. NKD1和APC在乳腺癌組織中的表達及意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(10): 1226-1229. doi: 10.7507/1007-9424.20150317 復制
乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是威脅女性健康的殺手，其發病率有逐年增長的趨勢[1]。研究[2-3]發現，乳腺癌的發生發展是由多種不同因素引起的，且是受多種不同調節蛋白共同作用的結果。Wnt信號通路被認為與多種惡性腫瘤的發生存在著密切的關系[4-5]。有研究[6-7]顯示：多種惡性腫瘤存在著Wnt信號通路的異常激活，而此通路是由多種重要的蛋白因子組成，其中裸角質膜同源蛋白（NKD1）和結腸腺瘤性息肉病基因（adenomatouspolyposis coli，APC）是Wnt通路中備受關注的重要的蛋白因子。研究[8-10]發現，NKD1和APC是Wnt信號通路中抑制性蛋白，參與多種惡性腫瘤的發生；目前關于NKD1和APC與乳腺癌關系的報道較少[11-14]。因此，本研究應用免疫組織化學方法檢測NKD1和APC在乳腺癌組織中及正常乳腺組織中表達的差異性，進而探討兩者在乳腺癌發生發展中的作用及兩者間的相關性，并分析兩者與乳腺癌臨床病理特征的關系，旨在為乳腺癌的早期診斷、病情發展評估、個性化治療及預后判斷提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 標本來源
收集211年1月至2014年6月期間內蒙古民族大學附屬醫院收治的病理資料完整、排除術前放化療、行根治性手術切除以及診斷明確的75例乳腺癌患者的石蠟標本，同時取其對應的距乳腺癌組織5 cm以上的正常乳腺組織標本作為對照。所有患者均為女性，年齡29～73歲，平均年齡為51歲。所有標本均經兩位經驗豐富的資深病理科醫師嚴格審查。
1.2 主要試劑、材料
兔抗人NKD1單克隆抗體和鼠抗人APC單克隆抗體濃縮液均購自北京中杉生物技術公司；DAB顯色試劑盒和抗生物素-過氧化物酶溶液均購自福州邁新生物技術開發有限公司；PBS緩沖液由內蒙古民族大學附屬醫院病理科提供。
1.3 檢測指標及方法
采用免疫組織化學SP法檢測乳腺癌組織及其對應的正常乳腺組織中NKD1和APC的表達。取納入研究的乳腺癌石蠟標本切片、常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶；0.01 mol/L（pH6.0）檸檬酸鹽緩沖液高壓修復抗原山羊血清封閉；滴加一抗4℃孵育過夜；滴加辣根酶標記的二抗；滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶）；DAB染色后蘇木精復染；最后應用中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對照，已知的NKD1和APC陽性染色的正常乳腺組織標本作陽性對照。
1.4 結果判定標準
NKD1和APC的陽性染色部位都主要定位于細胞質中，以棕黃色的顆粒樣著色為陽性細胞。選取10個高倍鏡（×400）視野計數，計算其陽性細胞所占的百分比并予以評分：陽性細胞所占百分比≤10%為0分；10%～20%為1分；20%～50%為2分；50%～75%為3分；> 75%為4分。同時再按照染色強度評分：無色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將染色強度與陽性細胞率兩項評分的乘積作為最終結果：0～2分為（-），3～5分為（+），6～8分為（++），9～12分為（+++）；其中（-）和（+）為低表達，（++）和（+++）為高表達。
1.5 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件包進行統計學分析。用等級資料的χ2檢驗來分析NKD1和APC表達與乳腺癌臨床病理特征之間的關系；用Spearman等級秩和相關分析對兩因子進行相關性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1
NKD1和APC在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達免疫組化染色結果顯示：NKD1在乳腺癌組織中表達陽性者27例，表達陽性率為36.00%（27/75），正常乳腺組織中表達陽性者62例，表達陽性率為82.67%（62/75），前者明顯低于后者，其差異具有統計學意義（χ2=33.846，P=0.000）；APC在乳腺癌組織中表達陽性者34例，表達陽性率為45.33%（34/75），正常乳腺組織中表達陽性者67例，表達陽性率為89.33%（6775），前者明顯低于后者，其差異具有統計學意義（χ2=33.007，P=0.000）。
2.2 乳腺癌組織中NKD1和APC的表達與其臨床病理特征的關系
NKD1在乳腺癌組織中的表達與患者的年齡無關（P > 0.05），而與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和遠處臟器轉移有關（P < 0.05）；APC在乳腺癌組織中的表達與患者年齡、腫瘤分化程度和淋巴結轉移均無相關性（P > 0.05），而與如乳腺癌TNM分期及遠處臟器轉移有相關性（P < 0.05），見表 1。
表1
乳腺癌組織中NKD1和APC的表達與其臨床病理特征的關系
2.3 NKD1和APC表達間的相關性
在75例乳腺癌標本中，NKD1和APC在同一標本中均為陽性表達者24例，均為陰性表達的共38例，其Spearman等級秩和相關分析結果顯示，兩者在乳腺癌中的表達呈正相關關系（r=0.609，P=0.000）。
3 討論
NKD1是一種最早發現于果蠅體內、由470個氨基酸組成的蛋白，其廣泛表達于多種重要器官的細胞質中，是經典的Wnt信號通路的抑制性蛋白，與多種腫瘤的發生存在著密切的關系[15]。NKD1對Wnt通路的抑制作用可能通過與Wnt信號通路中Dishevelled蛋白上的DIX和PDZ區域結合[16]，抑制β-atenin在細胞質內的積聚，從而抑制經典Wnt信號通路中下游基因的轉錄，最終抑制腫瘤的發生。有學者[17]對NKD 1參與介導miR-195對骨肉瘤轉移的抑制作用中也證實了NKD1對Wnt信號通路抑制作用的機理。有學者報道了NKD1在胃癌[18]和非小細胞肺癌[19]中表達下調，提示了NKD1在惡性腫瘤中的低表達，可能是導致腫瘤發生的因素之一。由于NKD1的表達下降或缺失，可能無法有效抑制Wnt信號通路，從而導致β連環蛋白在細胞中積聚，激活下游基因的轉錄，促進了腫瘤細胞的增殖，最終導致腫瘤的發生。但目前對于其具體機理仍需進一步研究探討。本研究結果顯示，NKD1在乳腺癌中的表達陽性率明顯低于正常乳腺組織，并且其陽性表達與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和遠處臟器轉移均有關，這就提示NKD1參與了乳腺癌的發生與發展，可作為乳腺癌重要的影響因子。
APC是由2 843個氨基酸組成的一類胞質蛋白，并與多種同源性蛋白如D-APC、H-APC、APC-L/2、E-APC等組成了APC蛋白家族，APC是其蛋白家族中最為普遍同時也是發現最早的蛋白[20-21]。研究[21-22]發現，APC與多種腫瘤的發生存在著密切關系，參與經典的Wnt信號通路，并且對Wnt信號通路起到了抑制性作用。對于APC的抑制性作用的具體機理有所研究，但尚未得到統一認識。目前主要認為APC在Wnt信號通路中存在著與β-Catenin、Axin，Gsk-3β和CKlα形成的復合體，APC可起到促進β-Catenin磷酸化、泛素化和降解，從而抑制β-Catenin在胞漿中的堆積，無法進入細胞核，最終抑制下游基因的一系列轉錄，達到抑制腫瘤發生的作用[22]。APC一旦突變或者某種原因導致其表達缺失[23]，這種抑制性作用將不復存在。本研究在乳腺癌與正常乳腺組織中檢測APC表達情況，結果顯示癌旁組織中其表達陽性率明顯高于癌組織，同時發現APC的表達與乳腺癌的TNM分期及遠處臟器轉移有關，提示APC可作為乳腺癌重要的檢測指標，對乳腺癌的治療、預后判斷提供有價值的參考。
Wnt信號通路是近年來的研究熱點[24-25]，以Wnt/β-atenin中心，本研究探討了Wnt信號通路中關鍵的質蛋白NKD1和APC的相關性，其結果顯示，NKD1和APC在乳腺癌組織中的表達呈正相關關系，提示兩者在乳腺癌的發生發展過程中可能存在協同的關系。
綜上所述，NKD1和APC的表達異常或缺失可能是引起乳腺癌發生發展及轉移的重要原因，本研究可以明確此種相關性，但具體機理尚需進一步研究。本研究結果提示，NKD1和APC可能參與了乳腺癌的發生、發展及遠端臟器轉移，并且兩者可能在乳腺癌進展中存在著協同作用。
乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是威脅女性健康的殺手，其發病率有逐年增長的趨勢[1]。研究[2-3]發現，乳腺癌的發生發展是由多種不同因素引起的，且是受多種不同調節蛋白共同作用的結果。Wnt信號通路被認為與多種惡性腫瘤的發生存在著密切的關系[4-5]。有研究[6-7]顯示：多種惡性腫瘤存在著Wnt信號通路的異常激活，而此通路是由多種重要的蛋白因子組成，其中裸角質膜同源蛋白（NKD1）和結腸腺瘤性息肉病基因（adenomatouspolyposis coli，APC）是Wnt通路中備受關注的重要的蛋白因子。研究[8-10]發現，NKD1和APC是Wnt信號通路中抑制性蛋白，參與多種惡性腫瘤的發生；目前關于NKD1和APC與乳腺癌關系的報道較少[11-14]。因此，本研究應用免疫組織化學方法檢測NKD1和APC在乳腺癌組織中及正常乳腺組織中表達的差異性，進而探討兩者在乳腺癌發生發展中的作用及兩者間的相關性，并分析兩者與乳腺癌臨床病理特征的關系，旨在為乳腺癌的早期診斷、病情發展評估、個性化治療及預后判斷提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 標本來源
收集211年1月至2014年6月期間內蒙古民族大學附屬醫院收治的病理資料完整、排除術前放化療、行根治性手術切除以及診斷明確的75例乳腺癌患者的石蠟標本，同時取其對應的距乳腺癌組織5 cm以上的正常乳腺組織標本作為對照。所有患者均為女性，年齡29～73歲，平均年齡為51歲。所有標本均經兩位經驗豐富的資深病理科醫師嚴格審查。
1.2 主要試劑、材料
兔抗人NKD1單克隆抗體和鼠抗人APC單克隆抗體濃縮液均購自北京中杉生物技術公司；DAB顯色試劑盒和抗生物素-過氧化物酶溶液均購自福州邁新生物技術開發有限公司；PBS緩沖液由內蒙古民族大學附屬醫院病理科提供。
1.3 檢測指標及方法
采用免疫組織化學SP法檢測乳腺癌組織及其對應的正常乳腺組織中NKD1和APC的表達。取納入研究的乳腺癌石蠟標本切片、常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶；0.01 mol/L（pH6.0）檸檬酸鹽緩沖液高壓修復抗原山羊血清封閉；滴加一抗4℃孵育過夜；滴加辣根酶標記的二抗；滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶）；DAB染色后蘇木精復染；最后應用中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對照，已知的NKD1和APC陽性染色的正常乳腺組織標本作陽性對照。
1.4 結果判定標準
NKD1和APC的陽性染色部位都主要定位于細胞質中，以棕黃色的顆粒樣著色為陽性細胞。選取10個高倍鏡（×400）視野計數，計算其陽性細胞所占的百分比并予以評分：陽性細胞所占百分比≤10%為0分；10%～20%為1分；20%～50%為2分；50%～75%為3分；> 75%為4分。同時再按照染色強度評分：無色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將染色強度與陽性細胞率兩項評分的乘積作為最終結果：0～2分為（-），3～5分為（+），6～8分為（++），9～12分為（+++）；其中（-）和（+）為低表達，（++）和（+++）為高表達。
1.5 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件包進行統計學分析。用等級資料的χ2檢驗來分析NKD1和APC表達與乳腺癌臨床病理特征之間的關系；用Spearman等級秩和相關分析對兩因子進行相關性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1
NKD1和APC在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達免疫組化染色結果顯示：NKD1在乳腺癌組織中表達陽性者27例，表達陽性率為36.00%（27/75），正常乳腺組織中表達陽性者62例，表達陽性率為82.67%（62/75），前者明顯低于后者，其差異具有統計學意義（χ2=33.846，P=0.000）；APC在乳腺癌組織中表達陽性者34例，表達陽性率為45.33%（34/75），正常乳腺組織中表達陽性者67例，表達陽性率為89.33%（6775），前者明顯低于后者，其差異具有統計學意義（χ2=33.007，P=0.000）。
2.2 乳腺癌組織中NKD1和APC的表達與其臨床病理特征的關系
NKD1在乳腺癌組織中的表達與患者的年齡無關（P > 0.05），而與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和遠處臟器轉移有關（P < 0.05）；APC在乳腺癌組織中的表達與患者年齡、腫瘤分化程度和淋巴結轉移均無相關性（P > 0.05），而與如乳腺癌TNM分期及遠處臟器轉移有相關性（P < 0.05），見表 1。
表1
乳腺癌組織中NKD1和APC的表達與其臨床病理特征的關系
2.3 NKD1和APC表達間的相關性
在75例乳腺癌標本中，NKD1和APC在同一標本中均為陽性表達者24例，均為陰性表達的共38例，其Spearman等級秩和相關分析結果顯示，兩者在乳腺癌中的表達呈正相關關系（r=0.609，P=0.000）。
3 討論
NKD1是一種最早發現于果蠅體內、由470個氨基酸組成的蛋白，其廣泛表達于多種重要器官的細胞質中，是經典的Wnt信號通路的抑制性蛋白，與多種腫瘤的發生存在著密切的關系[15]。NKD1對Wnt通路的抑制作用可能通過與Wnt信號通路中Dishevelled蛋白上的DIX和PDZ區域結合[16]，抑制β-atenin在細胞質內的積聚，從而抑制經典Wnt信號通路中下游基因的轉錄，最終抑制腫瘤的發生。有學者[17]對NKD 1參與介導miR-195對骨肉瘤轉移的抑制作用中也證實了NKD1對Wnt信號通路抑制作用的機理。有學者報道了NKD1在胃癌[18]和非小細胞肺癌[19]中表達下調，提示了NKD1在惡性腫瘤中的低表達，可能是導致腫瘤發生的因素之一。由于NKD1的表達下降或缺失，可能無法有效抑制Wnt信號通路，從而導致β連環蛋白在細胞中積聚，激活下游基因的轉錄，促進了腫瘤細胞的增殖，最終導致腫瘤的發生。但目前對于其具體機理仍需進一步研究探討。本研究結果顯示，NKD1在乳腺癌中的表達陽性率明顯低于正常乳腺組織，并且其陽性表達與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和遠處臟器轉移均有關，這就提示NKD1參與了乳腺癌的發生與發展，可作為乳腺癌重要的影響因子。
APC是由2 843個氨基酸組成的一類胞質蛋白，并與多種同源性蛋白如D-APC、H-APC、APC-L/2、E-APC等組成了APC蛋白家族，APC是其蛋白家族中最為普遍同時也是發現最早的蛋白[20-21]。研究[21-22]發現，APC與多種腫瘤的發生存在著密切關系，參與經典的Wnt信號通路，并且對Wnt信號通路起到了抑制性作用。對于APC的抑制性作用的具體機理有所研究，但尚未得到統一認識。目前主要認為APC在Wnt信號通路中存在著與β-Catenin、Axin，Gsk-3β和CKlα形成的復合體，APC可起到促進β-Catenin磷酸化、泛素化和降解，從而抑制β-Catenin在胞漿中的堆積，無法進入細胞核，最終抑制下游基因的一系列轉錄，達到抑制腫瘤發生的作用[22]。APC一旦突變或者某種原因導致其表達缺失[23]，這種抑制性作用將不復存在。本研究在乳腺癌與正常乳腺組織中檢測APC表達情況，結果顯示癌旁組織中其表達陽性率明顯高于癌組織，同時發現APC的表達與乳腺癌的TNM分期及遠處臟器轉移有關，提示APC可作為乳腺癌重要的檢測指標，對乳腺癌的治療、預后判斷提供有價值的參考。
Wnt信號通路是近年來的研究熱點[24-25]，以Wnt/β-atenin中心，本研究探討了Wnt信號通路中關鍵的質蛋白NKD1和APC的相關性，其結果顯示，NKD1和APC在乳腺癌組織中的表達呈正相關關系，提示兩者在乳腺癌的發生發展過程中可能存在協同的關系。
綜上所述，NKD1和APC的表達異常或缺失可能是引起乳腺癌發生發展及轉移的重要原因，本研究可以明確此種相關性，但具體機理尚需進一步研究。本研究結果提示，NKD1和APC可能參與了乳腺癌的發生、發展及遠端臟器轉移，并且兩者可能在乳腺癌進展中存在著協同作用。
