引用本文： 趙成茂, 晉國權, 尚春香. PIK3CA基因突變預測手術切除治療肝癌的療效和預后研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(10): 1179-1182. doi: 10.7507/1007-9424.20150307 復制
目前，臨床上普遍認為惡性腫瘤是一種遺傳性疾病，原癌基因與抑癌基因的體細胞突變是癌變過程的關鍵啟動因素。PIK3信號通路在人類惡性腫瘤的發生發展過程中起著重要作用[1]。近年來，越來越多的研究表明，PIK3CA編碼的催化亞基發生突變，可能參與調控癌變的全過程，有文獻[2-3]報道，約3%的人體實體惡性腫瘤存在PIK3CA編碼的催化亞基突變。PIK3CA基因突變研究，目前報道較多的為消化道腫瘤，特別是結直腸癌，而對于肝癌與PIK3CA基因突變的關系的研究較少。為了進一步研究和探索PIK3CA基因突變對經手術切除后的肝癌患者療效及預后的影響，本研究前瞻性地觀察了近年來在筆者所在醫院接受根治性切除術的肝癌患者的PIK3CA基因突變情況，旨在為發現對肝癌患者的療效及預后具有預測意義的分子生物學事件提供幫助。
1 資料與方法
1.1 研究對象
采用簡單隨機抽樣的方法隨機選取2009年1月至2011年3月期間在筆者所在醫院接受根治性切除手術治療的肝癌患者79例作為研究對象，收集所有研究對象的臨床資料及手術切除的肝癌組織。
79例入選的研究對象中，男49例，年齡（54.56±11.23）歲；女30例，年齡（55.69±10.74）歲。肝功能Child分級情況：A級44例、B級25例、C級10例；腫瘤分化程度：高分化19例、中分化29例、低分化31例；腫瘤直徑2～12 cm，平均（5.12±2.21）cm。
1.2 研究方法
1.2.1 肝癌組織標本的儲存
79例肝癌患者手術切除的肝癌組織均經常規病理學檢查確診；每例標本切取1 cm見方的腫瘤組織，去除殘留血液及壞死組織，10%中性甲醛溶液固定，4℃冰箱保存備用。
1.2.2 主要實驗試劑及儀器設備
PIK3CA抗體（Abgent公司，美國），DNA Tissue試劑盒（OMEGA公司，美國），無水乙醇及95%乙醇（國藥集團化學試劑有限公司），PIK3CA基因引物、K-ras、Taq酶及dNTP（上海博尚生物技術有限公司）。PCR儀及DNA測序儀（A B公司，美國），GelDoc凝膠成像分析系統（Bio-Rad公司，美國），倒置顯微鏡及顯微鏡（OLYMPUS公司，日本），平板離心機（EPPENDORF公司，德國），手動輪轉切片機及烘片機（LEICA公司，德國），恒溫水浴箱（SHELLAB公司，美國），冰箱（青島Haier公司）。
1.2.3 DNA提取
79例肝癌組織標本經HE染色證實肝癌細胞的存在，并選取細胞密集區域的新鮮肝癌組織采用標準蛋白酶K消化法[4]提取DNA。
1.2.4 PIK3CA基因突變PCR實驗
①PCR反應體系：去離子水11.65μL；10×buffer 5μL；dNTP 1.6μL；上、下游引物各1μL；DNA模板5μL；Tap酶0.15μL；加去離子水至20μL。②循環參數：95℃預變性5 min后30個循環；56℃退火變性30 s，72℃延伸30 s，最后1個循環延伸5 min。③引物設計：見表 1。
表1
PCR擴增反應中PIK3CA基因引物序列及擴增片段長度
1.2.5 基因測序
本研究將79例肝癌組織基因組DNA進行序列測定，測序工作由上海生工生物工程公司完成。
1.3 療效判斷標準
79例患者腫瘤經手術切除后，均在筆者所在醫院放射科接受6個周期的放療，放療方案為常規分割放射，如2 Gy/次，1次/d，照射5次/周，總劑量為50～62 Gy。參考WHO實體瘤放化療療效標準[5-6]，并結合肝癌的病理學特點，制定如下改良的放療療效評定標準：①完全緩解（CR），影像學未發現腫瘤或腫瘤消失，癥狀、體征消失，維持≥4周；②部分緩解（PR），影像學暫未發現腫瘤或腫瘤消失，癥狀、體征部分消失，維持< 4周；③穩定（SD），臨床癥狀、體征等指標未見明顯改變；④進展（PD），影像學發現腫瘤，臨床癥狀、體征加重。
1.4 統計學方法
PIK3CA基因突變狀況與臨床病理參數的關系分析采用Pearson χ2檢驗，必要時采用Fisher確切概率法；預后分析采用Kaplan-Meier生存分析，所有數據均采用SPSS 20.0統計學軟件進行處理。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 PCR擴增電泳結果
本研究采用PCR技術對79例肝癌組織中PIK3CA基因的第9外顯子DNA進行擴增，PCR產物經2%的瓊脂糖電泳圖像如圖 1所示，圖中DNA電泳條帶清晰，邊緣完整、光滑。經確認，本研究所提取的79例肝癌組織標本DNA均無降解破裂，對后續研究影響較小，可以進行后續研究。
圖1
示肝癌組織PIK3CA基因PCR擴增電泳圖。1～8：肝癌組織；M：Marker
2.2 DNA測序結果
由PIK3CA基因第9外顯子測序結果發現：本組79例肝癌組織標本中，31例標本中發現雜合子突變的重疊異常峰圖，本組病例的PIK3CA基因第9外顯子突變率為39.24%。
2.3 PIK3CA基因突變與肝癌患者主要臨床病理參數的關系
結果見表 2。由表 2可見，在不同的年齡、性別、是否吸煙和飲酒以及不同的TNM分期間的PIK3CA基因第9外顯子突變率差異無統計學意義（P > 0.05）；而腫瘤系低分化且伴淋巴結轉移者的PIK3CA基因第9外顯子突變率明顯高于中-高分化及無淋巴結轉移者（P > 0.05）。
表2
PIK3CA基因第9外顯子突變與肝癌患者主要臨床病理參數的關系〔例（%）〕
2.4 PIK3CA基因第9外顯子突變對肝癌患者術后近期療效的影響
本組79例肝癌患者經手術切除腫瘤及術后施以6個周期的放療后，其近期（6個月）療效見表 3。由表 3可見，未突變組患者的近期療效優于突變組（Z=2.111，P=0.035）。
表3
PIK3CA基因第9外顯子突變對79例肝癌患者術后近期療效的影響〔例（%）〕
2.5 PIK3CA基因第9外顯子突變對肝癌患者預后的影響
本研究采用電話、門診復查等形式對79例患者進行了3年以上的隨訪，共有67例患者獲訪，12例患者失訪，其中突變組失訪4例，未突變組失訪8例。突變組患者總體生存時間1～52個月，中位生存時間19.41個月，3年累積生存率為33.33%；未突變組患者生存時間5～56個月，中位生存時間25.66個月，3年累積生存率為60.00%。2組患者的累積無瘤生存率及累積總體生存率的差異均具有統計學意義（P=0.030，P=0.012），突變組患者的累積無瘤生存率及累積總生存率均明顯低于未突變組患者。見圖 2。
圖2
PIK3CA基因第9外顯子突變組和未突變組的Kaplan-Meier生存曲線。2A：累積無瘤生存率；2B：累積總體生存率
3 討論
磷脂酞肌醇-3-激酶（PI3K）是脂類激酶的家族成員之一，有研究[6-7]結果表明，PI3K-AKT信號途徑具有重要的細胞調節功能，其參與細胞增殖、細胞活動及黏附、細胞分化、細胞胞內運輸等多種細胞相關過程。PIK3CA是PI3K催化亞單位。有文獻[8]報道，PIK3CA基因在卵巢癌等惡性腫瘤組織中呈過表達狀態，在結腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤呈高突變狀態，突變率可達40%。以往的研究結果[8-9]顯示，PIK3CA基因突變主要發生在第l外顯子（約占20%）、第9外顯子（約占50%）及20外顯子的特異性位點（約占30%）。但是上述結果仍有爭議，例如：有的研究[9-11]以肝癌組織為標本，在第1外顯子和第20外顯子并未發現PIK3CA基因突變。這提示在不同的腫瘤種類、不同地區等因素的影響下，PIK3CA基因突變的特點可能會發生改變。PIK3CA基因突變在腫瘤發生發展過程中起著重要的作用。本研究選取接受根治性手術治療的肝癌患者的肝癌組織標本，采用PCR法及DNA序列測定法對PIK3CA基因的第9外顯子進行突變篩查，分析PIK3CA基因突變率，并探討其對患者的近期療效及預后的影響，旨在為肝癌患者的早期臨床治療提供依據。
本研究對79例肝癌組織標本首先進行PCR實驗，以證實目的基因是否準確以及所提取DNA的純度和質量。本研究在DNA提取過程中，由專人在各環節均進行了嚴格的質量控制，故最終經PCR及電泳圖像確認，本研究所提取的DNA均無降解破裂，可以進行后續研究。為了提高研究效率，借鑒以往研究的經驗，本研究采用DNA序列測定法篩查PIK3CA基因的第9外顯子的突變狀況。結果顯示共有31例標本中發現雜合子突變的重疊異常的峰圖，即可以判斷為存在雜合子突變，其PIK3CA基因第9外顯子突變率為39.24%（31/79）。與國內外類似的研究[5, 12-14]報道基本相似。對于PIK3CA基因在肝癌組織中發生突變的機理目前并未十分明確，但有研究[15-16]認為可能與PI3K及其下游區激酶AKT的激活從而誘導了致癌基因的激活有關，上述激活方式主要包括：點突變、插入突變、堿基易位等。本研究所發現的突變主要為堿基易位。本研究結果顯示，PIK3CA基因第9外顯子突變率與肝癌的淋巴結轉移和腫瘤分化程度具有一定關系，提示PIK3CA基因突變、淋巴結轉移和病理分化可能共同參與了腫瘤的發生和發展過程。
PIK3CA基因突變對腫瘤療效與預后的影響尚未見報道。本研究探討了79例肝癌患者經手術和放療后的近期療效和3年生存率。結果顯示：PIK3CA基因突變對治療效果確實可以產生一定的影響，未突變組患者近期療效明顯優于突變組（P=0.035）；突變組的3年累積無瘤生存率和累積總體生存率均明顯低于未突變組（P=0.030，P=0.012）。該結果提示，上述效應可能與PIK3CA基因參與腫瘤細胞的增殖與分化的調控，從而加速了惡性腫瘤的發生和發展速度有關，進而影響了患者的生存時間與生存率[17-20]。
本研究只檢測了第9外顯子，突變率可能偏低，其突變還可能存在其他形式，但是本研究前瞻性地觀察到存在PIK3CA基因突變者其術后近期療效和預后均較差，這可能為探索肝癌的基因治療靶點提供新的思路。
目前，臨床上普遍認為惡性腫瘤是一種遺傳性疾病，原癌基因與抑癌基因的體細胞突變是癌變過程的關鍵啟動因素。PIK3信號通路在人類惡性腫瘤的發生發展過程中起著重要作用[1]。近年來，越來越多的研究表明，PIK3CA編碼的催化亞基發生突變，可能參與調控癌變的全過程，有文獻[2-3]報道，約3%的人體實體惡性腫瘤存在PIK3CA編碼的催化亞基突變。PIK3CA基因突變研究，目前報道較多的為消化道腫瘤，特別是結直腸癌，而對于肝癌與PIK3CA基因突變的關系的研究較少。為了進一步研究和探索PIK3CA基因突變對經手術切除后的肝癌患者療效及預后的影響，本研究前瞻性地觀察了近年來在筆者所在醫院接受根治性切除術的肝癌患者的PIK3CA基因突變情況，旨在為發現對肝癌患者的療效及預后具有預測意義的分子生物學事件提供幫助。
1 資料與方法
1.1 研究對象
采用簡單隨機抽樣的方法隨機選取2009年1月至2011年3月期間在筆者所在醫院接受根治性切除手術治療的肝癌患者79例作為研究對象，收集所有研究對象的臨床資料及手術切除的肝癌組織。
79例入選的研究對象中，男49例，年齡（54.56±11.23）歲；女30例，年齡（55.69±10.74）歲。肝功能Child分級情況：A級44例、B級25例、C級10例；腫瘤分化程度：高分化19例、中分化29例、低分化31例；腫瘤直徑2～12 cm，平均（5.12±2.21）cm。
1.2 研究方法
1.2.1 肝癌組織標本的儲存
79例肝癌患者手術切除的肝癌組織均經常規病理學檢查確診；每例標本切取1 cm見方的腫瘤組織，去除殘留血液及壞死組織，10%中性甲醛溶液固定，4℃冰箱保存備用。
1.2.2 主要實驗試劑及儀器設備
PIK3CA抗體（Abgent公司，美國），DNA Tissue試劑盒（OMEGA公司，美國），無水乙醇及95%乙醇（國藥集團化學試劑有限公司），PIK3CA基因引物、K-ras、Taq酶及dNTP（上海博尚生物技術有限公司）。PCR儀及DNA測序儀（A B公司，美國），GelDoc凝膠成像分析系統（Bio-Rad公司，美國），倒置顯微鏡及顯微鏡（OLYMPUS公司，日本），平板離心機（EPPENDORF公司，德國），手動輪轉切片機及烘片機（LEICA公司，德國），恒溫水浴箱（SHELLAB公司，美國），冰箱（青島Haier公司）。
1.2.3 DNA提取
79例肝癌組織標本經HE染色證實肝癌細胞的存在，并選取細胞密集區域的新鮮肝癌組織采用標準蛋白酶K消化法[4]提取DNA。
1.2.4 PIK3CA基因突變PCR實驗
①PCR反應體系：去離子水11.65μL；10×buffer 5μL；dNTP 1.6μL；上、下游引物各1μL；DNA模板5μL；Tap酶0.15μL；加去離子水至20μL。②循環參數：95℃預變性5 min后30個循環；56℃退火變性30 s，72℃延伸30 s，最后1個循環延伸5 min。③引物設計：見表 1。
表1
PCR擴增反應中PIK3CA基因引物序列及擴增片段長度
1.2.5 基因測序
本研究將79例肝癌組織基因組DNA進行序列測定，測序工作由上海生工生物工程公司完成。
1.3 療效判斷標準
79例患者腫瘤經手術切除后，均在筆者所在醫院放射科接受6個周期的放療，放療方案為常規分割放射，如2 Gy/次，1次/d，照射5次/周，總劑量為50～62 Gy。參考WHO實體瘤放化療療效標準[5-6]，并結合肝癌的病理學特點，制定如下改良的放療療效評定標準：①完全緩解（CR），影像學未發現腫瘤或腫瘤消失，癥狀、體征消失，維持≥4周；②部分緩解（PR），影像學暫未發現腫瘤或腫瘤消失，癥狀、體征部分消失，維持< 4周；③穩定（SD），臨床癥狀、體征等指標未見明顯改變；④進展（PD），影像學發現腫瘤，臨床癥狀、體征加重。
1.4 統計學方法
PIK3CA基因突變狀況與臨床病理參數的關系分析采用Pearson χ2檢驗，必要時采用Fisher確切概率法；預后分析采用Kaplan-Meier生存分析，所有數據均采用SPSS 20.0統計學軟件進行處理。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 PCR擴增電泳結果
本研究采用PCR技術對79例肝癌組織中PIK3CA基因的第9外顯子DNA進行擴增，PCR產物經2%的瓊脂糖電泳圖像如圖 1所示，圖中DNA電泳條帶清晰，邊緣完整、光滑。經確認，本研究所提取的79例肝癌組織標本DNA均無降解破裂，對后續研究影響較小，可以進行后續研究。
圖1
示肝癌組織PIK3CA基因PCR擴增電泳圖。1～8：肝癌組織；M：Marker
2.2 DNA測序結果
由PIK3CA基因第9外顯子測序結果發現：本組79例肝癌組織標本中，31例標本中發現雜合子突變的重疊異常峰圖，本組病例的PIK3CA基因第9外顯子突變率為39.24%。
2.3 PIK3CA基因突變與肝癌患者主要臨床病理參數的關系
結果見表 2。由表 2可見，在不同的年齡、性別、是否吸煙和飲酒以及不同的TNM分期間的PIK3CA基因第9外顯子突變率差異無統計學意義（P > 0.05）；而腫瘤系低分化且伴淋巴結轉移者的PIK3CA基因第9外顯子突變率明顯高于中-高分化及無淋巴結轉移者（P > 0.05）。
表2
PIK3CA基因第9外顯子突變與肝癌患者主要臨床病理參數的關系〔例（%）〕
2.4 PIK3CA基因第9外顯子突變對肝癌患者術后近期療效的影響
本組79例肝癌患者經手術切除腫瘤及術后施以6個周期的放療后，其近期（6個月）療效見表 3。由表 3可見，未突變組患者的近期療效優于突變組（Z=2.111，P=0.035）。
表3
PIK3CA基因第9外顯子突變對79例肝癌患者術后近期療效的影響〔例（%）〕
2.5 PIK3CA基因第9外顯子突變對肝癌患者預后的影響
本研究采用電話、門診復查等形式對79例患者進行了3年以上的隨訪，共有67例患者獲訪，12例患者失訪，其中突變組失訪4例，未突變組失訪8例。突變組患者總體生存時間1～52個月，中位生存時間19.41個月，3年累積生存率為33.33%；未突變組患者生存時間5～56個月，中位生存時間25.66個月，3年累積生存率為60.00%。2組患者的累積無瘤生存率及累積總體生存率的差異均具有統計學意義（P=0.030，P=0.012），突變組患者的累積無瘤生存率及累積總生存率均明顯低于未突變組患者。見圖 2。
圖2
PIK3CA基因第9外顯子突變組和未突變組的Kaplan-Meier生存曲線。2A：累積無瘤生存率；2B：累積總體生存率
3 討論
磷脂酞肌醇-3-激酶（PI3K）是脂類激酶的家族成員之一，有研究[6-7]結果表明，PI3K-AKT信號途徑具有重要的細胞調節功能，其參與細胞增殖、細胞活動及黏附、細胞分化、細胞胞內運輸等多種細胞相關過程。PIK3CA是PI3K催化亞單位。有文獻[8]報道，PIK3CA基因在卵巢癌等惡性腫瘤組織中呈過表達狀態，在結腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤呈高突變狀態，突變率可達40%。以往的研究結果[8-9]顯示，PIK3CA基因突變主要發生在第l外顯子（約占20%）、第9外顯子（約占50%）及20外顯子的特異性位點（約占30%）。但是上述結果仍有爭議，例如：有的研究[9-11]以肝癌組織為標本，在第1外顯子和第20外顯子并未發現PIK3CA基因突變。這提示在不同的腫瘤種類、不同地區等因素的影響下，PIK3CA基因突變的特點可能會發生改變。PIK3CA基因突變在腫瘤發生發展過程中起著重要的作用。本研究選取接受根治性手術治療的肝癌患者的肝癌組織標本，采用PCR法及DNA序列測定法對PIK3CA基因的第9外顯子進行突變篩查，分析PIK3CA基因突變率，并探討其對患者的近期療效及預后的影響，旨在為肝癌患者的早期臨床治療提供依據。
本研究對79例肝癌組織標本首先進行PCR實驗，以證實目的基因是否準確以及所提取DNA的純度和質量。本研究在DNA提取過程中，由專人在各環節均進行了嚴格的質量控制，故最終經PCR及電泳圖像確認，本研究所提取的DNA均無降解破裂，可以進行后續研究。為了提高研究效率，借鑒以往研究的經驗，本研究采用DNA序列測定法篩查PIK3CA基因的第9外顯子的突變狀況。結果顯示共有31例標本中發現雜合子突變的重疊異常的峰圖，即可以判斷為存在雜合子突變，其PIK3CA基因第9外顯子突變率為39.24%（31/79）。與國內外類似的研究[5, 12-14]報道基本相似。對于PIK3CA基因在肝癌組織中發生突變的機理目前并未十分明確，但有研究[15-16]認為可能與PI3K及其下游區激酶AKT的激活從而誘導了致癌基因的激活有關，上述激活方式主要包括：點突變、插入突變、堿基易位等。本研究所發現的突變主要為堿基易位。本研究結果顯示，PIK3CA基因第9外顯子突變率與肝癌的淋巴結轉移和腫瘤分化程度具有一定關系，提示PIK3CA基因突變、淋巴結轉移和病理分化可能共同參與了腫瘤的發生和發展過程。
PIK3CA基因突變對腫瘤療效與預后的影響尚未見報道。本研究探討了79例肝癌患者經手術和放療后的近期療效和3年生存率。結果顯示：PIK3CA基因突變對治療效果確實可以產生一定的影響，未突變組患者近期療效明顯優于突變組（P=0.035）；突變組的3年累積無瘤生存率和累積總體生存率均明顯低于未突變組（P=0.030，P=0.012）。該結果提示，上述效應可能與PIK3CA基因參與腫瘤細胞的增殖與分化的調控，從而加速了惡性腫瘤的發生和發展速度有關，進而影響了患者的生存時間與生存率[17-20]。
本研究只檢測了第9外顯子，突變率可能偏低，其突變還可能存在其他形式，但是本研究前瞻性地觀察到存在PIK3CA基因突變者其術后近期療效和預后均較差，這可能為探索肝癌的基因治療靶點提供新的思路。
