引用本文： 楊婷, 王凱峰, 孫瑤, 劉彥輝, 王瀚銳, 范東旭, 金松, 竇鵬揮, 劉彥東. 血管內皮生長因子聯合堿性成纖維細胞生長因子對大鼠后肢動脈硬化閉塞血管再生機制的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(8): 917-921. doi: 10.7507/1007-9424.20150239 復制
下肢動脈疾病是外科常見的致殘性疾病，靜息痛、皮膚潰瘍或壞疽是下肢缺血性疾病典型的臨床表現，以高發生率、高截肢率和高死亡率而嚴重影響著人們的生活質量[1-3]。目前針對下肢動脈疾病的主要治療手段是藥物、外科手術、腔內介入治療等[4-5]。但是對于遠端流出道嚴重狹窄的患者往往失去手術機會，目前還缺乏令人滿意的治療方法。本研究以大鼠后肢動脈閉塞模型來研究血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）聯合堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）協同促進血管再生的作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
SPF級雄性SD大鼠，購自大連醫科大學動物實驗中心，60只，3個月齡，體質量（260±30）g。按隨機數字表法分為4組分別進行治療：生理鹽水組（NS組）、bFGF組、VEGF組及VEGF+bFGF組。
1.2 主要試劑和儀器
氯胺酮、4.0%甲醛，福州邁新公司產品；重組人VEGF（rhVEGF）、重組人bFGF（rhbFGF），美國Sigma公司；電生理壓力測定儀、高速冷凍離心機，上海精密儀器儀表公司；PRISM 5700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀和SYBR Green PCR Master Mix，美國應用生物系統公司；DU-600紫外分光光度計和全自動凝膠電泳圖像分析系統，日本Olympus公司；Mini-Protean 3電泳系統和Mini Trans-Blot轉移系統，北航圖像中心；體式手術顯微鏡及顯微手術器械、TS-2000型脫色搖床，江蘇太倉實驗設備廠；蛋白濃度測定試劑、Trizol試劑、Fermentas K1622逆轉錄試劑、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、甘氨酸、β-actin兔抗鼠單克隆抗體，美國Sigma公司；其他試劑為國產分析純。
1.3 動物模型建立
用氯胺酮（50 mg/kg）肌肉注射麻醉，待大鼠麻醉后，固定于手術臺上。剪去后肢大腿及腹股溝部的毛，皮膚用強力碘和75%乙醇消毒，于雙側腹股溝處取一1 cm切口，在體式顯微鏡下鈍性分離包裹股靜脈、股動脈和股神經的動脈鞘。股動脈是淡紅色的，在內側；股靜脈顏色略深，居中間；最外側是股神經。利用顯微操作系統結扎并切斷股動脈各分支，將股動脈遠端近腘窩處連接電生理壓力測定儀測其內壓，在股動脈中下1/3處結扎使其內壓降至原內壓的1/5，查無出血點，縫合。
1.4 給藥方式
NS組、VEGF組隔天1次于腹腔內分別注射生理鹽水1 mL、100μg/L rhVEGF 1 mL；bFGF組隔天1次在后肢股內側多點肌肉注射100μg/L rhbFGF 1 mL；VEGF+bFGF組隔天1次于腹腔內注射100μg/L rhVEGF 1 mL+后肢股內側多點肌肉注射100μg/L rhbFGF 1 mL，共治療21 d。
1.5 股動脈造影
飼養至第30 d時，各大鼠肌肉注射氯胺酮（50 mg/kg）麻醉成功后固定于鼠板；常規術前準備，取下腹部正中切口5～7 cm，找到腹主動脈（腎動脈以下段）并剝離約2 cm，用5號頭皮針刺入，置于X光機下，加壓快速推入65%復方泛影葡胺6～10 mL拍片。
1.6 實驗取材
所有大鼠飼養至第3個月時將大鼠過量麻醉處死，取后肢股內側肌肉組織，PBS清洗，貼好標簽，凍存于-80℃冰箱中，用于Western blot和RT-PCR實驗檢測。
1.7 Western blot法檢測VEGF、bFGF蛋白表達情況
用RIPA裂解液進行蛋白質樣本制備，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行總蛋白定量，配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上樣，電泳，轉膜，封閉，一抗、二抗孵育，電化學發光免疫測定及圖像采集和Quantity One 4.5軟件半定量分析；以β-actin為內參進行數據標準化，以NS組為參照樣本，計算VEGF、bFGF蛋白的相對表達水平，實驗重復4次。
1.8 RT-PCR法檢測VEGF、bFGF mRNA表達情況
將大鼠組織勻漿、分離、離心，Trizol一步法提取總RNA，紫外分光光度計檢測mRNA純度并計算其濃度，以大鼠β-actin為內參，所有操作嚴格按照試劑盒說明書完成。RT-PCR擴增條件：95℃預變性35 s，然后95℃退火5 s，60℃延伸40 s，共35個循環。從GenBank上查得大鼠VEGF、bFGF和內參基因β-actin的基因序列全長，根據序列全長設計PCR引物，選用RT-PCR測試VEGF、bFGF mRNA的表達，β-actin作為內對照，設計引物如下：VEGF引物的上游為5?-TCATCAGACTGTGCCTCAG-3?，下游為5?-CACAGTAACAACGCTGGAAT-3?，片段大小486 bp，TaqMan探針為5?-CTAAGCTCCGTACACCATGTC-C-3?；bFGF引物的上游為5?-AACTGCAGATGCCA-GCCGGGAGCATC-3?, 下游為5?-ACGCGTCGACTA-AGCTCTTAGCAGACA-3?，片段大小136 bp，TaqMan探針為5?-CATCTGCCATGTAAGCTAAGCA-3?；β-actin引物的上游為5?-GAAGATCAAGATCATTG-CTCCT-3?，下游為5?-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3?，片段大小111 bp，TaqMan探針為5?-CTGTCCACCTTCCAGCAGA-3?。反應結束后，取5μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后以凝膠成像系統成像，并采用Quantity One 4.5軟件進行掃描半定量分析，以所測得樣品光密度積分與β-actin光密度積分的比值為樣本半定量值，實驗重復4次。
1.9 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件處理數據。計量數據用均數±標準差（
2 結果
2.1 股動脈造影檢查結果
股動脈造影結果顯示，各X射線片均顯示股動脈連續性中斷，遠端股動脈均顯影，并出現不同數量的側支循環血管（圖 1～4）。VEGF+bFGF組側支血管新生數為（10.25±1.006）條，明顯高于bFGF組的（6.29±0.957）條（P < 0.05）、VEGF組的（6.49±0.978）條（P < 0.05）及NS組的（4.15±0.876）條（P < 0.001），bFGF組和VEGF組也明顯高于NS組（P < 0.05），bFGF組和VEGF組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖1
VEGF+bFGF組，密集的新生血管，呈網狀，分別連接在中斷的股動脈之間??圖 2 VEGF組，較密集紊亂的新生血管??圖 3 bFGF組，較密集紊亂的新生血管??圖 4 NS組，少量的新生血管
2.2 Western blot檢測結果
Western blot檢測VEGF和bFGF蛋白表達的定性結果見圖 5，半定量結果見圖 6。從圖 6可見，VEGF和bFGF蛋白表達在VEGF+bFGF組均明顯高于NS組（P < 0.001），且明顯高于VEGF組（P < 0.001）和bFGF組（P < 0.001）；VEGF組和bFGF組組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖5
Western blot檢測VEGF和bFGF蛋白表達的定性結果??圖 6 Western blot檢測VEGF和bFGF蛋白表達的半定量結果。6A：VEGF；6B：bFGF。與NS組、VEGF組及bFGF組比較，*P < 0.001
2.3 RT-PCR檢測結果
RT-PCR檢測VEGF和bFGF mRNA表達的定性結果見圖 7，半定量結果見圖 8。VEGF和bFGF mRNA表達在VEGF+bFGF組明顯高于NS組（P < 0.001），且明顯高于VEGF組（P < 0.001）和bFGF組（P < 0.001）；VEGF組和bFGF組組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖7
RT-PCR檢測VEGF和bFGF mRNA表達的定性結果??圖 8 RT-PCR檢測VEGF和bFGF mRNA表達的半定量結果。8A：VEGF；8B：bFGF。與NS、VEGF組及bFGF組比較，* P < 0.001
3 討論
近年來，下肢動脈疾病的治療主要包括手術治療（動脈旁路轉流術[6]、大隱靜脈旁路轉流術、動靜脈轉流術等）、腔內介入治療[7-8]（包括經皮腔內血管成形術、支架置入術等）和非手術治療（干細胞治療[9-10]、藥物治療等），但均存在治療后再閉塞的問題[11]，尤其是對于遠端血管無流出道、多節段、長段閉塞、嚴重狹窄、膝下小動脈病變的患者尚無確切的治療方法；而非手術治療所用的藥物（抗凝、擴張血管、溶栓等藥物）效果均不理想。通過各種方法或手段促進缺血肢體新生血管生成和側支循環的建立，可能是治療此類患者有效的方法之一。
由于動脈狹窄或閉塞而引起組織、器官處于缺血狀態，機體會形成代償性的側支血管，此為生理性的血管新生[12]。血管新生療法[13]是指通過應用外源性血管生長因子，如VEGF、bFGF等或其基因，以促進缺血組織內血管新生和側支血管的形成，使缺血組織的缺血狀態獲得改善的治療方法。初步實驗[14-18]結果顯示，VEGF及bFGF可刺激新生血管的生成，但到目前為止還缺少大宗安慰劑對照、雙盲、大樣本病例的臨床研究。
bFGF和VEGF及其受體在正常肌肉及血管壁中極少表達或不表達；在缺血和缺氧下能促進其表達的增強，使局部內源性bFGF和VEGF表達增加，促進血管再生以適應缺血的變化，但非常緩慢，而且bFGF和VEGF增加的量不足且時間短暫，不能促使足夠的血管新生以改善缺血狀態[19-20]。因此，在缺血組織內適時適量地增加局部外源性bFGF和VEGF的量，將會加快血管新生的速度和加大血管新生的幅度，這可能成為一條新的治療缺血性疾病的途徑[21-22]。隨著rhbFGF和rhVEGF的出現，應用rhbFGF和rhVEGF治療下肢缺血性疾病更安全可靠。
在新的側支循環生長過程中bFGF對血管平滑肌的刺激作用強于VEGF，且bFGF有強烈的促進動脈生成的作用[23]。有研究[24-27]表明，動脈多次給予bFGF蛋白和靜脈多次給予bFGF蛋白均能促進血管新生，改善組織缺血狀態，且動脈給藥優于靜脈給藥。
本實驗在建立大鼠后肢動脈閉塞模型基礎上，采用安慰劑生理鹽水對照、雙盲法證明VEGF和bFGF聯合應用能促進大鼠缺血后肢側支血管新生，缺血狀態得到改善；血管造影顯示VEGF+bFGF組X射線片上均出現密集的新生血管，呈網狀，分別連接在中斷的股動脈之間；VEGF組、bFGF組顯示較密集紊亂的新生血管；NS組少量的側支血管；Western blot和RT-PCR結果均顯示，VEGF和bFGF蛋白和mRNA表達在VEGF+bFGF組均顯著高于NS組（P < 0.001），且明顯高于VEGF組（P < 0.001）和bFGF組（P < 0.001），VEGF組和bFGF組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。本實驗結果提示，應用外源性rhbFGF和rhVEGF蛋白可加快缺血組織內血管內皮細胞增殖，同時提高血管通透性和改變細胞外基質，從而促進血管的增殖，加快缺血組織內毛細血管的新生速度。
總之，VEGF和bFGF聯合應用能有效促進大鼠缺血后肢側支血管新生，為臨床治療下肢動脈疾病提供一種可能的新方法。
下肢動脈疾病是外科常見的致殘性疾病，靜息痛、皮膚潰瘍或壞疽是下肢缺血性疾病典型的臨床表現，以高發生率、高截肢率和高死亡率而嚴重影響著人們的生活質量[1-3]。目前針對下肢動脈疾病的主要治療手段是藥物、外科手術、腔內介入治療等[4-5]。但是對于遠端流出道嚴重狹窄的患者往往失去手術機會，目前還缺乏令人滿意的治療方法。本研究以大鼠后肢動脈閉塞模型來研究血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）聯合堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）協同促進血管再生的作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
SPF級雄性SD大鼠，購自大連醫科大學動物實驗中心，60只，3個月齡，體質量（260±30）g。按隨機數字表法分為4組分別進行治療：生理鹽水組（NS組）、bFGF組、VEGF組及VEGF+bFGF組。
1.2 主要試劑和儀器
氯胺酮、4.0%甲醛，福州邁新公司產品；重組人VEGF（rhVEGF）、重組人bFGF（rhbFGF），美國Sigma公司；電生理壓力測定儀、高速冷凍離心機，上海精密儀器儀表公司；PRISM 5700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀和SYBR Green PCR Master Mix，美國應用生物系統公司；DU-600紫外分光光度計和全自動凝膠電泳圖像分析系統，日本Olympus公司；Mini-Protean 3電泳系統和Mini Trans-Blot轉移系統，北航圖像中心；體式手術顯微鏡及顯微手術器械、TS-2000型脫色搖床，江蘇太倉實驗設備廠；蛋白濃度測定試劑、Trizol試劑、Fermentas K1622逆轉錄試劑、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、甘氨酸、β-actin兔抗鼠單克隆抗體，美國Sigma公司；其他試劑為國產分析純。
1.3 動物模型建立
用氯胺酮（50 mg/kg）肌肉注射麻醉，待大鼠麻醉后，固定于手術臺上。剪去后肢大腿及腹股溝部的毛，皮膚用強力碘和75%乙醇消毒，于雙側腹股溝處取一1 cm切口，在體式顯微鏡下鈍性分離包裹股靜脈、股動脈和股神經的動脈鞘。股動脈是淡紅色的，在內側；股靜脈顏色略深，居中間；最外側是股神經。利用顯微操作系統結扎并切斷股動脈各分支，將股動脈遠端近腘窩處連接電生理壓力測定儀測其內壓，在股動脈中下1/3處結扎使其內壓降至原內壓的1/5，查無出血點，縫合。
1.4 給藥方式
NS組、VEGF組隔天1次于腹腔內分別注射生理鹽水1 mL、100μg/L rhVEGF 1 mL；bFGF組隔天1次在后肢股內側多點肌肉注射100μg/L rhbFGF 1 mL；VEGF+bFGF組隔天1次于腹腔內注射100μg/L rhVEGF 1 mL+后肢股內側多點肌肉注射100μg/L rhbFGF 1 mL，共治療21 d。
1.5 股動脈造影
飼養至第30 d時，各大鼠肌肉注射氯胺酮（50 mg/kg）麻醉成功后固定于鼠板；常規術前準備，取下腹部正中切口5～7 cm，找到腹主動脈（腎動脈以下段）并剝離約2 cm，用5號頭皮針刺入，置于X光機下，加壓快速推入65%復方泛影葡胺6～10 mL拍片。
1.6 實驗取材
所有大鼠飼養至第3個月時將大鼠過量麻醉處死，取后肢股內側肌肉組織，PBS清洗，貼好標簽，凍存于-80℃冰箱中，用于Western blot和RT-PCR實驗檢測。
1.7 Western blot法檢測VEGF、bFGF蛋白表達情況
用RIPA裂解液進行蛋白質樣本制備，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行總蛋白定量，配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上樣，電泳，轉膜，封閉，一抗、二抗孵育，電化學發光免疫測定及圖像采集和Quantity One 4.5軟件半定量分析；以β-actin為內參進行數據標準化，以NS組為參照樣本，計算VEGF、bFGF蛋白的相對表達水平，實驗重復4次。
1.8 RT-PCR法檢測VEGF、bFGF mRNA表達情況
將大鼠組織勻漿、分離、離心，Trizol一步法提取總RNA，紫外分光光度計檢測mRNA純度并計算其濃度，以大鼠β-actin為內參，所有操作嚴格按照試劑盒說明書完成。RT-PCR擴增條件：95℃預變性35 s，然后95℃退火5 s，60℃延伸40 s，共35個循環。從GenBank上查得大鼠VEGF、bFGF和內參基因β-actin的基因序列全長，根據序列全長設計PCR引物，選用RT-PCR測試VEGF、bFGF mRNA的表達，β-actin作為內對照，設計引物如下：VEGF引物的上游為5?-TCATCAGACTGTGCCTCAG-3?，下游為5?-CACAGTAACAACGCTGGAAT-3?，片段大小486 bp，TaqMan探針為5?-CTAAGCTCCGTACACCATGTC-C-3?；bFGF引物的上游為5?-AACTGCAGATGCCA-GCCGGGAGCATC-3?, 下游為5?-ACGCGTCGACTA-AGCTCTTAGCAGACA-3?，片段大小136 bp，TaqMan探針為5?-CATCTGCCATGTAAGCTAAGCA-3?；β-actin引物的上游為5?-GAAGATCAAGATCATTG-CTCCT-3?，下游為5?-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3?，片段大小111 bp，TaqMan探針為5?-CTGTCCACCTTCCAGCAGA-3?。反應結束后，取5μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后以凝膠成像系統成像，并采用Quantity One 4.5軟件進行掃描半定量分析，以所測得樣品光密度積分與β-actin光密度積分的比值為樣本半定量值，實驗重復4次。
1.9 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件處理數據。計量數據用均數±標準差（
2 結果
2.1 股動脈造影檢查結果
股動脈造影結果顯示，各X射線片均顯示股動脈連續性中斷，遠端股動脈均顯影，并出現不同數量的側支循環血管（圖 1～4）。VEGF+bFGF組側支血管新生數為（10.25±1.006）條，明顯高于bFGF組的（6.29±0.957）條（P < 0.05）、VEGF組的（6.49±0.978）條（P < 0.05）及NS組的（4.15±0.876）條（P < 0.001），bFGF組和VEGF組也明顯高于NS組（P < 0.05），bFGF組和VEGF組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖1
VEGF+bFGF組，密集的新生血管，呈網狀，分別連接在中斷的股動脈之間??圖 2 VEGF組，較密集紊亂的新生血管??圖 3 bFGF組，較密集紊亂的新生血管??圖 4 NS組，少量的新生血管
2.2 Western blot檢測結果
Western blot檢測VEGF和bFGF蛋白表達的定性結果見圖 5，半定量結果見圖 6。從圖 6可見，VEGF和bFGF蛋白表達在VEGF+bFGF組均明顯高于NS組（P < 0.001），且明顯高于VEGF組（P < 0.001）和bFGF組（P < 0.001）；VEGF組和bFGF組組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖5
Western blot檢測VEGF和bFGF蛋白表達的定性結果??圖 6 Western blot檢測VEGF和bFGF蛋白表達的半定量結果。6A：VEGF；6B：bFGF。與NS組、VEGF組及bFGF組比較，*P < 0.001
2.3 RT-PCR檢測結果
RT-PCR檢測VEGF和bFGF mRNA表達的定性結果見圖 7，半定量結果見圖 8。VEGF和bFGF mRNA表達在VEGF+bFGF組明顯高于NS組（P < 0.001），且明顯高于VEGF組（P < 0.001）和bFGF組（P < 0.001）；VEGF組和bFGF組組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖7
RT-PCR檢測VEGF和bFGF mRNA表達的定性結果??圖 8 RT-PCR檢測VEGF和bFGF mRNA表達的半定量結果。8A：VEGF；8B：bFGF。與NS、VEGF組及bFGF組比較，* P < 0.001
3 討論
近年來，下肢動脈疾病的治療主要包括手術治療（動脈旁路轉流術[6]、大隱靜脈旁路轉流術、動靜脈轉流術等）、腔內介入治療[7-8]（包括經皮腔內血管成形術、支架置入術等）和非手術治療（干細胞治療[9-10]、藥物治療等），但均存在治療后再閉塞的問題[11]，尤其是對于遠端血管無流出道、多節段、長段閉塞、嚴重狹窄、膝下小動脈病變的患者尚無確切的治療方法；而非手術治療所用的藥物（抗凝、擴張血管、溶栓等藥物）效果均不理想。通過各種方法或手段促進缺血肢體新生血管生成和側支循環的建立，可能是治療此類患者有效的方法之一。
由于動脈狹窄或閉塞而引起組織、器官處于缺血狀態，機體會形成代償性的側支血管，此為生理性的血管新生[12]。血管新生療法[13]是指通過應用外源性血管生長因子，如VEGF、bFGF等或其基因，以促進缺血組織內血管新生和側支血管的形成，使缺血組織的缺血狀態獲得改善的治療方法。初步實驗[14-18]結果顯示，VEGF及bFGF可刺激新生血管的生成，但到目前為止還缺少大宗安慰劑對照、雙盲、大樣本病例的臨床研究。
bFGF和VEGF及其受體在正常肌肉及血管壁中極少表達或不表達；在缺血和缺氧下能促進其表達的增強，使局部內源性bFGF和VEGF表達增加，促進血管再生以適應缺血的變化，但非常緩慢，而且bFGF和VEGF增加的量不足且時間短暫，不能促使足夠的血管新生以改善缺血狀態[19-20]。因此，在缺血組織內適時適量地增加局部外源性bFGF和VEGF的量，將會加快血管新生的速度和加大血管新生的幅度，這可能成為一條新的治療缺血性疾病的途徑[21-22]。隨著rhbFGF和rhVEGF的出現，應用rhbFGF和rhVEGF治療下肢缺血性疾病更安全可靠。
在新的側支循環生長過程中bFGF對血管平滑肌的刺激作用強于VEGF，且bFGF有強烈的促進動脈生成的作用[23]。有研究[24-27]表明，動脈多次給予bFGF蛋白和靜脈多次給予bFGF蛋白均能促進血管新生，改善組織缺血狀態，且動脈給藥優于靜脈給藥。
本實驗在建立大鼠后肢動脈閉塞模型基礎上，采用安慰劑生理鹽水對照、雙盲法證明VEGF和bFGF聯合應用能促進大鼠缺血后肢側支血管新生，缺血狀態得到改善；血管造影顯示VEGF+bFGF組X射線片上均出現密集的新生血管，呈網狀，分別連接在中斷的股動脈之間；VEGF組、bFGF組顯示較密集紊亂的新生血管；NS組少量的側支血管；Western blot和RT-PCR結果均顯示，VEGF和bFGF蛋白和mRNA表達在VEGF+bFGF組均顯著高于NS組（P < 0.001），且明顯高于VEGF組（P < 0.001）和bFGF組（P < 0.001），VEGF組和bFGF組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。本實驗結果提示，應用外源性rhbFGF和rhVEGF蛋白可加快缺血組織內血管內皮細胞增殖，同時提高血管通透性和改變細胞外基質，從而促進血管的增殖，加快缺血組織內毛細血管的新生速度。
總之，VEGF和bFGF聯合應用能有效促進大鼠缺血后肢側支血管新生，為臨床治療下肢動脈疾病提供一種可能的新方法。
