引用本文： 程瑤, 張杰, 程南生, 熊先澤. 組織工程化膽管的研究現狀及展望. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(7): 879-883. doi: 10.7507/1007-9424.20150230 復制
膽管的主要功能是將肝臟分泌的膽汁運送至腸道。一旦膽管發生狹窄或缺損，膽管就不能正常運送膽汁，膽汁引流不暢會繼發膽道感染、肝膽管結石、癌變，這樣會形成一個惡性循環，周而復始，治療相當棘手，治療效果也不理想[1]。臨床迫切需要可用的膽管替代物材料來修復缺損或狹窄的膽管，并且能夠保存Oddi括約肌功能，使重建的膽道更符合正常膽管的解剖結構和生理功能，防止反流性膽管炎及相關并發癥。因此，尋找良好的膽管替代物，保留Oddi括約肌功能，成為肝膽外科基礎與臨床研究的熱點和重點。
20世紀80年代，一門以細胞生物學和材料科學相結合的新興學科—組織工程學逐漸興起[2-3]。近年來，已經有組織工程皮膚、血管、氣管、膀胱等應用于臨床的相關報道[4-8]。其中組織工程皮膚和血管已經被美國食品和藥物管理局（FDA）批準，批量化生產并用于臨床[4-5]。這些組織工程化器官的應用成果無形之中也推動了組織工程膽管的研究進程。國內外肝膽外科學者們借鑒組織工程血管的成功經驗，將組織工程技術應用到組織工程膽管的研究之中，取得了豐碩的研究成果。筆者將從支架材料、種子細胞來源及生長因子3個方面綜述近年組織工程化膽管的研究情況。
1 支架材料
支架材料是組織工程膽管的第一要素[9]。支架材料分為不可吸收材料、可降解生物衍生材料、可降解高分子合成材料、復合材料等。
1.1 不可吸收材料
不可吸收材料作為膽管替代物的研究處于人工膽管研究的初期。目前，文獻[10]報道的不可吸收材料包括鈷鉻鉬合金、滌綸和聚四氟乙烯。
聚四氟乙烯作為膽管替代物是目前研究和報道最多的不可吸收材料。1964年Hughes等[10]報道了采用聚四氟乙烯作為膽管替代物修補膽管缺損的動物實驗，發現該材料引起的炎癥反應輕，新生的膽管上皮能完全覆蓋人工膽管內表面，效果得到肯定。
膨體聚四氟乙烯用于制作人工膽管的研究卻頗有爭議。1982年Mendelowitz等[11]將膨體聚四氟乙烯用于修補動物膽管缺損，發現其順應性較差，出現扭轉和塌陷，動物出現不同程度的膽汁淤滯，因此膨體聚四氟乙烯曾被認為不適合作為膽管替代物。2002年Gómez等[12]在前人研究的基礎上，采用薄層氟化乙丙烯聚合物環狀加固膨體聚四氟乙烯作為膽管替代物，然后將其用于修補動物膽管缺損，實驗證實膽管沒有塌陷，通暢性好，解決了膽汁淤積問題。2005年Christensen團隊[13]、Amiranashvili團隊 [14]以及2011年Schanaider團隊[15]的3個動物實驗進一步證實了膨體聚四氟乙烯修補膽管缺損和膽管狹窄的可行性。與此同時，作者提醒膨體聚四氟乙烯用于治療膽管缺損和膽管狹窄應謹慎對待，因為可能會引起不同程度的并發癥，如膽管塌陷、膽汁淤積、膽管再狹窄等。
不可吸收材料作為膽管替代物有悠久的歷史，部分已經初步應用于臨床。但是不可吸收材料的不可降解性、疏水性等缺點決定了它在體內始終是異物，難免會引起炎癥排異反應，不利于周圍正常膽管組織爬行覆蓋，容易引起膽管阻塞及膽管再狹窄等并發癥。近年來，應用不可吸收材料行膽道修復與重建的文獻報道較來越少。
1.2 可降解天然生物材料
天然生物材料是一類具有三維立體多孔結構的材料。這類材料具有較高孔隙率和面積體積比，較大的表面積和空間有利于細胞的黏附生長、細胞外基質（ECM）的沉積、營養物質和氧的進入以及代謝產物的排出。組織工程研究常用的天然生物材料有小腸黏膜下層（SIS）、膠原、透明質酸、纖維蛋白膠、殼聚糖等[16]。
2002年Rosen等[16]首次將SIS應用于膽管缺損的修復與重建，有著里程碑似的意義。動物實驗納入了15只犬，9只犬建立2 cm×1 cm橢圓形膽管缺損，利用4層SIS補片修補，另外6只犬建立節段的膽管缺損，利用4層2～3 cm管狀SIS修補缺損。2周～5個月期間處死動物。結果發現：15只犬中14只存活至處死，1只犬由于手術縫合技術問題，術后發生膽管狹窄死亡。存活的14只犬中，膽道造影結果顯示膽道通暢，組織學檢測發現3個月時SIS完全降解，被新形成的膠原纖維替代，材料表面覆蓋了完整的膽管上皮。因此作者認為，SIS修復膽管損傷有良好的應用前景。與之相反，2004年Gómez等[17]的后續研究對Rosen等[16]的研究提出了質疑，認為用SIS修復膽管，可能會因為炎癥或者材料塌陷等原因繼發膽管再狹窄，提醒重視其并發癥發生率和安全性。之后，2006年Ong等[18]報道了1例用商品化的SIS（SURGISIS）二期修復膽管缺損的患者，取得了較為理想的臨床結果。這也是SIS用于膽管缺損修復的首個臨床病案報道。
膠原是另一類可降解天然生物材料。膠原的主要構成成分是蛋白質，普遍存在于哺乳動物體內，主要分布在皮膚、骨、肌腱、韌帶等處，是使用最多的天然支架材料。2015年，我國學者Tao等[19]將膠原材料應用于膽管缺損的修補，動物實驗納入了20頭豬，用片狀膠原材料修補梭形膽管缺損，膽管內放置內支撐管，周圍覆蓋大網膜。結果發現：所有動物均存活至處死，腹部彩超檢查顯示肝外膽管通暢無狹窄，部分動物手術部位膽管稍擴張，組織學檢查發現，2周時膠原材料開始降解，新生的血管、纖維組織和少量膽管黏膜開始長入膠原材料上，膽管全層有炎癥細胞浸潤；4周時膠原材料大部分降解，新生的血管和膽管上皮增多，炎癥細胞局限于上皮層；8周時膠原材料完全降解，炎癥細胞開始減少；12周時，炎癥基本消失，形成了類似于正常的膽管組織。因此作者認為，膠原材料能在3個月以內誘導膽管再生和修復。
可降解天然生物材料由于生物相容性好，存在于材料表面的大量生物信息有利于細胞的黏附、生長和增殖。不管是動物實驗還是臨床病案報道都取得較為理想的結果。但是天然可降解生物材料往往伸展性大，降解過程中力學性能不能維持，修復膽管后可能因為材料攣縮或塌陷導致膽管再狹窄，往往需要膽管內支撐管維持膽道通暢。因此，可降解天然生物材料應用于臨床膽管修復與重建之前還需要進一步優化。
1.3 可降解高分子合成材料
醫用高分子材料是指用于修復因損壞或病變而失去功能的人體組織和器官，以及在醫療診斷和治療中使用的高分子材料，常用的可降解高分子合成材料有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、聚羥基丁酸酯（PHB）、聚己內酯（PCL）等[20-23]。
日本學者Miyazawa等[20]和Aikawa等[21-23]報道了利用高分子技術，采用PLA和PCL的共聚物制作多孔管腔材料，再用PGA加固作為組織工程膽管的支架材料，材料在體內降解的時間設計為6～8周；從豬胸骨提取骨髓細胞，將骨髓細胞種植于組織工程膽管內表面，孵化1 h；以18頭豬為實驗對象，膽總管下段結扎，建立膽管橫斷缺損模型，利用該組織工程膽管行膽管移植，將一端與肝外膽管殘端吻合，另外一端與十二指腸吻合；將18頭豬分為2組，其中種植有骨髓細胞的組織工程膽管的12頭豬為實驗組，未種植骨髓細胞的組織工程膽管的6頭豬為對照組。結果實驗動物全部存活至處死。組織學檢查發現6個月時組織工程膽管被新生的組織完全替代，新生膽管基本類似于正常膽管；種植有骨髓細胞的實驗組和無骨髓細胞的對照組各方面沒有明顯差別。所以作者認為，這種可降解高分子材料制作的組織工程膽管可以作為正常膽管的替代物，材料上可以不用種植骨髓細胞。該研究開辟了組織工程膽管研究的新局面。Aikaw等[21-23]報道的后續3個研究側重點分別為改善吻合技術、防止腸液反流；保存Oddi括約肌的功能，片狀修復膽管缺損；以及管腔材料修復長段的肝外膽管缺損。綜合上述4個研究 [20-23]，該團隊[24-25]認為，這種可降解高分子合成材料能使缺損或狹窄的膽管再生，不產生膽汁漏、狹窄及排異反應，具有非常好的臨床應用價值。緊隨其后，Nau等[26]評估了其他可降解高分子材料（PGA和三亞甲基碳酸酯的共聚物）制作組織工程膽管的可行性，結果發現材料在6個月時完全降解，材料上不僅有新生血管，還有類似于正常膽管上皮的單層柱狀上皮細胞生長到材料上。
以上研究僅限于動物實驗，尚無臨床病案報道；已經為臨床使用的可降解高分子合成材料（如PLA），患者發生非特異性無菌性炎癥反應的比例較高；材料在降解過程中可能機械強度不能維持等。因此可降解高分子合成材料還需要不斷改進。
1.4 復合材料
復合材料是指由兩種或兩種以上不同性質的材料經過適當加工制備方法制得的多元復合體。各種材料在各種性能上互相取長補短，產生協同效應，從而擴大材料的應用范圍。
2007年Nakashima等[27]評估了膠原海綿和聚乙烯復合材料用于制作組織工程膽管的可行性。初期實驗研究選用9只犬，分為3組：第1組采用純膠原制成的組織工程膽管，內支撐放置2周后移除；第2組采用純膠原制成的組織工程膽管，內支撐放置12周；第3組采用膠原海綿和聚乙烯復合材料制成的組織工程膽管，內支撐放置2周。結果發現第1組由于支撐時間過短，材料力學不能維持，膽管狹窄導致動物死亡；第2組動物雖然沒有死亡，但是由于支撐管放置時間過長，材料上沒有新生的上皮覆蓋；第3組的結果最理想，膽道始終保持通暢，新生上皮組織和結締組織替代了缺損的膽管。因此研究者認為，膠原海綿和聚乙烯復合材料具有應用價值。后來，他們在此研究基礎上做了進一步實驗，用7只犬再次驗證復合材料的可行性[28]。
另一個團隊Pérez Alonso等[29]在2013年評價了膠原和瓊脂糖凝膠復合材料在組織工程膽管的應用價值。實驗研究選用50頭豬，其中實驗組用40頭豬建立膽總管缺損模型，移植復合材料制作的組織工程膽管，膽管內不放內支撐管；另外10頭豬僅行開關腹作為對照組。結果所有動物均存活至處死；膽道造影提示所有動物膽管均通暢，兩組實驗室檢查結果無明顯差別；組織學提示6個月時材料完全與宿主融為一體，界限不明顯，肉眼無法區分新生膽管和正常膽管。這是目前規模最大的動物實驗，研究者認為此種復合材料具有良好的臨床應用前景，但是由于觀察時間不夠長，需要后續類似研究證實這種復合材料的長期應用效果。
目前還沒有哪種單一材料能完全滿足組織工程膽管的需要。復合材料已經廣泛應用于航空航天、汽車工業、化工、紡織、機械制造等領域。相信復合材料在醫學領域，尤其在組織工程膽管研究方面會有越來越多的應用。
2 種子細胞
膽管上皮細胞呈單層柱狀排列，是一群十分嬌貴的內皮細胞。由于持續暴露于具有細胞毒性的膽汁中，十分容易遭受損傷。膽管一旦被橫斷損傷，由于缺乏血供，膽管很難完全再生修復，損傷部位往往是由纖維結締組織所替代[30]。在這種現狀下，膽管的修復過程中可能需要補充外源性或內源性的細胞，又稱種子細胞。近年來，干細胞作為種子細胞是組織工程的一大熱門研究[31]。干細胞是一類具有無限的或者永久的自我更新能力的細胞，能夠產生至少一種類型的、高度分化的子代細胞。2004～2005年期間，先后有科研工作者[32-34]將不同種類的干細胞體外誘導分化為肝細胞。借用這種思路，以Cardinale等[35-36]和Carpino等[37]為首的團隊發現，膽管組織自身存在成體干細胞，并成功將這種膽管來源的干細胞在體外誘導分化為膽管上皮細胞，為組織工程膽管種子細胞的研究開辟了新篇章。隨后，Zhou等[38]利用類似方法將豬骨髓間充質干細胞成功誘導分化為膽管上皮樣細胞，并將膽管上皮樣細胞與PGA制成的納米纖維膜復合培養，結果發現膽管上皮樣細胞在納米纖維膜上一直保持良好的增殖活性。早在2003年，Barralet等[39]也做過類似的研究，將人膽管上皮細胞和PGA/PCL共聚物在體外復合培養，膽管上皮細胞的活性從8周提高到6個月。但是，以上研究均是體外研究。前面提及，Miyazawa等[20]將豬胸骨提取的骨髓細胞種植到組織工程膽管上，孵化1 h后移植到動物體內，結果發現種植有骨髓細胞的實驗組和無骨髓細胞的對照組沒有明顯差別。分析原因可能有二：一是細胞與材料復合時間太短，細胞沒有牢固附著于材料之上，膽汁可能把大部分細胞沖刷至腸道；二是種子細胞沒有形成完整的上皮組織，無法抵御具有細胞毒性的膽汁的浸泡，種子細胞可能在短期內死亡。為解決這兩個問題，2009年Ismail等[40]做了一個有趣的實驗，將人的羊膜修復犬的膽管缺損，發現羊膜上的干細胞能有效預防膽汁漏，帶血管蒂的羊膜修復膽管缺損效果更佳，處死動物發現羊膜上有膽管上皮生長。依此推測羊膜具有很好的修復膽管缺損的價值，但是該實驗沒有闡述膽管上皮細胞來源于羊膜干細胞還是來源于動物自身干細胞。
種子細胞是組織工程膽管研究的重要組成部分，不同于組織工程血管的是，組織工程膽管的種子細胞需要耐受膽汁的浸泡，所以在移植進入體內之前就應該在體外用活細胞構建一種新的具有屏障功能的組織，如果能解決組織工程膽管表面覆膜的問題，將會為膽管缺損和膽管狹窄的治療帶來全新的治療理念和潛在的治療措施。
3 生長因子
生長因子是通過細胞質膜上特異的受體，將信息傳遞至細胞內部，調節細胞生長與增殖的多肽類物質。它是一類具有刺激細胞生長能力的細胞因子 [41]。常用于組織工程的生長因子有轉化生長因子、表皮生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子、神經生長因子、血管內皮細胞生長因子等[41]。多種生長因子已經被證實參與肝臟和血管的再生與修復 [42-43]。我國學者Li等[44]研究探討了成纖維細胞生長因子在膽管修復與重建過程中的作用。實驗納入38頭豬，用膠原制成的補片修補膽管梭形缺損，根據是否在材料上錨定生長因子將動物分為3組，分別為生長因子組14頭、不加生長因子組12頭和假手術組12頭。結果發現生長因子組的膠原材料在降解時間、膽管上皮生成、血管生成等方面顯著優于不加生長因子組，因此認為成纖維細胞生長因子能促進膽管的修復與再生。
生長因子的使用是一把雙刃劍，若使用不當，可能引起細胞的惡性轉化，長期應用生長因子具有安全隱患。另外，生長因子受微環境影響失活較快，作用時間短，如何保證生長因子體內外的持續高效釋放值得進一步研究。再有，外源性生長因子加入的最佳作用濃度和時間，以及是否對其他因子的旁分泌、內分泌有影響等問題還有待解決。因此，生長因子應用于組織工程膽管前景很好，但是路還很漫長。
4 小結
人工膽管經歷了70多年的發展，飽含了世界各地無數肝膽外科醫生的心血。由于膽管解剖和生理功能的特殊性，人工膽管的研究還遠遠落后與人工血管的研究。關于組織工程化膽管的研究已然成為當下的熱點，隨著材料科學和細胞生物學的飛速發展，組織工程化膽管的基礎研究和臨床應用將會得到更加深入的研究和推廣，有希望為膽管缺損和膽管狹窄的患者帶來全新治療理念和治療措施，進而造福人類。組織工程化膽管的研究目前還受到多個方面包括技術和認識深度的限制，還有很多的問題和缺陷仍然需要深入研究和不斷完善和改進，我們應對組織工程膽管未來的發展保持謹慎而樂觀的態度。
膽管的主要功能是將肝臟分泌的膽汁運送至腸道。一旦膽管發生狹窄或缺損，膽管就不能正常運送膽汁，膽汁引流不暢會繼發膽道感染、肝膽管結石、癌變，這樣會形成一個惡性循環，周而復始，治療相當棘手，治療效果也不理想[1]。臨床迫切需要可用的膽管替代物材料來修復缺損或狹窄的膽管，并且能夠保存Oddi括約肌功能，使重建的膽道更符合正常膽管的解剖結構和生理功能，防止反流性膽管炎及相關并發癥。因此，尋找良好的膽管替代物，保留Oddi括約肌功能，成為肝膽外科基礎與臨床研究的熱點和重點。
20世紀80年代，一門以細胞生物學和材料科學相結合的新興學科—組織工程學逐漸興起[2-3]。近年來，已經有組織工程皮膚、血管、氣管、膀胱等應用于臨床的相關報道[4-8]。其中組織工程皮膚和血管已經被美國食品和藥物管理局（FDA）批準，批量化生產并用于臨床[4-5]。這些組織工程化器官的應用成果無形之中也推動了組織工程膽管的研究進程。國內外肝膽外科學者們借鑒組織工程血管的成功經驗，將組織工程技術應用到組織工程膽管的研究之中，取得了豐碩的研究成果。筆者將從支架材料、種子細胞來源及生長因子3個方面綜述近年組織工程化膽管的研究情況。
1 支架材料
支架材料是組織工程膽管的第一要素[9]。支架材料分為不可吸收材料、可降解生物衍生材料、可降解高分子合成材料、復合材料等。
1.1 不可吸收材料
不可吸收材料作為膽管替代物的研究處于人工膽管研究的初期。目前，文獻[10]報道的不可吸收材料包括鈷鉻鉬合金、滌綸和聚四氟乙烯。
聚四氟乙烯作為膽管替代物是目前研究和報道最多的不可吸收材料。1964年Hughes等[10]報道了采用聚四氟乙烯作為膽管替代物修補膽管缺損的動物實驗，發現該材料引起的炎癥反應輕，新生的膽管上皮能完全覆蓋人工膽管內表面，效果得到肯定。
膨體聚四氟乙烯用于制作人工膽管的研究卻頗有爭議。1982年Mendelowitz等[11]將膨體聚四氟乙烯用于修補動物膽管缺損，發現其順應性較差，出現扭轉和塌陷，動物出現不同程度的膽汁淤滯，因此膨體聚四氟乙烯曾被認為不適合作為膽管替代物。2002年Gómez等[12]在前人研究的基礎上，采用薄層氟化乙丙烯聚合物環狀加固膨體聚四氟乙烯作為膽管替代物，然后將其用于修補動物膽管缺損，實驗證實膽管沒有塌陷，通暢性好，解決了膽汁淤積問題。2005年Christensen團隊[13]、Amiranashvili團隊 [14]以及2011年Schanaider團隊[15]的3個動物實驗進一步證實了膨體聚四氟乙烯修補膽管缺損和膽管狹窄的可行性。與此同時，作者提醒膨體聚四氟乙烯用于治療膽管缺損和膽管狹窄應謹慎對待，因為可能會引起不同程度的并發癥，如膽管塌陷、膽汁淤積、膽管再狹窄等。
不可吸收材料作為膽管替代物有悠久的歷史，部分已經初步應用于臨床。但是不可吸收材料的不可降解性、疏水性等缺點決定了它在體內始終是異物，難免會引起炎癥排異反應，不利于周圍正常膽管組織爬行覆蓋，容易引起膽管阻塞及膽管再狹窄等并發癥。近年來，應用不可吸收材料行膽道修復與重建的文獻報道較來越少。
1.2 可降解天然生物材料
天然生物材料是一類具有三維立體多孔結構的材料。這類材料具有較高孔隙率和面積體積比，較大的表面積和空間有利于細胞的黏附生長、細胞外基質（ECM）的沉積、營養物質和氧的進入以及代謝產物的排出。組織工程研究常用的天然生物材料有小腸黏膜下層（SIS）、膠原、透明質酸、纖維蛋白膠、殼聚糖等[16]。
2002年Rosen等[16]首次將SIS應用于膽管缺損的修復與重建，有著里程碑似的意義。動物實驗納入了15只犬，9只犬建立2 cm×1 cm橢圓形膽管缺損，利用4層SIS補片修補，另外6只犬建立節段的膽管缺損，利用4層2～3 cm管狀SIS修補缺損。2周～5個月期間處死動物。結果發現：15只犬中14只存活至處死，1只犬由于手術縫合技術問題，術后發生膽管狹窄死亡。存活的14只犬中，膽道造影結果顯示膽道通暢，組織學檢測發現3個月時SIS完全降解，被新形成的膠原纖維替代，材料表面覆蓋了完整的膽管上皮。因此作者認為，SIS修復膽管損傷有良好的應用前景。與之相反，2004年Gómez等[17]的后續研究對Rosen等[16]的研究提出了質疑，認為用SIS修復膽管，可能會因為炎癥或者材料塌陷等原因繼發膽管再狹窄，提醒重視其并發癥發生率和安全性。之后，2006年Ong等[18]報道了1例用商品化的SIS（SURGISIS）二期修復膽管缺損的患者，取得了較為理想的臨床結果。這也是SIS用于膽管缺損修復的首個臨床病案報道。
膠原是另一類可降解天然生物材料。膠原的主要構成成分是蛋白質，普遍存在于哺乳動物體內，主要分布在皮膚、骨、肌腱、韌帶等處，是使用最多的天然支架材料。2015年，我國學者Tao等[19]將膠原材料應用于膽管缺損的修補，動物實驗納入了20頭豬，用片狀膠原材料修補梭形膽管缺損，膽管內放置內支撐管，周圍覆蓋大網膜。結果發現：所有動物均存活至處死，腹部彩超檢查顯示肝外膽管通暢無狹窄，部分動物手術部位膽管稍擴張，組織學檢查發現，2周時膠原材料開始降解，新生的血管、纖維組織和少量膽管黏膜開始長入膠原材料上，膽管全層有炎癥細胞浸潤；4周時膠原材料大部分降解，新生的血管和膽管上皮增多，炎癥細胞局限于上皮層；8周時膠原材料完全降解，炎癥細胞開始減少；12周時，炎癥基本消失，形成了類似于正常的膽管組織。因此作者認為，膠原材料能在3個月以內誘導膽管再生和修復。
可降解天然生物材料由于生物相容性好，存在于材料表面的大量生物信息有利于細胞的黏附、生長和增殖。不管是動物實驗還是臨床病案報道都取得較為理想的結果。但是天然可降解生物材料往往伸展性大，降解過程中力學性能不能維持，修復膽管后可能因為材料攣縮或塌陷導致膽管再狹窄，往往需要膽管內支撐管維持膽道通暢。因此，可降解天然生物材料應用于臨床膽管修復與重建之前還需要進一步優化。
1.3 可降解高分子合成材料
醫用高分子材料是指用于修復因損壞或病變而失去功能的人體組織和器官，以及在醫療診斷和治療中使用的高分子材料，常用的可降解高分子合成材料有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、聚羥基丁酸酯（PHB）、聚己內酯（PCL）等[20-23]。
日本學者Miyazawa等[20]和Aikawa等[21-23]報道了利用高分子技術，采用PLA和PCL的共聚物制作多孔管腔材料，再用PGA加固作為組織工程膽管的支架材料，材料在體內降解的時間設計為6～8周；從豬胸骨提取骨髓細胞，將骨髓細胞種植于組織工程膽管內表面，孵化1 h；以18頭豬為實驗對象，膽總管下段結扎，建立膽管橫斷缺損模型，利用該組織工程膽管行膽管移植，將一端與肝外膽管殘端吻合，另外一端與十二指腸吻合；將18頭豬分為2組，其中種植有骨髓細胞的組織工程膽管的12頭豬為實驗組，未種植骨髓細胞的組織工程膽管的6頭豬為對照組。結果實驗動物全部存活至處死。組織學檢查發現6個月時組織工程膽管被新生的組織完全替代，新生膽管基本類似于正常膽管；種植有骨髓細胞的實驗組和無骨髓細胞的對照組各方面沒有明顯差別。所以作者認為，這種可降解高分子材料制作的組織工程膽管可以作為正常膽管的替代物，材料上可以不用種植骨髓細胞。該研究開辟了組織工程膽管研究的新局面。Aikaw等[21-23]報道的后續3個研究側重點分別為改善吻合技術、防止腸液反流；保存Oddi括約肌的功能，片狀修復膽管缺損；以及管腔材料修復長段的肝外膽管缺損。綜合上述4個研究 [20-23]，該團隊[24-25]認為，這種可降解高分子合成材料能使缺損或狹窄的膽管再生，不產生膽汁漏、狹窄及排異反應，具有非常好的臨床應用價值。緊隨其后，Nau等[26]評估了其他可降解高分子材料（PGA和三亞甲基碳酸酯的共聚物）制作組織工程膽管的可行性，結果發現材料在6個月時完全降解，材料上不僅有新生血管，還有類似于正常膽管上皮的單層柱狀上皮細胞生長到材料上。
以上研究僅限于動物實驗，尚無臨床病案報道；已經為臨床使用的可降解高分子合成材料（如PLA），患者發生非特異性無菌性炎癥反應的比例較高；材料在降解過程中可能機械強度不能維持等。因此可降解高分子合成材料還需要不斷改進。
1.4 復合材料
復合材料是指由兩種或兩種以上不同性質的材料經過適當加工制備方法制得的多元復合體。各種材料在各種性能上互相取長補短，產生協同效應，從而擴大材料的應用范圍。
2007年Nakashima等[27]評估了膠原海綿和聚乙烯復合材料用于制作組織工程膽管的可行性。初期實驗研究選用9只犬，分為3組：第1組采用純膠原制成的組織工程膽管，內支撐放置2周后移除；第2組采用純膠原制成的組織工程膽管，內支撐放置12周；第3組采用膠原海綿和聚乙烯復合材料制成的組織工程膽管，內支撐放置2周。結果發現第1組由于支撐時間過短，材料力學不能維持，膽管狹窄導致動物死亡；第2組動物雖然沒有死亡，但是由于支撐管放置時間過長，材料上沒有新生的上皮覆蓋；第3組的結果最理想，膽道始終保持通暢，新生上皮組織和結締組織替代了缺損的膽管。因此研究者認為，膠原海綿和聚乙烯復合材料具有應用價值。后來，他們在此研究基礎上做了進一步實驗，用7只犬再次驗證復合材料的可行性[28]。
另一個團隊Pérez Alonso等[29]在2013年評價了膠原和瓊脂糖凝膠復合材料在組織工程膽管的應用價值。實驗研究選用50頭豬，其中實驗組用40頭豬建立膽總管缺損模型，移植復合材料制作的組織工程膽管，膽管內不放內支撐管；另外10頭豬僅行開關腹作為對照組。結果所有動物均存活至處死；膽道造影提示所有動物膽管均通暢，兩組實驗室檢查結果無明顯差別；組織學提示6個月時材料完全與宿主融為一體，界限不明顯，肉眼無法區分新生膽管和正常膽管。這是目前規模最大的動物實驗，研究者認為此種復合材料具有良好的臨床應用前景，但是由于觀察時間不夠長，需要后續類似研究證實這種復合材料的長期應用效果。
目前還沒有哪種單一材料能完全滿足組織工程膽管的需要。復合材料已經廣泛應用于航空航天、汽車工業、化工、紡織、機械制造等領域。相信復合材料在醫學領域，尤其在組織工程膽管研究方面會有越來越多的應用。
2 種子細胞
膽管上皮細胞呈單層柱狀排列，是一群十分嬌貴的內皮細胞。由于持續暴露于具有細胞毒性的膽汁中，十分容易遭受損傷。膽管一旦被橫斷損傷，由于缺乏血供，膽管很難完全再生修復，損傷部位往往是由纖維結締組織所替代[30]。在這種現狀下，膽管的修復過程中可能需要補充外源性或內源性的細胞，又稱種子細胞。近年來，干細胞作為種子細胞是組織工程的一大熱門研究[31]。干細胞是一類具有無限的或者永久的自我更新能力的細胞，能夠產生至少一種類型的、高度分化的子代細胞。2004～2005年期間，先后有科研工作者[32-34]將不同種類的干細胞體外誘導分化為肝細胞。借用這種思路，以Cardinale等[35-36]和Carpino等[37]為首的團隊發現，膽管組織自身存在成體干細胞，并成功將這種膽管來源的干細胞在體外誘導分化為膽管上皮細胞，為組織工程膽管種子細胞的研究開辟了新篇章。隨后，Zhou等[38]利用類似方法將豬骨髓間充質干細胞成功誘導分化為膽管上皮樣細胞，并將膽管上皮樣細胞與PGA制成的納米纖維膜復合培養，結果發現膽管上皮樣細胞在納米纖維膜上一直保持良好的增殖活性。早在2003年，Barralet等[39]也做過類似的研究，將人膽管上皮細胞和PGA/PCL共聚物在體外復合培養，膽管上皮細胞的活性從8周提高到6個月。但是，以上研究均是體外研究。前面提及，Miyazawa等[20]將豬胸骨提取的骨髓細胞種植到組織工程膽管上，孵化1 h后移植到動物體內，結果發現種植有骨髓細胞的實驗組和無骨髓細胞的對照組沒有明顯差別。分析原因可能有二：一是細胞與材料復合時間太短，細胞沒有牢固附著于材料之上，膽汁可能把大部分細胞沖刷至腸道；二是種子細胞沒有形成完整的上皮組織，無法抵御具有細胞毒性的膽汁的浸泡，種子細胞可能在短期內死亡。為解決這兩個問題，2009年Ismail等[40]做了一個有趣的實驗，將人的羊膜修復犬的膽管缺損，發現羊膜上的干細胞能有效預防膽汁漏，帶血管蒂的羊膜修復膽管缺損效果更佳，處死動物發現羊膜上有膽管上皮生長。依此推測羊膜具有很好的修復膽管缺損的價值，但是該實驗沒有闡述膽管上皮細胞來源于羊膜干細胞還是來源于動物自身干細胞。
種子細胞是組織工程膽管研究的重要組成部分，不同于組織工程血管的是，組織工程膽管的種子細胞需要耐受膽汁的浸泡，所以在移植進入體內之前就應該在體外用活細胞構建一種新的具有屏障功能的組織，如果能解決組織工程膽管表面覆膜的問題，將會為膽管缺損和膽管狹窄的治療帶來全新的治療理念和潛在的治療措施。
3 生長因子
生長因子是通過細胞質膜上特異的受體，將信息傳遞至細胞內部，調節細胞生長與增殖的多肽類物質。它是一類具有刺激細胞生長能力的細胞因子 [41]。常用于組織工程的生長因子有轉化生長因子、表皮生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子、神經生長因子、血管內皮細胞生長因子等[41]。多種生長因子已經被證實參與肝臟和血管的再生與修復 [42-43]。我國學者Li等[44]研究探討了成纖維細胞生長因子在膽管修復與重建過程中的作用。實驗納入38頭豬，用膠原制成的補片修補膽管梭形缺損，根據是否在材料上錨定生長因子將動物分為3組，分別為生長因子組14頭、不加生長因子組12頭和假手術組12頭。結果發現生長因子組的膠原材料在降解時間、膽管上皮生成、血管生成等方面顯著優于不加生長因子組，因此認為成纖維細胞生長因子能促進膽管的修復與再生。
生長因子的使用是一把雙刃劍，若使用不當，可能引起細胞的惡性轉化，長期應用生長因子具有安全隱患。另外，生長因子受微環境影響失活較快，作用時間短，如何保證生長因子體內外的持續高效釋放值得進一步研究。再有，外源性生長因子加入的最佳作用濃度和時間，以及是否對其他因子的旁分泌、內分泌有影響等問題還有待解決。因此，生長因子應用于組織工程膽管前景很好，但是路還很漫長。
4 小結
人工膽管經歷了70多年的發展，飽含了世界各地無數肝膽外科醫生的心血。由于膽管解剖和生理功能的特殊性，人工膽管的研究還遠遠落后與人工血管的研究。關于組織工程化膽管的研究已然成為當下的熱點，隨著材料科學和細胞生物學的飛速發展，組織工程化膽管的基礎研究和臨床應用將會得到更加深入的研究和推廣，有希望為膽管缺損和膽管狹窄的患者帶來全新治療理念和治療措施，進而造福人類。組織工程化膽管的研究目前還受到多個方面包括技術和認識深度的限制，還有很多的問題和缺陷仍然需要深入研究和不斷完善和改進，我們應對組織工程膽管未來的發展保持謹慎而樂觀的態度。