引用本文： 韓鴻彬, 李朝輝, 劉帥鋒, 董帥軍. 胃癌患者外周血循環腫瘤細胞檢測及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(7): 840-843. doi: 10.7507/1007-9424.20150217 復制
胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升趨勢，死亡率居惡性腫瘤死因的第3位[1]，大多死于術后轉移與復發，嚴重危害人類健康。循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是由腫瘤組織脫離并進入血液循環系統的腫瘤細胞，是導致腫瘤復發、轉移的關鍵，血液循環中的腫瘤細胞具有原發灶內的腫瘤細胞學和基因遺傳學特征[2]。因此，CTCs是評估腫瘤發生發展狀態以及臨床預后的主要方法之一，而目前對胃癌的CTCs檢測和評價的研究較少。本研究通過免疫磁珠負性富集和免疫熒光染色技術檢測胃癌患者和胃良性疾病患者外周血CTCs的情況，旨在探討CTCs在胃癌患者中的表達及其臨床意義。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取2011年9月至2013年9月期間在鄭州大學附屬洛陽中心醫院經病理學檢查證實的60例胃癌患者為研究對象。其中男36例，女24例；年齡28～80歲，中位年齡65歲；依據美國癌癥聯合會（AJCC）第7版胃癌TNM分期[3]：Ⅰ期11例，Ⅱ期14例，Ⅲ期20例，Ⅳ期15例；腫瘤直徑：<3 cm 28例，≥3 cm 32例；腫瘤分化程度：低分化31例，中-高分化29例；發生遠處轉移29例，無遠處轉移31例；29例有脈管侵犯，31例無脈管侵犯。另外選取同期40例胃良性疾病患者作為對照。其中男22例，女18例；年齡30～80歲，中位年齡62歲；疾病類型：胃潰瘍21例，慢性胃炎19例。胃癌組納入標準：①排除其他惡性腫瘤；②術前未行放化療及其他治療；③病理類型為腺癌。2組患者經過全面細致的檢查后均未發現其他重大疾病，且在年齡及性別方面的差異也無統計學意義（P<0.05），具有可比性。
1.2 方法
應用專用的Cellsave管采集研究對象肘正中靜脈血7.5 mL，通過CellTracks AutoPrep系統（美國強生Veridex公司）進行標本預處理，設置相應參數，儀器會對血樣進行固定、染色、清洗等全自動操作。處理后的樣品自動轉入MagNest裝置中避光孵育，最后移入CellTracks AutoPrep系統進行熒光掃描，系統根據CTCs免疫熒光染色規定的判讀標準對結果進行判讀。
1.3 CTCs陽性判定標準
①形態學標準：光鏡下見有完整的細胞核，細胞呈圓形、橢圓形或長形，細胞長徑>10 μm。②熒光顯微鏡下陽性細胞的判定標準：細胞核對應的CEP8信號點>2個，且無血緣性白細胞表面抗原紅圈著色記為1個陽性細胞。CTCs陽性的界定值參照文獻[4]的標準，以CTCs≥1個即為陽性。
1.4 統計學方法
統計分析采用15.0軟件包完成，計數資料分析采用確切概率法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 胃癌組及對照組CTCs檢測結果
對照組有3例患者外周血中檢出CTCs，陽性率為7.5% （3/40），而胃癌組中共有42例患者外周血檢出CTCs，陽性率為70.0% （42/60），胃癌組外周血CTCs陽性率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2 胃癌患者CTCs檢出結果與其臨床病理特征的關系
胃癌患者CTCs檢出結果與患者性別、年齡、N分期、遠處轉移、腫瘤大小及脈管侵犯無關（P>0.05），而與腫瘤的TNM分期和腫瘤分化程度有關（P<0.05）。見表 1。
表1
胃癌患者CTCs檢出結果與其臨床病理特征的關系
2.3 胃癌患者CTCs檢測結果與其預后的關系
對本組60例胃癌患者術后進行隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪時間為術后6、12及18個月，共有58例獲隨訪,隨訪率為96.7%。其中CTCs陽性者術后12個月生存率為78.6%，陰性者為100%；術后18個月CTCs陽性者生存率為71.4%，陰性者為94.4%，2組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
CTCs陽性及陰性胃癌者術后生存率比較
3 討論
目前，胃癌根治術仍是胃癌的主要治療方式之一，但術后轉移和復發率依舊很高，腫瘤部位、浸潤深度、淋巴結轉移和術后輔助化療是胃癌的獨立預后因素[5]。腫瘤細胞在淋巴結、外周血、骨髓等中的微轉移可能正是惡性腫瘤轉移和復發的基礎。微轉移指存在于淋巴結、外周血及骨髓中不能被常規手段檢測到的腫瘤細胞[6]。其中存在于血循環中的微轉移即為CTCs，進入血液的腫瘤細胞大部分被自身的免疫系統及血液的剪切作用而發生凋亡或死亡[7-8]，僅有極少數具有高度活力或高度轉移潛能的腫瘤細胞在循環系統中得以生存，相互聚集或分裂增殖形成微小癌栓，并在一定條件下再次脫離循環系統，進入組織內發展為遠處轉移灶[9-10]。現已在乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤中找到了CSCs存在的證據[11]。有關CTCs與乳腺癌、胃癌、結腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤的研究顯示，CTCs可以有效預測腫瘤的復發轉移及預后情況，同時可以作為預測相關輔助治療療效的評判標準[12-14]。CTCs將可能成為預測復發、評估預后，以及指導治療的有效工具，其在臨床應用的巨大價值正受到人們的關注。
目前CTCs的檢測方法較多，但每種方法均有局限性。CellSearch系統是目前自動化程度最高的CTCs檢測技術，Cellsearch法作為唯一被美國食品及藥物管理局（FDA）批準的可在臨床檢測中使用的CTC枚舉計數法，已被許多研究證實有著較高的敏感度和特異性，可以檢測到血液中低濃度的CTC （1 CTC/7.5 mL血液）[15-16]。臨床研究[17-18]表明，CTCs陽性的胃癌患者遠處轉移及復發的概率明顯增高；也有研究[19-20]發現，胃癌CTCs高陽性率者比CTCs低陽性率者的預后更差，且生存期更短。Matsusaka等 [21]報道，外周血中CTCs數量越多，腫瘤細胞轉移的負荷越大，發生轉移的可能性也就越大。Yie等[22]采用RT-PCR和ELISA方法檢測55例胃癌患者外周血中survivin陽性的CTCs，檢出率為45.4%，并發現其與腫瘤浸潤深度及分期明顯相關。Uenosono等[23]隨訪251例胃癌患者，發現≥1個CTC/7.5 mL的患者的總生存期和無進展生存，均較陰性者預后差，是患者生存率的獨立預測因子。腫瘤分期越晚，CTCs的檢出率越高。但有研究[24-25]顯示，CTCs陽性率與T分期無關。最新的在轉移性結直腸癌患者的研究[26-27]中發現，血流中有少于3個CTCs的患者與血流中有多于3個CTCs的患者相比，其總體生存率有明顯提高。本研究中40例胃良性疾病對照組中CTCs的檢出率為7.5%，考慮不排除由于技術原因引起的假陽性結果；在60例胃癌患者中有42例檢出CTCs，檢出率為70.0%，提示本研究采用的檢測方法具有較高的敏感性。本研究結果還發現，胃癌患者CTCs的檢出結果與患者性別、年齡、N分期、遠處轉移、腫瘤大小及脈管侵犯均無關（P>0.05），而與腫瘤的TNM分期及分化程度有關（P<0.05）；CTCs檢出陰性的胃癌患者與陽性者比較，其預后較好（P<0.05）。該結果提示，CTCs可作為判斷胃癌患者疾病進展程度及預后評估的參考指標。
綜上所述，CTCs與胃癌的發生發展及轉移有關，具有潛在臨床應用價值,可幫助指導臨床設計更有效的治療方案，從而延長患者的生存期，提高生存率。然而，各項研究結果仍存在分歧和矛盾，還需進行大樣本及規范的長期隨訪研究來驗證。
胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升趨勢，死亡率居惡性腫瘤死因的第3位[1]，大多死于術后轉移與復發，嚴重危害人類健康。循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是由腫瘤組織脫離并進入血液循環系統的腫瘤細胞，是導致腫瘤復發、轉移的關鍵，血液循環中的腫瘤細胞具有原發灶內的腫瘤細胞學和基因遺傳學特征[2]。因此，CTCs是評估腫瘤發生發展狀態以及臨床預后的主要方法之一，而目前對胃癌的CTCs檢測和評價的研究較少。本研究通過免疫磁珠負性富集和免疫熒光染色技術檢測胃癌患者和胃良性疾病患者外周血CTCs的情況，旨在探討CTCs在胃癌患者中的表達及其臨床意義。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取2011年9月至2013年9月期間在鄭州大學附屬洛陽中心醫院經病理學檢查證實的60例胃癌患者為研究對象。其中男36例，女24例；年齡28～80歲，中位年齡65歲；依據美國癌癥聯合會（AJCC）第7版胃癌TNM分期[3]：Ⅰ期11例，Ⅱ期14例，Ⅲ期20例，Ⅳ期15例；腫瘤直徑：<3 cm 28例，≥3 cm 32例；腫瘤分化程度：低分化31例，中-高分化29例；發生遠處轉移29例，無遠處轉移31例；29例有脈管侵犯，31例無脈管侵犯。另外選取同期40例胃良性疾病患者作為對照。其中男22例，女18例；年齡30～80歲，中位年齡62歲；疾病類型：胃潰瘍21例，慢性胃炎19例。胃癌組納入標準：①排除其他惡性腫瘤；②術前未行放化療及其他治療；③病理類型為腺癌。2組患者經過全面細致的檢查后均未發現其他重大疾病，且在年齡及性別方面的差異也無統計學意義（P<0.05），具有可比性。
1.2 方法
應用專用的Cellsave管采集研究對象肘正中靜脈血7.5 mL，通過CellTracks AutoPrep系統（美國強生Veridex公司）進行標本預處理，設置相應參數，儀器會對血樣進行固定、染色、清洗等全自動操作。處理后的樣品自動轉入MagNest裝置中避光孵育，最后移入CellTracks AutoPrep系統進行熒光掃描，系統根據CTCs免疫熒光染色規定的判讀標準對結果進行判讀。
1.3 CTCs陽性判定標準
①形態學標準：光鏡下見有完整的細胞核，細胞呈圓形、橢圓形或長形，細胞長徑>10 μm。②熒光顯微鏡下陽性細胞的判定標準：細胞核對應的CEP8信號點>2個，且無血緣性白細胞表面抗原紅圈著色記為1個陽性細胞。CTCs陽性的界定值參照文獻[4]的標準，以CTCs≥1個即為陽性。
1.4 統計學方法
統計分析采用15.0軟件包完成，計數資料分析采用確切概率法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 胃癌組及對照組CTCs檢測結果
對照組有3例患者外周血中檢出CTCs，陽性率為7.5% （3/40），而胃癌組中共有42例患者外周血檢出CTCs，陽性率為70.0% （42/60），胃癌組外周血CTCs陽性率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2 胃癌患者CTCs檢出結果與其臨床病理特征的關系
胃癌患者CTCs檢出結果與患者性別、年齡、N分期、遠處轉移、腫瘤大小及脈管侵犯無關（P>0.05），而與腫瘤的TNM分期和腫瘤分化程度有關（P<0.05）。見表 1。
表1
胃癌患者CTCs檢出結果與其臨床病理特征的關系
2.3 胃癌患者CTCs檢測結果與其預后的關系
對本組60例胃癌患者術后進行隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪時間為術后6、12及18個月，共有58例獲隨訪,隨訪率為96.7%。其中CTCs陽性者術后12個月生存率為78.6%，陰性者為100%；術后18個月CTCs陽性者生存率為71.4%，陰性者為94.4%，2組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
CTCs陽性及陰性胃癌者術后生存率比較
3 討論
目前，胃癌根治術仍是胃癌的主要治療方式之一，但術后轉移和復發率依舊很高，腫瘤部位、浸潤深度、淋巴結轉移和術后輔助化療是胃癌的獨立預后因素[5]。腫瘤細胞在淋巴結、外周血、骨髓等中的微轉移可能正是惡性腫瘤轉移和復發的基礎。微轉移指存在于淋巴結、外周血及骨髓中不能被常規手段檢測到的腫瘤細胞[6]。其中存在于血循環中的微轉移即為CTCs，進入血液的腫瘤細胞大部分被自身的免疫系統及血液的剪切作用而發生凋亡或死亡[7-8]，僅有極少數具有高度活力或高度轉移潛能的腫瘤細胞在循環系統中得以生存，相互聚集或分裂增殖形成微小癌栓，并在一定條件下再次脫離循環系統，進入組織內發展為遠處轉移灶[9-10]。現已在乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤中找到了CSCs存在的證據[11]。有關CTCs與乳腺癌、胃癌、結腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤的研究顯示，CTCs可以有效預測腫瘤的復發轉移及預后情況，同時可以作為預測相關輔助治療療效的評判標準[12-14]。CTCs將可能成為預測復發、評估預后，以及指導治療的有效工具，其在臨床應用的巨大價值正受到人們的關注。
目前CTCs的檢測方法較多，但每種方法均有局限性。CellSearch系統是目前自動化程度最高的CTCs檢測技術，Cellsearch法作為唯一被美國食品及藥物管理局（FDA）批準的可在臨床檢測中使用的CTC枚舉計數法，已被許多研究證實有著較高的敏感度和特異性，可以檢測到血液中低濃度的CTC （1 CTC/7.5 mL血液）[15-16]。臨床研究[17-18]表明，CTCs陽性的胃癌患者遠處轉移及復發的概率明顯增高；也有研究[19-20]發現，胃癌CTCs高陽性率者比CTCs低陽性率者的預后更差，且生存期更短。Matsusaka等 [21]報道，外周血中CTCs數量越多，腫瘤細胞轉移的負荷越大，發生轉移的可能性也就越大。Yie等[22]采用RT-PCR和ELISA方法檢測55例胃癌患者外周血中survivin陽性的CTCs，檢出率為45.4%，并發現其與腫瘤浸潤深度及分期明顯相關。Uenosono等[23]隨訪251例胃癌患者，發現≥1個CTC/7.5 mL的患者的總生存期和無進展生存，均較陰性者預后差，是患者生存率的獨立預測因子。腫瘤分期越晚，CTCs的檢出率越高。但有研究[24-25]顯示，CTCs陽性率與T分期無關。最新的在轉移性結直腸癌患者的研究[26-27]中發現，血流中有少于3個CTCs的患者與血流中有多于3個CTCs的患者相比，其總體生存率有明顯提高。本研究中40例胃良性疾病對照組中CTCs的檢出率為7.5%，考慮不排除由于技術原因引起的假陽性結果；在60例胃癌患者中有42例檢出CTCs，檢出率為70.0%，提示本研究采用的檢測方法具有較高的敏感性。本研究結果還發現，胃癌患者CTCs的檢出結果與患者性別、年齡、N分期、遠處轉移、腫瘤大小及脈管侵犯均無關（P>0.05），而與腫瘤的TNM分期及分化程度有關（P<0.05）；CTCs檢出陰性的胃癌患者與陽性者比較，其預后較好（P<0.05）。該結果提示，CTCs可作為判斷胃癌患者疾病進展程度及預后評估的參考指標。
綜上所述，CTCs與胃癌的發生發展及轉移有關，具有潛在臨床應用價值,可幫助指導臨床設計更有效的治療方案，從而延長患者的生存期，提高生存率。然而，各項研究結果仍存在分歧和矛盾，還需進行大樣本及規范的長期隨訪研究來驗證。
