引用本文： 張明, 朱精強, 魏濤. BRAF、VEGF-C及相關臨床病理特征在甲狀腺乳頭狀癌中央區淋巴結轉移規律中的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(7): 788-794. doi: 10.7507/1007-9424.20150206 復制
甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）為甲狀腺癌中最常見的類型，約占所有甲狀腺癌的90% [1]。PTC以頸部淋巴結轉移為主，其轉移率為20%～90% [2-5]。基礎研究[6-8]表明，中央區淋巴結（central lymph node，CLN）為甲狀腺癌淋巴結轉移的第1站。對術前查體和（或）彩超檢查發現頸部可疑腫大淋巴結、細針穿刺懷疑和（或）證實淋巴轉移的cN1病例，行中央區淋巴結清掃（central lymph node dissection，CLND）已達成共識，而對于上述檢查沒有發現CLN腫大的cNO期患者，CLN如何處理是目前關注的問題。
近年來，發現BRAFV600E基因在PTC中有較高的突變率，但其是否能預測腫瘤侵襲性增強及其作用機理仍存在爭議。有研究[9-10]顯示，BRAFV600E基因突變與腫瘤侵襲性增強有關。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族中的VEGF-C作為一個重要的淋巴管生成調控因子，通過與多種受體作用，促進淋巴內皮細胞增殖和遷移，促進淋巴管生成。臨床研究[11-14]顯示，在結直腸癌、胃癌、宮頸癌等腫瘤組織中VEGF-C都有高表達，且其表達程度與區域淋巴結轉移相關。
本研究擬探討PTC組織中BRAFV600E基因突變、VEGF-C的表達情況及其臨床病理特征與CLN轉移的關系，旨在尋找能預測PTC局部侵襲性和轉移潛能的指標，為CLND尋找依據，從而選擇合理的手術方式。
1 資料和方法
1.1 研究對象和臨床病理資料處理
選取2011年1月至2012年1月期間在四川大學華西醫院甲狀腺乳腺外科行首次手術治療的50例PTC患者作為研究對象，收集其基本信息、術前查體、影像學資料（主要為超聲）以及術中發現的資料。所有PTC患者腫瘤組織HE切片均由兩位病理科醫師進行診斷，明確診斷后再對石蠟切片行VEGF-C免疫組織化學檢測。病理報告由四川大學華西醫院病理科詳細記錄。對不影響病理診斷且能取到足夠腫瘤組織的PTC患者均納入本研究。任意取隨機數字表中一段數列，將數字按入院順序依次給予滿足條件的患者。分配到單數的患者納入本研究，以排除人為選擇患者的偏倚。術前查體及超聲檢查均由固定的有經驗的醫師進行。筆者所在的治療組對腫瘤直徑>1 cm的PTC病例常規行甲狀腺全切（total thyroidectomy，TT）或甲狀腺近全切除術（near total thyroidectomy，NTT）+CLND，對腫瘤直徑≤1 cm的PTC病例當其伴下列情況之一行TT/NTT+CLND：被膜及周圍組織浸潤、對側頸淋巴結轉移（包括中央區及頸側區）、有甲狀腺癌高危因素、高侵襲性亞型、對側甲狀腺側葉存在病變及患者強烈要求。 對懷疑或證實有頸側區淋巴結轉移的PTC病例加行相應頸側區淋巴結清掃。手術標本由手術醫生根據2008年美國頭頸外科協會推薦的頸部淋巴結分區方法[15]分別裝袋送病檢。腫瘤部位由術中剖視標本確定；對于多灶癌的腫瘤直徑，以直徑最大者或浸潤包膜的腫瘤為準；對腫瘤占據整個側葉及腫瘤位于峽部者，腫瘤位置歸為中部。癌灶大小按美國癌癥分期聯合委員會公布的AJCC第7版分期[16]對腫瘤大小進行分組，T1組再細分為T1a（腫瘤直徑≤1 cm）和T1b（腫瘤直徑為1.1～2 cm）2組。
1.2 BRAFV600E基因突變的檢測
術中在行快速冰凍病理學檢查的同時，根據腫瘤大小切取不小于9 mm見方的腫瘤組織液氮保存，待術后病理學檢查確診后用于提取DNA。根據組織/細胞基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司）說明書提取DNA，并于-20 ℃保存。按2×Taq PCR MasterMix說明書加入上游引物5?-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3?、下游引物5?-GG-CCAAAAATTTAATCAGTGGA-3、2×Taq PCR MasterMix和DNA模板。94 ℃預變性10 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環，12 ℃結束。產物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳并用AgNO3染色明確有230 bp左右堿基對的單個條帶出現后，將擴增的60 μL PCR產物送上海英濰捷基貿易有限公司進行純化測序。將PCR測序結果與BRAF基因庫中正常的序列進行對比，判斷有無突變。
1.3 VEGF-C免疫組織化學染色及其結果判斷
所取PTC腫瘤組織經過10%甲醛溶液浸泡、脫水、浸蠟、包埋，按照4 μm厚連續切片，最終固定在多聚-L-賴氨酸處理載玻片上。經常規HE染色明確診斷后，再進行VEGF-C免疫組化染色。采用S-P法，DAB顯色，同時設陰性對照和空白對照。第一抗體：VEGF-C抗人單克隆抗體（英國Abcam公司），第二抗體：辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Santa Cruz公司）、鏈霉素親生物素-過氧化物酶（S-P）免疫組化試劑盒（福州邁新公司）。一抗工作濃度為1∶50。用PBS液代替一抗作為陰性對照，用正常血清代替一抗作為空白對照。其結果判定：VEGF-C染色結果判斷采用染色指數計數法[17]，隨機選擇5個高倍鏡視野（200倍）進行判斷，該方法同時考慮了VEGF-C陽性表達細胞百分比和細胞染色強度兩個方面。為便于對結果進行統計學分析，故將VEGF-C的表達分為兩種情況進行數據分析：①將VEGF-C表達為“-”與“+”性者歸為低表達，VEGF-C表達為“++”與“+++”性者歸為高表達；②將VEGF-C表達為“-”歸為陰性，VEGF-C表達為“+”、“++”與“+++”性者歸為陽性。在之后的數據分析中，由于陽性和陰性分類方法與病例的各項臨床病理特征無統計學意義，所以本研究最終采用了高表達和低表達分類方法。結果分析判定采用盲法，每張切片都由2名經驗豐富的病理科醫師分別計數，計數差相差10%以上重新計數。
1.4 統計學方法
所有數據采用SPSS 11.5軟件進行統計分析。計數資料采用卡方檢驗（Fisher檢驗），等級資料采用秩和檢驗，多因素分析采用多元logistic回歸。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般資料
納入本研究的50例PTC患者中男11例，女39例；年齡（43.4±13.5）歲（12～72歲），男性患者年齡為（41.5±14.9）歲（12～64歲），女性患者年齡為（43.9±13.3）歲（22～72歲）。50例患者的基本資料見表 1。所有病例行TT/NTT+CLND外，另有20例加行單側頸側區淋巴結清掃術，5例加行雙側頸側區淋巴結清掃術。
表1
50例PTC患者的基本資料
2.2 BRAFV600E基因突變檢測結果及其與PTC臨床病例特征的關系
2.2.1 BRAFV600E基因突變檢測結果PCR測序結果
與基因庫比對，發現50例PTC患者中BRAFV600E基因突變者30例（60.0%），突變位于第1799位點核苷酸，胸腺嘧啶（T）突變為腺嘌呤（A）。圖 1及圖 2箭頭所指處見有A （綠色)表達，提示有BRAFV600E基因突變，圖 3只見T（紅色） 表達，提示無BRAFV600E基因突變。
圖1
示PTC BRAFV600E基因突變陽性 ? ?圖 2 示PTC BRAFV600E基因突變陽性 ? ?圖 3 示PTC BRAFV600E基因突變陰性
2.2.2 BRAFV600E基因突變與PTC臨床病理特征的關系
單因素分析結果顯示，BRAFV600E基因突變預示更高的VEGF-C表達(87.5% 比 34.6%，P=0.000),而與患者性別、年齡、是否多灶癌、腫瘤T分期、臨床分期、是否侵及包膜及周圍組織以及CLN是否轉移均無關（P>0.05）。詳見表 2。
表2
50例PTC患者BRAFV600E基因突變與其臨床病理特征的關系
2.3 VEGF-C在PTC癌組織中不同程度表達及與其臨床病理特征的關系
2.3.1 VEGF-C在PTC癌組織中表達程度檢測結果
VEGF-C表達陰性，PTC細胞無染色（圖 4）；VEGF-C表達陽性，PTC細胞胞漿和（或）胞核彌漫分布棕黃或棕褐色顆粒（圖 5及圖 6）。本組50例PTC病例中VEGF-C呈（-）表達10例（20.0%），呈（+）表達16例（32.0%），呈（++）表達16例（32.0%），呈（+++）表達8例（16.0%）。
圖2
示PTC組織中VEGF-C呈陰性表達（S-P法免疫組化染色 ×400） ? ?圖 5 示PTC組織中VEGF-C呈棕黃色表達（S-P法免疫組化染色 ×400） ? ?圖 6 示PTC組織中VEGF-C呈棕褐色表達（S-P法免疫組化染色 ×400）
2.3.2 PTC組織中VEGF-C的表達與其臨床病理特征的關系
單因素分析結果顯示，PTC組織中VEGF-C高表達與CLN轉移及腫瘤大小有關（P<0.05），CLN轉移者較無CLD轉移者有更高的VEGF-C表達率（58.3%比21.4% P=0.019）；而與患者的性別、年齡、多灶癌、腫瘤T分期、臨床分期以及腫瘤是否侵及包膜和周圍組織均無關（P>0.05），具體見表 3。進一步對VEGF-C表達程度與CLN轉移的關系進行分析，發現不同VEGF-C表達程度與CLN轉移率有關（Z=-2.587，P=0.010）。見表 4。
表3
PTC組織中VEGF-C的表達與其臨床病理特征的關系
表4
VEGF-C表達程度與PTC CLN轉移的關系
2.4 CLN轉移情況
本組50例患者術中檢出CLN數（8.6±5.7）枚/例（2～25枚/例），其中伴轉移的CLN數（4.9±4.8）枚/例（1～22枚/例）。CLN轉移率為72.0%（36/50）；cN0期及cN1期患者CLN轉移率分別為52.0%（13/25）及92.0%（23/25），20.0%（2/10）的cN0病例因常規行CLND而發現淋巴結轉移，其分期從Ⅰ～Ⅱ期升級為Ⅲ期。按腫瘤T分期統計CLN轉移率：T1期41.7%（5/12），T2期為75.0%（3/4），T3期為75.0%（18/24），T4期為100%（10/10）。25例行患側頸側區淋巴結清掃者，其側區淋巴結轉移率為76.0%（19/25）；有頸側區淋巴結轉移者，都有CLN轉移。本組患者中有6例行頸側區淋巴結清掃而無淋巴結轉移者，其中4例有CLN轉移。
2.5 CLN轉移因素分析
單因素分析結果顯示，CLN轉移與腫瘤大小、侵及包膜和周圍組織、T分期及VEGF-C表達程度均有關（P<0.05），VEGF-C高表達較其低表達提示有更高的CLN轉移率（87.5%比57.7% P=0.019）；而CLN轉移與患者性別、年齡、多灶癌及癌灶部位均無關（P>0.05）。見表 5。多因素分析結果表明，腫瘤侵及周圍組織和VEGF-C高表達是CLN轉移的獨立因素（表 6）。
表5
50例PTC患者CLN轉移的單因素分析
表6
CLN轉移的多因素logistic回歸分析結果
3 討論
3.1 BRAFV600E基因突變與PTC臨床病理特征的關系
BRAFV600E基因突變在正常甲狀腺組織和其他甲狀腺良惡性疾病中不表達，只在PTC及PTC來源的低分化和未分化癌中表達[18-19]，是PTC最常見的基因改變，29%～90%的PTC有該基因突變[9, 20-23]。部分學者[9-10]認為，BRAFV600E基因突變與PTC被膜浸潤、淋巴結轉移、臨床分期晚（Ⅲ/Ⅳ）、腫瘤復發等相關。一項對631例PTC患者進行中位隨訪期為83個月的研究[24]表明，BRAFV600E基因突變與其被膜浸潤、淋巴結轉移、臨床分期晚、腫瘤復發及生存期并無相關性，該研究認為，BRAFV600E基因突變可能對PTC發生有一定的作用，但沒有證據表明BRAFV600E基因突變與PTC進展和更差的預后相關。本研究結果顯示，BRAFV600E基因突變與PTC患者的性別、年齡（45歲為界）、腫瘤大小、腫瘤被膜及周圍組織受侵、是否多灶、腫瘤部位、原發灶T分期及臨床分期無關，但由于本研究病例偏少，此結論有待進一步擴大樣本及長期隨訪來證實。此外，本研究發現BRAFV600E基因突變與VEGF-C的高表達相關，其是否有內在聯系及其機理有待進一步的研究。
3.2 VEGF-C表達情況與PTC臨床病理特征的關系
在多種腫瘤動物模型中[25-27]，VEGF-C的過表達可以促進腫瘤的淋巴轉移。臨床研究發現，在多種原發惡性腫瘤（結腸直腸癌、胃癌、宮頸癌等）組織中VEGF-C的表達與區域淋巴結轉移相關[11-14]，且發現VEGF-C在甲狀腺癌中也有表達[28-29]。部分研究認為，相比Hürthle細胞癌、未分化癌、髓樣癌及濾泡狀癌，VEGF-C在PTC中有更高的表達[30-31]，且VEGF-C與PTC微淋巴管形成及與PTC頸部淋巴結轉移相關[29, 32]。本研究結果顯示，PTC組織中VEGF-C的高表達預示了CLN的轉移，而其表達與患者性別、年齡、腫瘤是否多灶、原發灶T分期以及是否侵及包膜和周圍組織均無關。
3.3 預示CLN轉移的相關因素
大量的臨床和病理學研究證據表明，腫瘤細胞經淋巴管轉移至區域淋巴結是腫瘤轉移性病變中的重要早期事件，因此準確了解區域淋巴結轉移情況對腫瘤的精確分期、預后判斷和擬定手術及非手術治療策略都至關重要[33]。CLN作為PTC轉移的第1站，其手術處理顯得尤為重要。由于缺少術前判斷PTC淋巴結轉移情況的分子生物學指標，多數研究常通過臨床病理資料來分析CLN的轉移規律。本研究的單因素分析結果與其他多數研究結果[34-35]一致，認為腫瘤浸潤甲狀腺被膜為CLN轉移的相關因素，伴被膜浸潤者CLN轉移率高達82.4%（28/34），特別是當腫瘤侵及周圍組織者其CLN轉移率達87.5%（21/24）。本研究多因素分析結果顯示，腫瘤侵及周圍組織為CLN轉移的獨立因素。本研究結果與一項對cN0病例的前瞻性研究結果[34]一致，認為腫瘤直徑>1 cm更易發生CLN轉移。部分研究[35-36]顯示，多灶癌預示更高的CLN轉移率，但本研究結果顯示多灶癌與CLN轉移無關，與Moo等[37]的研究一致。
2009年修訂版ATA指南[38]提出，對cN0的T1或T2期PTC病例可不行CLND，同時指南還提到對早期病例行預防性的CLND可能減少局部復發。說明現在對PTC患者特別是cN0期患者行CLND仍存在一定的顧慮。本研究結果顯示，PTC癌組織中VEGF-C高表達是CLN轉移的獨立因素，此觀點與Bunone等[29]和Yu等[32]認為VEGF-C與PTC頸淋巴結轉移相關的觀點一致。VEGF-C作為預測PTC淋巴結轉移及侵襲潛能的分子生物學指標，可能為術前決定是否行CLND提供參考。
4 結論
①60%的PTC有BRAFV600E基因突變，但本研究顯示其突變與CLN轉移無關，而其突變與VEGF-C的高表達相關。②VEGF-C在PTC癌組織中的高表達預示更高的CLN轉移率。③腫瘤侵及甲狀腺被膜特別是侵及周圍組織與CLN轉移相關。
甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）為甲狀腺癌中最常見的類型，約占所有甲狀腺癌的90% [1]。PTC以頸部淋巴結轉移為主，其轉移率為20%～90% [2-5]。基礎研究[6-8]表明，中央區淋巴結（central lymph node，CLN）為甲狀腺癌淋巴結轉移的第1站。對術前查體和（或）彩超檢查發現頸部可疑腫大淋巴結、細針穿刺懷疑和（或）證實淋巴轉移的cN1病例，行中央區淋巴結清掃（central lymph node dissection，CLND）已達成共識，而對于上述檢查沒有發現CLN腫大的cNO期患者，CLN如何處理是目前關注的問題。
近年來，發現BRAFV600E基因在PTC中有較高的突變率，但其是否能預測腫瘤侵襲性增強及其作用機理仍存在爭議。有研究[9-10]顯示，BRAFV600E基因突變與腫瘤侵襲性增強有關。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族中的VEGF-C作為一個重要的淋巴管生成調控因子，通過與多種受體作用，促進淋巴內皮細胞增殖和遷移，促進淋巴管生成。臨床研究[11-14]顯示，在結直腸癌、胃癌、宮頸癌等腫瘤組織中VEGF-C都有高表達，且其表達程度與區域淋巴結轉移相關。
本研究擬探討PTC組織中BRAFV600E基因突變、VEGF-C的表達情況及其臨床病理特征與CLN轉移的關系，旨在尋找能預測PTC局部侵襲性和轉移潛能的指標，為CLND尋找依據，從而選擇合理的手術方式。
1 資料和方法
1.1 研究對象和臨床病理資料處理
選取2011年1月至2012年1月期間在四川大學華西醫院甲狀腺乳腺外科行首次手術治療的50例PTC患者作為研究對象，收集其基本信息、術前查體、影像學資料（主要為超聲）以及術中發現的資料。所有PTC患者腫瘤組織HE切片均由兩位病理科醫師進行診斷，明確診斷后再對石蠟切片行VEGF-C免疫組織化學檢測。病理報告由四川大學華西醫院病理科詳細記錄。對不影響病理診斷且能取到足夠腫瘤組織的PTC患者均納入本研究。任意取隨機數字表中一段數列，將數字按入院順序依次給予滿足條件的患者。分配到單數的患者納入本研究，以排除人為選擇患者的偏倚。術前查體及超聲檢查均由固定的有經驗的醫師進行。筆者所在的治療組對腫瘤直徑>1 cm的PTC病例常規行甲狀腺全切（total thyroidectomy，TT）或甲狀腺近全切除術（near total thyroidectomy，NTT）+CLND，對腫瘤直徑≤1 cm的PTC病例當其伴下列情況之一行TT/NTT+CLND：被膜及周圍組織浸潤、對側頸淋巴結轉移（包括中央區及頸側區）、有甲狀腺癌高危因素、高侵襲性亞型、對側甲狀腺側葉存在病變及患者強烈要求。 對懷疑或證實有頸側區淋巴結轉移的PTC病例加行相應頸側區淋巴結清掃。手術標本由手術醫生根據2008年美國頭頸外科協會推薦的頸部淋巴結分區方法[15]分別裝袋送病檢。腫瘤部位由術中剖視標本確定；對于多灶癌的腫瘤直徑，以直徑最大者或浸潤包膜的腫瘤為準；對腫瘤占據整個側葉及腫瘤位于峽部者，腫瘤位置歸為中部。癌灶大小按美國癌癥分期聯合委員會公布的AJCC第7版分期[16]對腫瘤大小進行分組，T1組再細分為T1a（腫瘤直徑≤1 cm）和T1b（腫瘤直徑為1.1～2 cm）2組。
1.2 BRAFV600E基因突變的檢測
術中在行快速冰凍病理學檢查的同時，根據腫瘤大小切取不小于9 mm見方的腫瘤組織液氮保存，待術后病理學檢查確診后用于提取DNA。根據組織/細胞基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司）說明書提取DNA，并于-20 ℃保存。按2×Taq PCR MasterMix說明書加入上游引物5?-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3?、下游引物5?-GG-CCAAAAATTTAATCAGTGGA-3、2×Taq PCR MasterMix和DNA模板。94 ℃預變性10 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環，12 ℃結束。產物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳并用AgNO3染色明確有230 bp左右堿基對的單個條帶出現后，將擴增的60 μL PCR產物送上海英濰捷基貿易有限公司進行純化測序。將PCR測序結果與BRAF基因庫中正常的序列進行對比，判斷有無突變。
1.3 VEGF-C免疫組織化學染色及其結果判斷
所取PTC腫瘤組織經過10%甲醛溶液浸泡、脫水、浸蠟、包埋，按照4 μm厚連續切片，最終固定在多聚-L-賴氨酸處理載玻片上。經常規HE染色明確診斷后，再進行VEGF-C免疫組化染色。采用S-P法，DAB顯色，同時設陰性對照和空白對照。第一抗體：VEGF-C抗人單克隆抗體（英國Abcam公司），第二抗體：辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Santa Cruz公司）、鏈霉素親生物素-過氧化物酶（S-P）免疫組化試劑盒（福州邁新公司）。一抗工作濃度為1∶50。用PBS液代替一抗作為陰性對照，用正常血清代替一抗作為空白對照。其結果判定：VEGF-C染色結果判斷采用染色指數計數法[17]，隨機選擇5個高倍鏡視野（200倍）進行判斷，該方法同時考慮了VEGF-C陽性表達細胞百分比和細胞染色強度兩個方面。為便于對結果進行統計學分析，故將VEGF-C的表達分為兩種情況進行數據分析：①將VEGF-C表達為“-”與“+”性者歸為低表達，VEGF-C表達為“++”與“+++”性者歸為高表達；②將VEGF-C表達為“-”歸為陰性，VEGF-C表達為“+”、“++”與“+++”性者歸為陽性。在之后的數據分析中，由于陽性和陰性分類方法與病例的各項臨床病理特征無統計學意義，所以本研究最終采用了高表達和低表達分類方法。結果分析判定采用盲法，每張切片都由2名經驗豐富的病理科醫師分別計數，計數差相差10%以上重新計數。
1.4 統計學方法
所有數據采用SPSS 11.5軟件進行統計分析。計數資料采用卡方檢驗（Fisher檢驗），等級資料采用秩和檢驗，多因素分析采用多元logistic回歸。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般資料
納入本研究的50例PTC患者中男11例，女39例；年齡（43.4±13.5）歲（12～72歲），男性患者年齡為（41.5±14.9）歲（12～64歲），女性患者年齡為（43.9±13.3）歲（22～72歲）。50例患者的基本資料見表 1。所有病例行TT/NTT+CLND外，另有20例加行單側頸側區淋巴結清掃術，5例加行雙側頸側區淋巴結清掃術。
表1
50例PTC患者的基本資料
2.2 BRAFV600E基因突變檢測結果及其與PTC臨床病例特征的關系
2.2.1 BRAFV600E基因突變檢測結果PCR測序結果
與基因庫比對，發現50例PTC患者中BRAFV600E基因突變者30例（60.0%），突變位于第1799位點核苷酸，胸腺嘧啶（T）突變為腺嘌呤（A）。圖 1及圖 2箭頭所指處見有A （綠色)表達，提示有BRAFV600E基因突變，圖 3只見T（紅色） 表達，提示無BRAFV600E基因突變。
圖1
示PTC BRAFV600E基因突變陽性 ? ?圖 2 示PTC BRAFV600E基因突變陽性 ? ?圖 3 示PTC BRAFV600E基因突變陰性
2.2.2 BRAFV600E基因突變與PTC臨床病理特征的關系
單因素分析結果顯示，BRAFV600E基因突變預示更高的VEGF-C表達(87.5% 比 34.6%，P=0.000),而與患者性別、年齡、是否多灶癌、腫瘤T分期、臨床分期、是否侵及包膜及周圍組織以及CLN是否轉移均無關（P>0.05）。詳見表 2。
表2
50例PTC患者BRAFV600E基因突變與其臨床病理特征的關系
2.3 VEGF-C在PTC癌組織中不同程度表達及與其臨床病理特征的關系
2.3.1 VEGF-C在PTC癌組織中表達程度檢測結果
VEGF-C表達陰性，PTC細胞無染色（圖 4）；VEGF-C表達陽性，PTC細胞胞漿和（或）胞核彌漫分布棕黃或棕褐色顆粒（圖 5及圖 6）。本組50例PTC病例中VEGF-C呈（-）表達10例（20.0%），呈（+）表達16例（32.0%），呈（++）表達16例（32.0%），呈（+++）表達8例（16.0%）。
圖2
示PTC組織中VEGF-C呈陰性表達（S-P法免疫組化染色 ×400） ? ?圖 5 示PTC組織中VEGF-C呈棕黃色表達（S-P法免疫組化染色 ×400） ? ?圖 6 示PTC組織中VEGF-C呈棕褐色表達（S-P法免疫組化染色 ×400）
2.3.2 PTC組織中VEGF-C的表達與其臨床病理特征的關系
單因素分析結果顯示，PTC組織中VEGF-C高表達與CLN轉移及腫瘤大小有關（P<0.05），CLN轉移者較無CLD轉移者有更高的VEGF-C表達率（58.3%比21.4% P=0.019）；而與患者的性別、年齡、多灶癌、腫瘤T分期、臨床分期以及腫瘤是否侵及包膜和周圍組織均無關（P>0.05），具體見表 3。進一步對VEGF-C表達程度與CLN轉移的關系進行分析，發現不同VEGF-C表達程度與CLN轉移率有關（Z=-2.587，P=0.010）。見表 4。
表3
PTC組織中VEGF-C的表達與其臨床病理特征的關系
表4
VEGF-C表達程度與PTC CLN轉移的關系
2.4 CLN轉移情況
本組50例患者術中檢出CLN數（8.6±5.7）枚/例（2～25枚/例），其中伴轉移的CLN數（4.9±4.8）枚/例（1～22枚/例）。CLN轉移率為72.0%（36/50）；cN0期及cN1期患者CLN轉移率分別為52.0%（13/25）及92.0%（23/25），20.0%（2/10）的cN0病例因常規行CLND而發現淋巴結轉移，其分期從Ⅰ～Ⅱ期升級為Ⅲ期。按腫瘤T分期統計CLN轉移率：T1期41.7%（5/12），T2期為75.0%（3/4），T3期為75.0%（18/24），T4期為100%（10/10）。25例行患側頸側區淋巴結清掃者，其側區淋巴結轉移率為76.0%（19/25）；有頸側區淋巴結轉移者，都有CLN轉移。本組患者中有6例行頸側區淋巴結清掃而無淋巴結轉移者，其中4例有CLN轉移。
2.5 CLN轉移因素分析
單因素分析結果顯示，CLN轉移與腫瘤大小、侵及包膜和周圍組織、T分期及VEGF-C表達程度均有關（P<0.05），VEGF-C高表達較其低表達提示有更高的CLN轉移率（87.5%比57.7% P=0.019）；而CLN轉移與患者性別、年齡、多灶癌及癌灶部位均無關（P>0.05）。見表 5。多因素分析結果表明，腫瘤侵及周圍組織和VEGF-C高表達是CLN轉移的獨立因素（表 6）。
表5
50例PTC患者CLN轉移的單因素分析
表6
CLN轉移的多因素logistic回歸分析結果
3 討論
3.1 BRAFV600E基因突變與PTC臨床病理特征的關系
BRAFV600E基因突變在正常甲狀腺組織和其他甲狀腺良惡性疾病中不表達，只在PTC及PTC來源的低分化和未分化癌中表達[18-19]，是PTC最常見的基因改變，29%～90%的PTC有該基因突變[9, 20-23]。部分學者[9-10]認為，BRAFV600E基因突變與PTC被膜浸潤、淋巴結轉移、臨床分期晚（Ⅲ/Ⅳ）、腫瘤復發等相關。一項對631例PTC患者進行中位隨訪期為83個月的研究[24]表明，BRAFV600E基因突變與其被膜浸潤、淋巴結轉移、臨床分期晚、腫瘤復發及生存期并無相關性，該研究認為，BRAFV600E基因突變可能對PTC發生有一定的作用，但沒有證據表明BRAFV600E基因突變與PTC進展和更差的預后相關。本研究結果顯示，BRAFV600E基因突變與PTC患者的性別、年齡（45歲為界）、腫瘤大小、腫瘤被膜及周圍組織受侵、是否多灶、腫瘤部位、原發灶T分期及臨床分期無關，但由于本研究病例偏少，此結論有待進一步擴大樣本及長期隨訪來證實。此外，本研究發現BRAFV600E基因突變與VEGF-C的高表達相關，其是否有內在聯系及其機理有待進一步的研究。
3.2 VEGF-C表達情況與PTC臨床病理特征的關系
在多種腫瘤動物模型中[25-27]，VEGF-C的過表達可以促進腫瘤的淋巴轉移。臨床研究發現，在多種原發惡性腫瘤（結腸直腸癌、胃癌、宮頸癌等）組織中VEGF-C的表達與區域淋巴結轉移相關[11-14]，且發現VEGF-C在甲狀腺癌中也有表達[28-29]。部分研究認為，相比Hürthle細胞癌、未分化癌、髓樣癌及濾泡狀癌，VEGF-C在PTC中有更高的表達[30-31]，且VEGF-C與PTC微淋巴管形成及與PTC頸部淋巴結轉移相關[29, 32]。本研究結果顯示，PTC組織中VEGF-C的高表達預示了CLN的轉移，而其表達與患者性別、年齡、腫瘤是否多灶、原發灶T分期以及是否侵及包膜和周圍組織均無關。
3.3 預示CLN轉移的相關因素
大量的臨床和病理學研究證據表明，腫瘤細胞經淋巴管轉移至區域淋巴結是腫瘤轉移性病變中的重要早期事件，因此準確了解區域淋巴結轉移情況對腫瘤的精確分期、預后判斷和擬定手術及非手術治療策略都至關重要[33]。CLN作為PTC轉移的第1站，其手術處理顯得尤為重要。由于缺少術前判斷PTC淋巴結轉移情況的分子生物學指標，多數研究常通過臨床病理資料來分析CLN的轉移規律。本研究的單因素分析結果與其他多數研究結果[34-35]一致，認為腫瘤浸潤甲狀腺被膜為CLN轉移的相關因素，伴被膜浸潤者CLN轉移率高達82.4%（28/34），特別是當腫瘤侵及周圍組織者其CLN轉移率達87.5%（21/24）。本研究多因素分析結果顯示，腫瘤侵及周圍組織為CLN轉移的獨立因素。本研究結果與一項對cN0病例的前瞻性研究結果[34]一致，認為腫瘤直徑>1 cm更易發生CLN轉移。部分研究[35-36]顯示，多灶癌預示更高的CLN轉移率，但本研究結果顯示多灶癌與CLN轉移無關，與Moo等[37]的研究一致。
2009年修訂版ATA指南[38]提出，對cN0的T1或T2期PTC病例可不行CLND，同時指南還提到對早期病例行預防性的CLND可能減少局部復發。說明現在對PTC患者特別是cN0期患者行CLND仍存在一定的顧慮。本研究結果顯示，PTC癌組織中VEGF-C高表達是CLN轉移的獨立因素，此觀點與Bunone等[29]和Yu等[32]認為VEGF-C與PTC頸淋巴結轉移相關的觀點一致。VEGF-C作為預測PTC淋巴結轉移及侵襲潛能的分子生物學指標，可能為術前決定是否行CLND提供參考。
4 結論
①60%的PTC有BRAFV600E基因突變，但本研究顯示其突變與CLN轉移無關，而其突變與VEGF-C的高表達相關。②VEGF-C在PTC癌組織中的高表達預示更高的CLN轉移率。③腫瘤侵及甲狀腺被膜特別是侵及周圍組織與CLN轉移相關。
