引用本文： 肖博, 熊光冰, 肖體先, 肖毅. 兒茶酚胺氧位甲基轉移酶在結直腸腺瘤和結直腸癌組織中的表達. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(6): 705-709. doi: 10.7507/1007-9424.20150180 復制
結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內常見的惡性腫瘤，其發病率與死亡率都位居于惡性腫瘤的前列[1-2]。我國也是CRC高發的國家之一[3]。現代分子生物學研究[4-5]揭示，CRC的發生及發展是一個多基因參與、多步驟演變的惡性進程，但能夠用于CRC輔助診斷、預后判斷及干預治療的新靶點仍是CRC相關研究的熱點和難點。兒茶酚胺氧位甲基轉移酶（catechol O-methyltransferase，COMT）是兒茶酚雌激素代謝的關鍵酶，對雌激素誘導的DNA損傷具有保護作用[6]。研究[7]表明，COMT在CRC組織中的表達水平明顯高于正常組織。基于此，筆者認為有必要對結直腸腺瘤及CRC組織進行研究，故筆者通過實時定量PCR法和免疫組化方法檢測了COMT mRNA及其蛋白在結直腸腺瘤及CRC組織中的表達情況，以探討其在CRC發生和發展中的作用。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集2013年1～11月期間于北京協和醫院行電子結腸鏡下高頻電凝切除的47例結直腸腺瘤患者的結直腸腺瘤組織及其瘤旁組織（距離腺瘤以遠5 cm）標本。47例結直腸腺瘤患者中，男30例，女17例；年齡35～83歲，平均63.7歲；包括結腸腺瘤34例，直腸腺瘤13例；管狀腺瘤30例，鋸齒狀、絨毛狀及管狀絨毛狀腺瘤17例，均經術后病理學檢查證實。同時回顧性收集2012年7～9月期間于北京協和醫院行手術的42例CRC患者的癌組織及其癌旁組織（距離癌灶以遠5 cm）標本。42例CRC患者中，男19例，女23例；年齡35～84歲，平均66.3歲；包括結腸癌19例，直腸癌23例；采用《美國癌癥聯合委員會第七版分期方法》（2010年）[8]進行TNM分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期13例，Ⅲ期23例；分化程度：高分化13例，中分化22例，低分化7例；淋巴結轉移23例，淋巴結無轉移19例；所有CRC患者術前均未行新輔助治療，且均經術后病理學檢查證實。標本采集后均快速放至液氮中冷凍，-80℃保存。本研究獲得北京協和醫院倫理委員會批準。
1.2 主要試劑和設備
COMT鼠抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG-Fc段抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司，總RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司，Moloney小鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉錄酶購自Promega公司，FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒購自Roche公司。COMT和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的PCR引物由Invitrogen公司合成，并登陸GeneBank確認無誤。COMT mRNA引物：上游5′-ATTGACACCTA-CTGCGAGCA-3′，下游5′-CCACATTC CTCCAAGAG-AAGC-3′，擴增產物長度為388 bp；GAPDH mRNA引物：上游5′-GGCTGCCATTTGCACTGGCAA-3′，下游5′-TGCCDTGAGTGGAGTCATACTG-3′，擴增產物長度為318 bp。設備：5810R/5415D離心機（Eppen-dorf公司，德國）、Roche Lightcycler 480 PCR儀（Roche公司）、BX51T-PHD-J11顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）及DSHZ-300型恒溫水浴箱（江蘇太倉醫用儀器廠）。
1.3 方法
1.3.1 實時定量PCR法檢測組織中COMT mRNA的表達
使用Trizol試劑盒提取組織中的總RNA（操作按試劑盒說明書進行）。使用COMT mRNA和GAPDH mRNA引物逆轉錄合成cDNA（操作按逆轉錄試劑盒說明書進行），于Roche Lightcycler 480 PCR儀上進行標準的實時定量PCR。PCR反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后1個循環72℃延伸10 min，共30個循環。PCR反應體系同試劑盒說明書。以GAPDH為內參，由Roche Lightcycler 480 PCR儀直接得到各標本中COMT mRNA的相對表達量。
1.3.2 免疫組化法檢測組織中COMT的表達
將石蠟切片常規脫蠟水化，以3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min，以微波爐加熱修復抗原3 min；加COMT一抗（1︰400稀釋）4℃冰箱過夜后，加二抗37℃靜置10 min；以DAB顯色、蘇木精復染，行脫水透明封片后，在顯微鏡下觀察。免疫組化結果判斷采用染色強度和陽性細胞率兩項指標。染色強度：陰性，0分；弱陽性，1分；陽性，2分；強陽性，3分。陽性細胞率：< 5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；> 75%，4分。將兩項指標相乘，即得到免疫組化得分。以免疫組化得分的中位數值為高表達和低表達的判定界點。
1.4 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料比較采用t檢驗、Z檢驗或秩和檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 COMT mRNA的表達水平結果
因部分標本的RNA降解嚴重，僅有17對結直腸腺瘤及其瘤旁標本可以繼續進行后續逆轉錄定量PCR實驗，以測定COMT mRNA的相對表達量。PCR結果表明，結直腸腺瘤組織中COMT mRNA表達水平的中位數為0.109 0，高于瘤旁組織的0.000 5（t=3.02，P=0.01）。因部分標本RNA降解嚴重，僅有16對CRC及其癌旁標本可以繼續進行后續逆轉錄定量PCR實驗，以測定COMT mRNA的表達水平。PCR結果表明，CRC組織中COMT mRNA表達水平的中位數為0.041 8，高于其癌旁組織的0.013 5（t=2.71，P=0.02）。
2.2 COMT的表達水平結果
免疫組化染色結果顯示（圖 1），在結直腸腺瘤及其瘤旁組織、CRC及其癌旁組織中，COMT陽性染色主要定位于腺體細胞的胞質。結直腸腺瘤組織中COMT的高表達率為72.34%（34/47），高于瘤旁組織的25.53%（12/47），χ2=28.72，P < 0.01；CRC組織中COMT的高表達率為66.67%（28/42），高于癌旁組織的28.57%（12/42），χ2=4.97，P < 0.05。
圖1
COMT在結直腸腺瘤組織及其瘤旁組織、CRC組織及其癌旁組織中的表達結果，紅箭指示高表達，白箭指示低表達。1A：結直腸腺瘤組織（SP×400）；1B：結直腸腺瘤瘤旁組織（SP×1 000）；1C：CRC組織（SP×400）；1D：CRC癌旁組織（SP×1 000）
2.3 COMT表達與患者臨床病理特征的關系
在結直腸腺瘤組織中，COMT高表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位及病理學類型均無關（P > 0.05），見表 1。在CRC組織中，COMT高表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位及分化程度均無關（P > 0.05）；但與TNM分期、T分期及N分期均相關（P < 0.05），TNMⅠ+Ⅱ期、T1+T2期及N0期患者的COMT高表達率較高（表 1）。
表1
OMT表達與結直腸腺瘤和CRC臨床病理特征的關系（例）
3 討論
COMT是體內兒茶酚胺類物質的代謝酶，其可將兒茶酚雌激素——2-羥雌二醇（2-catechol estrogen，2-OHE2）、4-羥雌二醇（4-catechol estrogen，4-OHE2）和16α-羥雌二醇（16α-catechol estrogen，16α-OHE2）甲基化成無活性的甲氧雌激素，以減輕雌激素的致癌效應[6, 9]；其還通過促進兒茶酚雌激素代謝產物2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2-ME）來抑制腫瘤的增殖和促進凋亡的發生，以及抑制腫瘤血管的生成，從而發揮抑癌作用[10]。COMT的編碼基因位于第22號染色體q11.2區域，編碼合成膜結合型COMT和細胞質可溶性COMT，人體內細胞質可溶性COMT是其主要的表達形式[11-12]。本組免疫組化染色結果顯示，在結直腸腺瘤及其瘤旁組織、CRC及其癌旁組織中，COMT陽性染色主要定位于腺體細胞的胞質。
近年來研究表明，COMT基因及COMT基因多態性與雌激素代謝相關的腫瘤關系密切，如COMT MET158基因型與乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌等的發病相關[13-15]；COMT rs4818位點的基因多態性與乳腺癌患者的預后相關[16]；而COMT基因多態性導致的酶活性降低則促進子宮內膜癌的發生[17]，且COMT酶活性低的乳腺癌患者的淋巴結轉移率高[18]，同時乳腺癌患者的2-ME生成減少[19]。
結直腸雖不像乳腺、子宮內膜一樣與雌激素有著十分直接明顯的關系，但是對于CRC與雌激素的關系，自20世紀80年代以來就持續受到關注。流行病學研究[20]表明，女性的CRC發病率比男性低35%。絕經后婦女服用大豆以進行雌激素替代治療（HRT）相關研究[21]表明，雌激素可明顯降低CRC的發病率。一項針對SW480結腸癌細胞株的研究[22]表明，雌激素受體β能抑制結腸癌細胞的細胞周期途徑，進而抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。Cleveland等[23]的針對Apc小鼠的研究顯示，雌激素受體α和雌激素受體β可以參與調節CRC的發生，雌激素受體α還可以部分調節Wnt/beta-catenin途徑的活性，而Wnt/beta-catenin信號通路的異常激活被認為是結直腸黏膜發生腺瘤的關鍵啟動因素。研究[24]證實，雌激素和雌激素受體與CRC細胞的癌變、凋亡和轉移，以及CRC的病理學類型、疾病進展和預后均存在密切的聯系。在存在相同錯配修復缺陷的結腸癌患者中，女性患者所占的比例要低于男性[25]，表明甾體類激素可能會影響CRC的發生。抗雌激素藥物tamoxifen可以增加CRC的患病風險，而HRT可以將絕經后婦女的CRC發病率降低40%，并且還可以減小結直腸腺瘤的發病率及其瘤體體積[20]。因此，雌激素對CRC的保護作用被廣泛認可。但是WHI干預試驗結果[26]顯示，對于絕經后婦女給予雌激素+孕酮的HRT，雖然可以降低CRC的發病風險，但是卻提高了罹患乳腺癌以及心血管疾病的風險，所以目前仍然沒有作為臨床推薦的干預措施。而對于HRT的前景，有學者[26]考慮，是否可以采用聯合用藥方式，使藥物相互協同作用，以避免各自的副作用或不良后果。
北京協和醫院吳文銘等[7]在此前的研究中發現，COMT在CRC組織中的表達水平明顯高于正常組織，這與COMT在乳腺癌、子宮內膜癌及胰腺癌組織中的表達情況報道[27-29]相一致。本組資料結果也表明，結直腸腺瘤和CRC組織中COMT mRNA及其蛋白的表達水平均高于相應的癌（瘤）旁組織；COMT高表達與CRC的TNM分期、T分期及N分期相關，提示COMT參與了CRC的發生和發展，但具體機理尚不清楚。另一方面，絕經后女性行HRT可以降低CRC的發病風險，同時COMT基因的多態性與絕經后女性CRC患者的預后相關[30-31]。因此，筆者猜想，結直腸腺瘤及CRC組織中COMT mRNA及其蛋白表達上調的原因是細胞的應激反應或主動防御機制，以減少細胞內兒茶酚雌激素的蓄積或產生更多的2-ME。
綜上所述，COMT在CRC的發生和發展中可能發揮一定的作用，對其表達水平的檢測可以作為CRC早期診斷的標志物，這為CRC的診斷提供了一種思路。
結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內常見的惡性腫瘤，其發病率與死亡率都位居于惡性腫瘤的前列[1-2]。我國也是CRC高發的國家之一[3]。現代分子生物學研究[4-5]揭示，CRC的發生及發展是一個多基因參與、多步驟演變的惡性進程，但能夠用于CRC輔助診斷、預后判斷及干預治療的新靶點仍是CRC相關研究的熱點和難點。兒茶酚胺氧位甲基轉移酶（catechol O-methyltransferase，COMT）是兒茶酚雌激素代謝的關鍵酶，對雌激素誘導的DNA損傷具有保護作用[6]。研究[7]表明，COMT在CRC組織中的表達水平明顯高于正常組織。基于此，筆者認為有必要對結直腸腺瘤及CRC組織進行研究，故筆者通過實時定量PCR法和免疫組化方法檢測了COMT mRNA及其蛋白在結直腸腺瘤及CRC組織中的表達情況，以探討其在CRC發生和發展中的作用。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集2013年1～11月期間于北京協和醫院行電子結腸鏡下高頻電凝切除的47例結直腸腺瘤患者的結直腸腺瘤組織及其瘤旁組織（距離腺瘤以遠5 cm）標本。47例結直腸腺瘤患者中，男30例，女17例；年齡35～83歲，平均63.7歲；包括結腸腺瘤34例，直腸腺瘤13例；管狀腺瘤30例，鋸齒狀、絨毛狀及管狀絨毛狀腺瘤17例，均經術后病理學檢查證實。同時回顧性收集2012年7～9月期間于北京協和醫院行手術的42例CRC患者的癌組織及其癌旁組織（距離癌灶以遠5 cm）標本。42例CRC患者中，男19例，女23例；年齡35～84歲，平均66.3歲；包括結腸癌19例，直腸癌23例；采用《美國癌癥聯合委員會第七版分期方法》（2010年）[8]進行TNM分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期13例，Ⅲ期23例；分化程度：高分化13例，中分化22例，低分化7例；淋巴結轉移23例，淋巴結無轉移19例；所有CRC患者術前均未行新輔助治療，且均經術后病理學檢查證實。標本采集后均快速放至液氮中冷凍，-80℃保存。本研究獲得北京協和醫院倫理委員會批準。
1.2 主要試劑和設備
COMT鼠抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG-Fc段抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司，總RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司，Moloney小鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉錄酶購自Promega公司，FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒購自Roche公司。COMT和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的PCR引物由Invitrogen公司合成，并登陸GeneBank確認無誤。COMT mRNA引物：上游5′-ATTGACACCTA-CTGCGAGCA-3′，下游5′-CCACATTC CTCCAAGAG-AAGC-3′，擴增產物長度為388 bp；GAPDH mRNA引物：上游5′-GGCTGCCATTTGCACTGGCAA-3′，下游5′-TGCCDTGAGTGGAGTCATACTG-3′，擴增產物長度為318 bp。設備：5810R/5415D離心機（Eppen-dorf公司，德國）、Roche Lightcycler 480 PCR儀（Roche公司）、BX51T-PHD-J11顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）及DSHZ-300型恒溫水浴箱（江蘇太倉醫用儀器廠）。
1.3 方法
1.3.1 實時定量PCR法檢測組織中COMT mRNA的表達
使用Trizol試劑盒提取組織中的總RNA（操作按試劑盒說明書進行）。使用COMT mRNA和GAPDH mRNA引物逆轉錄合成cDNA（操作按逆轉錄試劑盒說明書進行），于Roche Lightcycler 480 PCR儀上進行標準的實時定量PCR。PCR反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后1個循環72℃延伸10 min，共30個循環。PCR反應體系同試劑盒說明書。以GAPDH為內參，由Roche Lightcycler 480 PCR儀直接得到各標本中COMT mRNA的相對表達量。
1.3.2 免疫組化法檢測組織中COMT的表達
將石蠟切片常規脫蠟水化，以3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min，以微波爐加熱修復抗原3 min；加COMT一抗（1︰400稀釋）4℃冰箱過夜后，加二抗37℃靜置10 min；以DAB顯色、蘇木精復染，行脫水透明封片后，在顯微鏡下觀察。免疫組化結果判斷采用染色強度和陽性細胞率兩項指標。染色強度：陰性，0分；弱陽性，1分；陽性，2分；強陽性，3分。陽性細胞率：< 5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；> 75%，4分。將兩項指標相乘，即得到免疫組化得分。以免疫組化得分的中位數值為高表達和低表達的判定界點。
1.4 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料比較采用t檢驗、Z檢驗或秩和檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 COMT mRNA的表達水平結果
因部分標本的RNA降解嚴重，僅有17對結直腸腺瘤及其瘤旁標本可以繼續進行后續逆轉錄定量PCR實驗，以測定COMT mRNA的相對表達量。PCR結果表明，結直腸腺瘤組織中COMT mRNA表達水平的中位數為0.109 0，高于瘤旁組織的0.000 5（t=3.02，P=0.01）。因部分標本RNA降解嚴重，僅有16對CRC及其癌旁標本可以繼續進行后續逆轉錄定量PCR實驗，以測定COMT mRNA的表達水平。PCR結果表明，CRC組織中COMT mRNA表達水平的中位數為0.041 8，高于其癌旁組織的0.013 5（t=2.71，P=0.02）。
2.2 COMT的表達水平結果
免疫組化染色結果顯示（圖 1），在結直腸腺瘤及其瘤旁組織、CRC及其癌旁組織中，COMT陽性染色主要定位于腺體細胞的胞質。結直腸腺瘤組織中COMT的高表達率為72.34%（34/47），高于瘤旁組織的25.53%（12/47），χ2=28.72，P < 0.01；CRC組織中COMT的高表達率為66.67%（28/42），高于癌旁組織的28.57%（12/42），χ2=4.97，P < 0.05。
圖1
COMT在結直腸腺瘤組織及其瘤旁組織、CRC組織及其癌旁組織中的表達結果，紅箭指示高表達，白箭指示低表達。1A：結直腸腺瘤組織（SP×400）；1B：結直腸腺瘤瘤旁組織（SP×1 000）；1C：CRC組織（SP×400）；1D：CRC癌旁組織（SP×1 000）
2.3 COMT表達與患者臨床病理特征的關系
在結直腸腺瘤組織中，COMT高表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位及病理學類型均無關（P > 0.05），見表 1。在CRC組織中，COMT高表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位及分化程度均無關（P > 0.05）；但與TNM分期、T分期及N分期均相關（P < 0.05），TNMⅠ+Ⅱ期、T1+T2期及N0期患者的COMT高表達率較高（表 1）。
表1
OMT表達與結直腸腺瘤和CRC臨床病理特征的關系（例）
3 討論
COMT是體內兒茶酚胺類物質的代謝酶，其可將兒茶酚雌激素——2-羥雌二醇（2-catechol estrogen，2-OHE2）、4-羥雌二醇（4-catechol estrogen，4-OHE2）和16α-羥雌二醇（16α-catechol estrogen，16α-OHE2）甲基化成無活性的甲氧雌激素，以減輕雌激素的致癌效應[6, 9]；其還通過促進兒茶酚雌激素代謝產物2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2-ME）來抑制腫瘤的增殖和促進凋亡的發生，以及抑制腫瘤血管的生成，從而發揮抑癌作用[10]。COMT的編碼基因位于第22號染色體q11.2區域，編碼合成膜結合型COMT和細胞質可溶性COMT，人體內細胞質可溶性COMT是其主要的表達形式[11-12]。本組免疫組化染色結果顯示，在結直腸腺瘤及其瘤旁組織、CRC及其癌旁組織中，COMT陽性染色主要定位于腺體細胞的胞質。
近年來研究表明，COMT基因及COMT基因多態性與雌激素代謝相關的腫瘤關系密切，如COMT MET158基因型與乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌等的發病相關[13-15]；COMT rs4818位點的基因多態性與乳腺癌患者的預后相關[16]；而COMT基因多態性導致的酶活性降低則促進子宮內膜癌的發生[17]，且COMT酶活性低的乳腺癌患者的淋巴結轉移率高[18]，同時乳腺癌患者的2-ME生成減少[19]。
結直腸雖不像乳腺、子宮內膜一樣與雌激素有著十分直接明顯的關系，但是對于CRC與雌激素的關系，自20世紀80年代以來就持續受到關注。流行病學研究[20]表明，女性的CRC發病率比男性低35%。絕經后婦女服用大豆以進行雌激素替代治療（HRT）相關研究[21]表明，雌激素可明顯降低CRC的發病率。一項針對SW480結腸癌細胞株的研究[22]表明，雌激素受體β能抑制結腸癌細胞的細胞周期途徑，進而抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。Cleveland等[23]的針對Apc小鼠的研究顯示，雌激素受體α和雌激素受體β可以參與調節CRC的發生，雌激素受體α還可以部分調節Wnt/beta-catenin途徑的活性，而Wnt/beta-catenin信號通路的異常激活被認為是結直腸黏膜發生腺瘤的關鍵啟動因素。研究[24]證實，雌激素和雌激素受體與CRC細胞的癌變、凋亡和轉移，以及CRC的病理學類型、疾病進展和預后均存在密切的聯系。在存在相同錯配修復缺陷的結腸癌患者中，女性患者所占的比例要低于男性[25]，表明甾體類激素可能會影響CRC的發生。抗雌激素藥物tamoxifen可以增加CRC的患病風險，而HRT可以將絕經后婦女的CRC發病率降低40%，并且還可以減小結直腸腺瘤的發病率及其瘤體體積[20]。因此，雌激素對CRC的保護作用被廣泛認可。但是WHI干預試驗結果[26]顯示，對于絕經后婦女給予雌激素+孕酮的HRT，雖然可以降低CRC的發病風險，但是卻提高了罹患乳腺癌以及心血管疾病的風險，所以目前仍然沒有作為臨床推薦的干預措施。而對于HRT的前景，有學者[26]考慮，是否可以采用聯合用藥方式，使藥物相互協同作用，以避免各自的副作用或不良后果。
北京協和醫院吳文銘等[7]在此前的研究中發現，COMT在CRC組織中的表達水平明顯高于正常組織，這與COMT在乳腺癌、子宮內膜癌及胰腺癌組織中的表達情況報道[27-29]相一致。本組資料結果也表明，結直腸腺瘤和CRC組織中COMT mRNA及其蛋白的表達水平均高于相應的癌（瘤）旁組織；COMT高表達與CRC的TNM分期、T分期及N分期相關，提示COMT參與了CRC的發生和發展，但具體機理尚不清楚。另一方面，絕經后女性行HRT可以降低CRC的發病風險，同時COMT基因的多態性與絕經后女性CRC患者的預后相關[30-31]。因此，筆者猜想，結直腸腺瘤及CRC組織中COMT mRNA及其蛋白表達上調的原因是細胞的應激反應或主動防御機制，以減少細胞內兒茶酚雌激素的蓄積或產生更多的2-ME。
綜上所述，COMT在CRC的發生和發展中可能發揮一定的作用，對其表達水平的檢測可以作為CRC早期診斷的標志物，這為CRC的診斷提供了一種思路。
