引用本文： 張成, 高廣榮, 李達, 呂赤, 單永琪, 張雪峰. 蛋白酶激活受體-2活化對胃癌MKN28細胞血管內皮細胞生長因子基因及蛋白表達的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(6): 665-670. doi: 10.7507/1007-9424.20150173 復制
腫瘤新生血管形成在胃癌的增殖、浸潤和轉移過程中均發揮了重要作用，但目前其分子機理尚未完全闡明。近年研究[1-2]發現，蛋白酶激活受體-2（protease-activated receptor-2，PAR-2）是重要的促血管生成因子，PAR-2活化后可促進多種組織的新生血管形成。其中，對血管內皮細胞等的研究[3-5]發現，激活細胞表面的PAR-2可上調血管內皮細胞生長因子（VEGF）的表達，進而促進新生血管形成。由于胃癌細胞表面有大量PAR-2表達[6-7]，胃癌組織內是否也存在這一調控機理，目前研究較少。筆者以此為切入點進行了系統研究，現將研究結果報道如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
胃癌MKN28細胞系由中國醫科大學腫瘤研究所提供。RPMI-1640培養基（Gibco BRL公司，美國）、胰蛋白酶（Amersco公司，美國）、VEGF抗體（Santa Cruz公司，美國）、Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）、熒光定量PCR（RT-PCR）試劑盒（大連TaKaRa公司）、聚偏二氟乙烯（PVDF）蛋白印跡膜（Bio-Rad公司，美國）、PCR引物（大連TaKaRa公司）、細胞外調節蛋白激酶（ERK）抑制劑PD98059及p38抑制劑SB203580（Sigma公司，美國），以及VEGF酶聯免疫試劑盒（ELISA試劑盒，深圳晶美公司）。主要設備：離心管（瑞典)、細胞培養專用超凈工作臺（蘇州）、Bio-Rad Mini-ProteinⅢ小型垂直電泳儀（美國）、ALPHAINNOTECH ChemiImager5500自動電泳凝膠成像分析儀（美國）、ABI7500熒光定量PCR儀（美國）、ELX800全自動酶標儀（美國）及GLS-700D型數碼凝膠掃描分析系統（上海）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
將胃癌MKN28細胞培養于25 cm2的培養瓶中，置于CO2孵箱內培養（37℃、100%濕度、5% CO2、95%空氣）。培養基采用RPMI-1640培養液（含2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素），同時調整滅活胎牛血清濃度為10%。當細胞生長達到90%融合后按1∶2傳代，傳2代后取對數生長期細胞進行實驗。預定實驗前先將細胞置于無血清培養基內過夜，實驗前1.0～1.5 h再次更換無血清培養基。收集細胞，調整細胞濃度大于1×106個/mL以用于后續實驗。所有操作均在無菌條件下進行。
1.2.2 實驗分組及處理
①不同濃度胰蛋白酶的作用：將胃癌MKN28細胞懸液分為空白對照組（加入PBS溶液）及4個不同濃度胰蛋白酶干預組，胰蛋白酶的終濃度分別為0、0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L，均作用6 h。每組含細胞懸液5 mL。檢測每組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達，同時檢測培養液中VEGF蛋白的濃度。重復實驗3次。②胰蛋白酶不同干預時間的影響：將胃癌MKN28細胞懸液分為空白對照組（加入PBS溶液）及4個不同胰蛋白酶干預時間組，4個干預時間組中胰蛋白酶的終濃度均為10.0 nmol/L，分別干預3、6、12及24 h。每組含細胞懸液5 mL。檢測每組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達，同時檢測培養液中VEGF蛋白的濃度。重復實驗3次。③檢測胰蛋白酶活化后ERK抑制劑（PD98059）及p38抑制劑（SB203580）對胃癌MKN28細胞中VEGF mRNA及其蛋白表達的影響：將細胞分為空白對照組、胰蛋白酶組、胰蛋白酶+PD98059組、胰蛋白酶+SB203580組、PD98059組和SB203580組。前2組給予等量的二甲基亞砜（DMSO）；胰蛋白酶組、胰蛋白酶+PD98059組及胰蛋白酶+SB203580組中胰蛋白酶的終濃度均為10.0 nmol/L；胰蛋白酶+PD98059組、胰蛋白酶+SB203580組、PD98059組和SB203580組分別給予PD98059（終濃度為25μmol/L）或SB203580（終濃度為20μmol/L）預處理1 h；空白對照組加入PBS溶液。6組的作用時間均為6 h。檢測每組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達。重復實驗3次。
1.2.3 熒光定量PCR法檢測VEGF mRNA的表達
RNA提取：采用Trizol一步法提取RNA。將RNA通過逆轉錄獲得cDNA（操作按試劑盒說明書進行）后，進行PCR擴增，并以β-actin作為內參照。VEGF基因引物序列：上游5′-TGACGGACAGACAGACAGA-CACC-3′，下游5′-AGAACAGCCCAGAAGTTGGAC-GA-3′，擴增片段長度為208 bp；β-actin引物序列：上游5′-TCATCACCATTGGCAATGAG-3′，下游5′-CA-CTGTGTTGGCGTACAGGT-3′，擴增片段長度為155 bp。PCR反應條件：95℃、0.5 min預變性；95℃、30 s，60℃、34 s，進行40個循環后，60℃1 min延伸；最后以95℃、0.15 s終止反應。PCR反應體系同試劑盒說明書。根據標準曲線，采用熒光定量PCR儀自動分析循環閾值（Ct）值，按2-△△Ct法計算VEGF mRNA的相對表達水平。
1.2.4 Western blot法檢測VEGF蛋白的表達
在細胞懸液中（40μL）加入4倍體積的細胞裂解液，2 000×g離心20 min。收集上清液，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離樣品后（40μg）將樣品電轉移至硝酸纖維膜上，以牛血清白蛋白（BSA）封閉1～2 h后，加入VEGF一抗（1∶1 000），室溫下免疫沉淀1 h后，搖洗并4℃過夜；再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體（IgG-HRP，1∶2 000），于室溫下作用2 h；最后以化學發光（ECL）浸膜，顯影。采用圖像分析儀對膠片進行分析，記錄相應蛋白條帶的灰度值，以VEGF蛋白和β-actin灰度值的比值作為VEGF蛋白的相對表達水平。
1.2.5 ELISA法檢測培養液中VEGF蛋白的濃度
采用ELISA法檢測培養液中VEGE蛋白的濃度，操作嚴格按試劑盒說明書進行。
1.3 統計學方法
采用SPSS 11.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 胰蛋白酶對MKN28細胞中VEGF mRNA表達的影響
①與空白對照組比較，0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF mRNA的表達水平均較高（P < 0.05）；與0.1 nmol/L組比較，1.0、10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF mRNA的表達水平均較高（P < 0.05）；與1.0 nmol/L組比較，10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF mRNA的表達水平均較高（P < 0.05），但10.0 nmol/L組與100.0 nmol/L組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 1。②空白對照組、3 h組、6 h組、12 h組及24 h組細胞中VEGF mRNA的表達水平逐漸遞增，5組間兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 2。
圖1
示不同濃度胰蛋白酶組細胞中VEGF mRNA的表達水平結果。與空白對照組比較，* P < 0.05；與0.1 nmol/L組比較，# P < 0.05；與1.0 nmol/L組比較，△P < 0.05??圖 2??示胰蛋白酶不同干預時間組細胞中VEGF mRNA的表達水平結果，5組間兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.05）
2.2 胰蛋白酶對MKN28細胞中VEGF蛋白表達的影響
①與空白對照組比較，0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF蛋白的表達水平均較高（P < 0.05）；與0.1 nmol/L組比較，1.0、10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF蛋白的表達水平均較高（P < 0.05）；與1.0 nmol/L組比較，10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF蛋白的表達水平均較高（P < 0.05），但10.0 nmol/L組與100.0 nmol/L組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 3和圖 4。②與空白對照組比較，3、6、12及24 h組細胞中VEGF蛋白的表達水平均較高（P < 0.05）；與3 h組比較，6、12及24 h組細胞中VEGF蛋白的表達水平均較高（P < 0.05），但6、12及24 h組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 5和圖 6。
圖3
示不同濃度胰蛋白酶組細胞中VEGF蛋白的表達水平結果。與空白對照組比較，* P < 0.05；與0.1 nmol/L組比較，# P < 0.05；與1.0 nmol/L組比較，△P < 0.05??圖 4??示不同濃度胰蛋白酶組細胞中VEGF蛋白的電泳結果。1：空白對照組；2：0.1 nmol/L組；3：1.0 nmol/L組；4：10.0 nmol/L組；5：100.0 nmol/L組??圖 5??示不同干預時間組細胞中VEGF蛋白的表達水平結果。與空白對照組比較，* P < 0.05；與3 h組比較，# P < 0.05??圖 6??示不同干預時間組細胞中VEGF蛋白的電泳結果。1：空白對照組；2：3 h組；3：6 h組；4：12 h組；5：24 h組??圖 7??示不同濃度胰蛋白酶組培養液中VEGF蛋白的濃度結果，5組間兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.05）??圖 8??示不同干預時間組培養液中VEGF蛋白的濃度結果，5組間兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.05）??圖 9??6組細胞中VEGF mRNA的表達結果。與其余組別比較，* P < 0.01??圖 10??示6組細胞中VEGF蛋白的表達結果。與其余組別比較，* P < 0.01??圖 11??示6組細胞中VEGF蛋白的電泳結果。1：空白對照組；2：胰蛋白酶組；3：胰蛋白酶+PD98059組；4：胰蛋白酶+SB203580組；5：PD98059組；6：SB203580組
2.3 胰蛋白酶對培養液中VEGF蛋白濃度的影響
①空白對照組、0.1 nmol/L組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組及100.0 nmol/L組培養液中VEGF蛋白的濃度逐漸遞增，5組間兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.05），見圖 7。②空白對照組、3 h組、6 h組、12 h組及24 h組培養液中VEGF蛋白的濃度逐漸遞增，5組間兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.05），見圖 8。
2.4 ERK抑制劑及p38抑制劑對胰蛋白酶作用后VEGF mRNA及其蛋白表達的影響
空白對照組、胰蛋白酶+PD98059組、胰蛋白酶+SB203580組、PD98059組以及SB203580組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05），但胰蛋白酶組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達水平均較其余5組相應的指標高（P < 0.01），見圖 9～11。
3 討論
PAR-2是一種特殊的G蛋白偶聯受體，廣泛分布于胃腸道上皮細胞表面[7-10]。PAR-2的配體胰蛋白酶通過裂解受體的方式激活PAR-2，由于胃腸道內始終存在高濃度的胰蛋白酶，因此PAR-2對消化道功能的影響極大。研究[11-12]表明，包括胃癌在內的許多消化道腫瘤細胞表面也大量表達PAR-2，而且其表達與胃癌的浸潤深度、肝臟轉移和脈管浸潤均密切相關。進一步研究發現，胃癌細胞的PAR-2被激活后，腫瘤細胞可以通過表皮生長因子受體（EGFR）轉活的方式促進細胞增殖[13]。通過對結腸癌和肺癌細胞的研究，也發現了類似的增殖機理[14-17]。
腫瘤細胞的增殖和轉移離不開新生血管形成，而PAR-2具有促新生血管形成的作用。研究[1, 3]證實，激活血管內皮細胞表面的PAR-2后，VEGF蛋白的表達上調，從而促進新生血管形成。但對胰腺癌SUIT2和MiaPaCa2細胞的研究[18]結果卻表明：激活PAR-2后未見VEGF蛋白的表達上調。這種差異可能是由于細胞的異質性造成的，也可能存在我們尚不了解的機理。鑒于關于胃癌細胞PAR-2活化對VEGF表達的影響研究較少，筆者檢測了胃癌MKN28細胞中PAR-2激活后VEGF基因及其蛋白表達的變化，并對絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路在其中的調控作用進行了研究。筆者發現，激活MKN28細胞表面的PAR-2后，空白對照組、0.1 nmol/L組、1.0 nmol/L組及10.0 nmol/L組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達水平遞增（P < 0.05），但10.0 nmol/L組與100.0 nmol/L組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達水平比較差異無統計學意義（P > 0.05）。分析其原因，一方面可能受PAR-2不可逆激活特性的影響，10.0 nmol/L胰蛋白酶時受體就已經達到了飽和；另一方面由于信號強度只與受體激活的速度有關，10.0 nmol/L時已達到峰濃度，再增加配體濃度也不會增加信號轉導的幅度。此外，本實驗結果還表明，隨著干預時間的延長，細胞中VEGF mRNA的表達逐漸上調，而VEGF蛋白的表達在0～6 h內逐漸上調（mRNA及蛋白的表達可能不一致）；培養液中VEGF蛋白的濃度隨著胰蛋白酶濃度的增加和時間的延長逐漸升高。該結果提示，PAR-2活化可以上調VEGF mRNA及其蛋白的表達。
不同細胞表面的PAR-2被激活后其MAPK信號轉導通路活化的途徑表現出很大的差異性，活化途徑包括單獨激活ERK1/2，單獨激活p38，同時激活ERK1/2和p38，同時激活ERK1/2、p38及c-Jun氨基末端激酶（JNK）3條MAPK通路和交叉激活ERK1/2和p38 [19-23]。因此，筆者觀察了ERK和p38抑制劑在PAR-2調控MKN28細胞VEGF表達中的作用。結果發現，胰蛋白酶組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達水平均較胰蛋白酶+PD98059組和胰蛋白酶+SB203580組高（P < 0.05），提示預防性應用ERK和p38抑制劑后，VEGF mRNA及其蛋白的表達明顯下調，提示ERK及p38抑制劑都可以阻斷VEGF mRNA及其蛋白的表達。這表明，PAR-2被激活后這兩條MAPK信號轉導通路都參與了信號轉導，都可以調控VEGF mRNA及其蛋白的表達。
腫瘤新生血管形成是涉及一系列病理及生理改變的精密調控過程，被認為是腫瘤進展和轉移的關鍵步驟。大多數情況下，缺氧是導致VEGF蛋白等血管生成因子產生及新生血管形成的主要刺激因素，但本實驗結果表明，在非缺氧環境下腫瘤細胞還可以通過PAR-2配體（胰蛋白酶）與PAR-2受體間的正反饋機理促進新生血管的形成。本實驗檢驗了PAR-2活化對胃癌MKN28細胞中VEGF mRNA及其蛋白表達的影響，并探討了MAPK信號轉導途徑在這一過程中的調控作用。實驗結果表明，PAR-2活化可以上調VEGF mRNA及其蛋白的表達；阻斷ERK和p38其中任何一條信號轉導通路都可以抑制VEGF mRNA及其蛋白的表達。雖然筆者只研究了MKN28這一種胃癌細胞系，結果不能推廣至全部胃癌細胞，但本實驗使我們對PAR-2在胃癌新生血管形成中的作用有了新的認識。
腫瘤新生血管形成在胃癌的增殖、浸潤和轉移過程中均發揮了重要作用，但目前其分子機理尚未完全闡明。近年研究[1-2]發現，蛋白酶激活受體-2（protease-activated receptor-2，PAR-2）是重要的促血管生成因子，PAR-2活化后可促進多種組織的新生血管形成。其中，對血管內皮細胞等的研究[3-5]發現，激活細胞表面的PAR-2可上調血管內皮細胞生長因子（VEGF）的表達，進而促進新生血管形成。由于胃癌細胞表面有大量PAR-2表達[6-7]，胃癌組織內是否也存在這一調控機理，目前研究較少。筆者以此為切入點進行了系統研究，現將研究結果報道如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
胃癌MKN28細胞系由中國醫科大學腫瘤研究所提供。RPMI-1640培養基（Gibco BRL公司，美國）、胰蛋白酶（Amersco公司，美國）、VEGF抗體（Santa Cruz公司，美國）、Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）、熒光定量PCR（RT-PCR）試劑盒（大連TaKaRa公司）、聚偏二氟乙烯（PVDF）蛋白印跡膜（Bio-Rad公司，美國）、PCR引物（大連TaKaRa公司）、細胞外調節蛋白激酶（ERK）抑制劑PD98059及p38抑制劑SB203580（Sigma公司，美國），以及VEGF酶聯免疫試劑盒（ELISA試劑盒，深圳晶美公司）。主要設備：離心管（瑞典)、細胞培養專用超凈工作臺（蘇州）、Bio-Rad Mini-ProteinⅢ小型垂直電泳儀（美國）、ALPHAINNOTECH ChemiImager5500自動電泳凝膠成像分析儀（美國）、ABI7500熒光定量PCR儀（美國）、ELX800全自動酶標儀（美國）及GLS-700D型數碼凝膠掃描分析系統（上海）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
將胃癌MKN28細胞培養于25 cm2的培養瓶中，置于CO2孵箱內培養（37℃、100%濕度、5% CO2、95%空氣）。培養基采用RPMI-1640培養液（含2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素），同時調整滅活胎牛血清濃度為10%。當細胞生長達到90%融合后按1∶2傳代，傳2代后取對數生長期細胞進行實驗。預定實驗前先將細胞置于無血清培養基內過夜，實驗前1.0～1.5 h再次更換無血清培養基。收集細胞，調整細胞濃度大于1×106個/mL以用于后續實驗。所有操作均在無菌條件下進行。
1.2.2 實驗分組及處理
①不同濃度胰蛋白酶的作用：將胃癌MKN28細胞懸液分為空白對照組（加入PBS溶液）及4個不同濃度胰蛋白酶干預組，胰蛋白酶的終濃度分別為0、0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L，均作用6 h。每組含細胞懸液5 mL。檢測每組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達，同時檢測培養液中VEGF蛋白的濃度。重復實驗3次。②胰蛋白酶不同干預時間的影響：將胃癌MKN28細胞懸液分為空白對照組（加入PBS溶液）及4個不同胰蛋白酶干預時間組，4個干預時間組中胰蛋白酶的終濃度均為10.0 nmol/L，分別干預3、6、12及24 h。每組含細胞懸液5 mL。檢測每組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達，同時檢測培養液中VEGF蛋白的濃度。重復實驗3次。③檢測胰蛋白酶活化后ERK抑制劑（PD98059）及p38抑制劑（SB203580）對胃癌MKN28細胞中VEGF mRNA及其蛋白表達的影響：將細胞分為空白對照組、胰蛋白酶組、胰蛋白酶+PD98059組、胰蛋白酶+SB203580組、PD98059組和SB203580組。前2組給予等量的二甲基亞砜（DMSO）；胰蛋白酶組、胰蛋白酶+PD98059組及胰蛋白酶+SB203580組中胰蛋白酶的終濃度均為10.0 nmol/L；胰蛋白酶+PD98059組、胰蛋白酶+SB203580組、PD98059組和SB203580組分別給予PD98059（終濃度為25μmol/L）或SB203580（終濃度為20μmol/L）預處理1 h；空白對照組加入PBS溶液。6組的作用時間均為6 h。檢測每組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達。重復實驗3次。
1.2.3 熒光定量PCR法檢測VEGF mRNA的表達
RNA提取：采用Trizol一步法提取RNA。將RNA通過逆轉錄獲得cDNA（操作按試劑盒說明書進行）后，進行PCR擴增，并以β-actin作為內參照。VEGF基因引物序列：上游5′-TGACGGACAGACAGACAGA-CACC-3′，下游5′-AGAACAGCCCAGAAGTTGGAC-GA-3′，擴增片段長度為208 bp；β-actin引物序列：上游5′-TCATCACCATTGGCAATGAG-3′，下游5′-CA-CTGTGTTGGCGTACAGGT-3′，擴增片段長度為155 bp。PCR反應條件：95℃、0.5 min預變性；95℃、30 s，60℃、34 s，進行40個循環后，60℃1 min延伸；最后以95℃、0.15 s終止反應。PCR反應體系同試劑盒說明書。根據標準曲線，采用熒光定量PCR儀自動分析循環閾值（Ct）值，按2-△△Ct法計算VEGF mRNA的相對表達水平。
1.2.4 Western blot法檢測VEGF蛋白的表達
在細胞懸液中（40μL）加入4倍體積的細胞裂解液，2 000×g離心20 min。收集上清液，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離樣品后（40μg）將樣品電轉移至硝酸纖維膜上，以牛血清白蛋白（BSA）封閉1～2 h后，加入VEGF一抗（1∶1 000），室溫下免疫沉淀1 h后，搖洗并4℃過夜；再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體（IgG-HRP，1∶2 000），于室溫下作用2 h；最后以化學發光（ECL）浸膜，顯影。采用圖像分析儀對膠片進行分析，記錄相應蛋白條帶的灰度值，以VEGF蛋白和β-actin灰度值的比值作為VEGF蛋白的相對表達水平。
1.2.5 ELISA法檢測培養液中VEGF蛋白的濃度
采用ELISA法檢測培養液中VEGE蛋白的濃度，操作嚴格按試劑盒說明書進行。
1.3 統計學方法
采用SPSS 11.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 胰蛋白酶對MKN28細胞中VEGF mRNA表達的影響
①與空白對照組比較，0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF mRNA的表達水平均較高（P < 0.05）；與0.1 nmol/L組比較，1.0、10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF mRNA的表達水平均較高（P < 0.05）；與1.0 nmol/L組比較，10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF mRNA的表達水平均較高（P < 0.05），但10.0 nmol/L組與100.0 nmol/L組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 1。②空白對照組、3 h組、6 h組、12 h組及24 h組細胞中VEGF mRNA的表達水平逐漸遞增，5組間兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 2。
圖1
示不同濃度胰蛋白酶組細胞中VEGF mRNA的表達水平結果。與空白對照組比較，* P < 0.05；與0.1 nmol/L組比較，# P < 0.05；與1.0 nmol/L組比較，△P < 0.05??圖 2??示胰蛋白酶不同干預時間組細胞中VEGF mRNA的表達水平結果，5組間兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.05）
2.2 胰蛋白酶對MKN28細胞中VEGF蛋白表達的影響
①與空白對照組比較，0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF蛋白的表達水平均較高（P < 0.05）；與0.1 nmol/L組比較，1.0、10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF蛋白的表達水平均較高（P < 0.05）；與1.0 nmol/L組比較，10.0及100.0 nmol/L組細胞中VEGF蛋白的表達水平均較高（P < 0.05），但10.0 nmol/L組與100.0 nmol/L組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 3和圖 4。②與空白對照組比較，3、6、12及24 h組細胞中VEGF蛋白的表達水平均較高（P < 0.05）；與3 h組比較，6、12及24 h組細胞中VEGF蛋白的表達水平均較高（P < 0.05），但6、12及24 h組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 5和圖 6。
圖3
示不同濃度胰蛋白酶組細胞中VEGF蛋白的表達水平結果。與空白對照組比較，* P < 0.05；與0.1 nmol/L組比較，# P < 0.05；與1.0 nmol/L組比較，△P < 0.05??圖 4??示不同濃度胰蛋白酶組細胞中VEGF蛋白的電泳結果。1：空白對照組；2：0.1 nmol/L組；3：1.0 nmol/L組；4：10.0 nmol/L組；5：100.0 nmol/L組??圖 5??示不同干預時間組細胞中VEGF蛋白的表達水平結果。與空白對照組比較，* P < 0.05；與3 h組比較，# P < 0.05??圖 6??示不同干預時間組細胞中VEGF蛋白的電泳結果。1：空白對照組；2：3 h組；3：6 h組；4：12 h組；5：24 h組??圖 7??示不同濃度胰蛋白酶組培養液中VEGF蛋白的濃度結果，5組間兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.05）??圖 8??示不同干預時間組培養液中VEGF蛋白的濃度結果，5組間兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.05）??圖 9??6組細胞中VEGF mRNA的表達結果。與其余組別比較，* P < 0.01??圖 10??示6組細胞中VEGF蛋白的表達結果。與其余組別比較，* P < 0.01??圖 11??示6組細胞中VEGF蛋白的電泳結果。1：空白對照組；2：胰蛋白酶組；3：胰蛋白酶+PD98059組；4：胰蛋白酶+SB203580組；5：PD98059組；6：SB203580組
2.3 胰蛋白酶對培養液中VEGF蛋白濃度的影響
①空白對照組、0.1 nmol/L組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組及100.0 nmol/L組培養液中VEGF蛋白的濃度逐漸遞增，5組間兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.05），見圖 7。②空白對照組、3 h組、6 h組、12 h組及24 h組培養液中VEGF蛋白的濃度逐漸遞增，5組間兩兩比較差異有統計學意義（P < 0.05），見圖 8。
2.4 ERK抑制劑及p38抑制劑對胰蛋白酶作用后VEGF mRNA及其蛋白表達的影響
空白對照組、胰蛋白酶+PD98059組、胰蛋白酶+SB203580組、PD98059組以及SB203580組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05），但胰蛋白酶組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達水平均較其余5組相應的指標高（P < 0.01），見圖 9～11。
3 討論
PAR-2是一種特殊的G蛋白偶聯受體，廣泛分布于胃腸道上皮細胞表面[7-10]。PAR-2的配體胰蛋白酶通過裂解受體的方式激活PAR-2，由于胃腸道內始終存在高濃度的胰蛋白酶，因此PAR-2對消化道功能的影響極大。研究[11-12]表明，包括胃癌在內的許多消化道腫瘤細胞表面也大量表達PAR-2，而且其表達與胃癌的浸潤深度、肝臟轉移和脈管浸潤均密切相關。進一步研究發現，胃癌細胞的PAR-2被激活后，腫瘤細胞可以通過表皮生長因子受體（EGFR）轉活的方式促進細胞增殖[13]。通過對結腸癌和肺癌細胞的研究，也發現了類似的增殖機理[14-17]。
腫瘤細胞的增殖和轉移離不開新生血管形成，而PAR-2具有促新生血管形成的作用。研究[1, 3]證實，激活血管內皮細胞表面的PAR-2后，VEGF蛋白的表達上調，從而促進新生血管形成。但對胰腺癌SUIT2和MiaPaCa2細胞的研究[18]結果卻表明：激活PAR-2后未見VEGF蛋白的表達上調。這種差異可能是由于細胞的異質性造成的，也可能存在我們尚不了解的機理。鑒于關于胃癌細胞PAR-2活化對VEGF表達的影響研究較少，筆者檢測了胃癌MKN28細胞中PAR-2激活后VEGF基因及其蛋白表達的變化，并對絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路在其中的調控作用進行了研究。筆者發現，激活MKN28細胞表面的PAR-2后，空白對照組、0.1 nmol/L組、1.0 nmol/L組及10.0 nmol/L組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達水平遞增（P < 0.05），但10.0 nmol/L組與100.0 nmol/L組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達水平比較差異無統計學意義（P > 0.05）。分析其原因，一方面可能受PAR-2不可逆激活特性的影響，10.0 nmol/L胰蛋白酶時受體就已經達到了飽和；另一方面由于信號強度只與受體激活的速度有關，10.0 nmol/L時已達到峰濃度，再增加配體濃度也不會增加信號轉導的幅度。此外，本實驗結果還表明，隨著干預時間的延長，細胞中VEGF mRNA的表達逐漸上調，而VEGF蛋白的表達在0～6 h內逐漸上調（mRNA及蛋白的表達可能不一致）；培養液中VEGF蛋白的濃度隨著胰蛋白酶濃度的增加和時間的延長逐漸升高。該結果提示，PAR-2活化可以上調VEGF mRNA及其蛋白的表達。
不同細胞表面的PAR-2被激活后其MAPK信號轉導通路活化的途徑表現出很大的差異性，活化途徑包括單獨激活ERK1/2，單獨激活p38，同時激活ERK1/2和p38，同時激活ERK1/2、p38及c-Jun氨基末端激酶（JNK）3條MAPK通路和交叉激活ERK1/2和p38 [19-23]。因此，筆者觀察了ERK和p38抑制劑在PAR-2調控MKN28細胞VEGF表達中的作用。結果發現，胰蛋白酶組細胞中VEGF mRNA及其蛋白的表達水平均較胰蛋白酶+PD98059組和胰蛋白酶+SB203580組高（P < 0.05），提示預防性應用ERK和p38抑制劑后，VEGF mRNA及其蛋白的表達明顯下調，提示ERK及p38抑制劑都可以阻斷VEGF mRNA及其蛋白的表達。這表明，PAR-2被激活后這兩條MAPK信號轉導通路都參與了信號轉導，都可以調控VEGF mRNA及其蛋白的表達。
腫瘤新生血管形成是涉及一系列病理及生理改變的精密調控過程，被認為是腫瘤進展和轉移的關鍵步驟。大多數情況下，缺氧是導致VEGF蛋白等血管生成因子產生及新生血管形成的主要刺激因素，但本實驗結果表明，在非缺氧環境下腫瘤細胞還可以通過PAR-2配體（胰蛋白酶）與PAR-2受體間的正反饋機理促進新生血管的形成。本實驗檢驗了PAR-2活化對胃癌MKN28細胞中VEGF mRNA及其蛋白表達的影響，并探討了MAPK信號轉導途徑在這一過程中的調控作用。實驗結果表明，PAR-2活化可以上調VEGF mRNA及其蛋白的表達；阻斷ERK和p38其中任何一條信號轉導通路都可以抑制VEGF mRNA及其蛋白的表達。雖然筆者只研究了MKN28這一種胃癌細胞系，結果不能推廣至全部胃癌細胞，但本實驗使我們對PAR-2在胃癌新生血管形成中的作用有了新的認識。
