引用本文： 席小龍, 姜波健, 俞繼衛. HOTAIR在CD133陽性胃癌細胞中的表達及其作用研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(6): 659-664. doi: 10.7507/1007-9424.20150172 復制
胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，在癌癥相關死亡中位列第三[1]。胃癌的發病率高、進展快，手術治療后易復發和轉移。胃癌干細胞是胃癌發生轉移、復發以及化療耐藥的重要原因。研究胃癌干細胞時主要以CD133、CD44等作為其細胞表面標志物[2-3]。在胃癌中，CD133的表達與化療耐藥和胃癌復發均密切相關[4]。本課題組前期研究[5]表明，胃癌CD133陽性細胞的遷移及侵襲能力均高于CD133陰性細胞，且其遷移與侵襲與胃癌細胞發生上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切相關。長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）是一類長度大于200 nt的不編碼任何蛋白的核糖核酸分子。雖然LncRNA不編碼任何蛋白，但其通過染色質修飾、轉錄激活與干擾等參與細胞內多種調控過程[6]。同源基因轉錄反義基因間RNA（HOTAIR）為LncRNA的一種類型，近年來成為研究的熱點。最新研究[7-9]表明，HOTAIR在乳腺癌、結腸癌、胰腺癌等腫瘤組織中的表達明顯上調，并與腫瘤侵襲、轉移及預后均呈正相關。然而，目前HOTAIR在胃癌干細胞中的作用尚不清楚。因此，本實驗進一步研究了HOTAIR在胃癌干細胞中的表達及其作用。
1 材料和方法
1.1 主要材料、試劑及設備
人胃癌KATO-Ⅲ細胞株購自美國ATCC公司，脂質體2000購自美國Invitrogen公司，Trizol試劑、PCR試劑盒、DNA loading buffer及DNA分子標準均購自日本Takara公司，CD133分選試劑盒購自德國Miltenyi公司，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶及0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）均購自美國Gibco公司，焦磷酸二乙酯（DEPC）水和結晶紫染液均購自中國江蘇碧云天生物公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇、電泳液及瓊脂糖粉均購自北京鼎國生物公司，DuGreen染液購自中國北京泛博生物化學有限公司。目的基因CD133、HOTAIR、E-鈣黏素（E-cadherin）、N-鈣黏素（N-cadherin）以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物序列均由中國上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成；小干擾RNA（siRNA）干擾序列由中國上海吉瑪生物制藥有限公司設計合成。細胞培養皿、基質膠和Transwell小室均購自美國Corning公司。設備：電熱恒溫培養箱和-80℃超低溫冰箱均購自美國Revco公司，生物安全柜購自美國Thermal公司，高壓消毒鍋、水浴鍋及超純水儀均購自日本Hirayama公司，紫外分光光度計、PCR擴增儀、凝膠掃描儀及凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad公司，電子天平購自德國Sartorius公司，倒置相差顯微鏡和數碼照相機均購自日本Olympus公司，高壓電泳儀購自中國上海天馬生物公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養及免疫磁珠分選
人胃癌KATO-Ⅲ細胞培養及免疫磁珠分選參照本課題組前期實驗[10]的步驟進行。分選后的細胞用含20μg/L上皮生長因子（EGF）及10μg/L堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的無血清伊思考夫改良杜爾貝可培養基（IMDM培養基）重懸培養，以供后續實驗使用。同時檢測CD133陽性組、CD133陰性組及未分選組細胞中CD133 mRNA和HOTAIR mRNA的表達水平。
1.2.2 半定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測相關mRNA的表達
以Trizol法提取總RNA。取500 ng總RNA逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增（操作按試劑盒說明書進行）。CD133基因的上游引物：5′-TTA-CGGCACTCTTCACCT-3′，下游引物：5′-TATTCCA-CAAGCAGCAAA-3′，產物長度為172 bp，退火溫度為55℃；HOTAIR基因的上游引物：5′-TTAGGAGGC-CCAAACAGAGT-3′，下游引物：5′-GGCTAGGGCT-GGTTTCACTT-3′，產物長度為320 bp，退火溫度為55℃；E-cadherin基因的上游引物：5′-TGCCCAGA-AAATGAAAAAGG-3′，下游引物：5′-GTGTATGTG-GCAATGCGTTC-3′，產物長度為200 bp，退火溫度為50℃；N-cadherin基因的上游引物：5′-ACAGTGGC-CACCTACAAAGG-3′，下游引物：5′-CCGAGATGG-GGTTGATAATG-3′，產物長度為201 bp，退火溫度為54℃；GAPDH為內參，其基因的上游引物：5′-ACG-GATTTGGTCGTATTGGGCG-3′，下游引物：5′-CTC-CTGGAAGATGGTGATGG-3′，產物長度為197 bp，退火溫度為55℃。分別取2μL GAPDH的PCR產物、5μL以上各待測樣品的PCR產物，在含2%瓊脂糖凝膠的電泳槽中進行電泳，采用凝膠成像系統保存電泳條帶的圖像，并以凝膠圖像分析軟件分析電泳產物的灰度值，以目的基因和GAPDH灰度值的比值表示目的基因的相對表達水平。每組重復實驗3次。
1.2.3 siRNA的合成及轉染
根據HOTAIR的基因序列，設計并合成3段HOTAIR干擾序列（siHOTAIR）及陰性干擾序列（表 1）。轉染所用細胞為分選后的CD133陽性細胞。將CD133陽性細胞分為5組：空白對照組（BC組）、陰性對照組（NC組）和3個干擾組（siHOTAIR1組、siHOTAIR2組及siHOTAIR3組），接種于含IMDM完全培養基（含10%胎牛血清）的6孔板內，細胞密度為（2～5）×105個/孔。每組設3個復孔。培養24 h、待融合度達到70%～90%時進行轉染（轉染操作按試劑盒說明書進行）。轉染后進行細胞培養，培養48 h后收集細胞，用RT-PCR法檢測HOTAIR mRNA的表達水平，選擇沉默效果最好的干擾基因進行后續實驗。確定干擾序列為siHOTAIR2后，將CD133陽性細胞分為3組：空白對照組（BC組）、陰性對照組（NC組）和siHOTAIR2組。分別進行轉染，步驟同前。轉染后進行細胞培養，培養48 h后收集細胞，再采用RT-PCR法檢測3組細胞中CD133 mRNA、E-cadherin mRNA及N-cadherin mRNA的表達水平，并開展Transwell實驗。
表1
4種siRNA序列
1.2.4 Transwell實驗檢測人胃癌KATO-Ⅲ細胞的侵襲（遷移）能力
收集上述3組細胞以進行Transwell實驗。將基質膠以1∶1的比例用無血清IMDM培養液稀釋混勻后，取50μL鋪于Transwell上室中，置于37℃、5% CO2培養箱中，待上室的基質膠凝結（細胞遷移實驗則無需鋪基質膠）。收集對數生長期的人胃癌KATO-Ⅲ細胞，用無血清IMDM培養基重懸成單個細胞〔密度為（1～2）×106個/mL）〕。取100μL細胞懸液加入Transwell上室中，調整每孔細胞濃度為（1～5）×105個；Transwell下室中加入含有20%胎牛血清的IMDM完全培養基。將上述處理后的細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去上室中的基質膠及細胞（細胞遷移實驗只需拭去上室細胞），行4%多聚甲醛固定、0.1%結晶紫染色，在高倍鏡下（100倍）平移非重疊觀察9個視野，計數其中同時穿過基質膠及Transwell膜的穿膜細胞數（細胞遷移實驗則計數穿過Transwell膜的穿膜細胞數），并計算平均數。每組重復實驗3次。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 CD133陽性組、CD133陰性組及未分選組細胞中CD133 mRNA及HOTAIR mRNA的表達結果
RT-PCR檢測結果表明，CD133陽性組細胞中CD133 mRNA和HOTAIR mRNA的表達水平均高于CD133陰性組和未分選組（P < 0.05），而CD133陰性組和未分選組細胞中CD133 mRNA和HOTAIR mRNA表達水平的差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 1和圖 2。
圖1
示3組細胞中CD133 mRNA及HOTAIR mRNA的瓊脂糖凝膠電泳結果。1A：CD133 mRNA；1B：HOTAIR mRNA。1：CD133陽性組；2：CD133陰性組；3：未分選組??圖 2??示CD133陽性組、CD133陰性組及未分選組細胞中CD133 mRNA及HOTAIR mRNA的表達水平結果。與CD133陽性組相應指標比較，* P < 0.05??圖 3??示5組細胞中HOTAIR mRNA的瓊脂糖凝膠電泳結果。1：siHOTAIR1組；2：siHOTAIR2組；3：siHOTAIR3組；4：NC組；5：BC組??圖 4??示5組細胞中HOTAIR mRNA的表達水平結果。與NC組和BC組比較，* P < 0.05；與siHOTAIR1組比較，# P < 0.05；與siHOTAIR2組比較，△P < 0.05??圖 5??示3組細胞中CD133 mRNA、E-cadherin mRNA及N-cadherin mRNA的瓊脂糖凝膠電泳結果。5A：CD133 mRNA；5B：E-cadherin mRNA；5C：N-cadherin mRNA。1：siHOTAIR2組；2：NC組；3：BC組??圖 6??示3組細胞中CD133 mRNA、E-cadherin mRNA及N-cadherin mRNA的表達水平結果。與siHOTAIR2組相應指標比較，* P < 0.05??圖 7??示3組Transwell實驗的穿膜細胞數。與siHOTAIR2組相應指標比較，* P < 0.05??圖 8??示3組細胞的遷移實驗結果（結晶紫染色×100）。8A：siHOTAIR2組；8B：NC組；8C：BC組??圖 9??示3組
2.2 siHOTAIR干擾后細胞中HOTAIR mRNA的表達結果
RT-PCR檢測結果表明，BC組和NC組細胞中HOTAIR mRNA表達水平的差異無統計學意義（P > 0.05）；與BC組和NC組比較，siHOTAIR1組、siHOTAIR2組及siHOTAIR3組細胞中HOTAIR mRNA的表達水平均較低（P < 0.05）；siHOTAIR1組、siHOTAIR2組及siHOTAIR3組細胞中HOTAIR mRNA的表達水平以siHOTAIR2組最低，siHOTAIR1組最高，3組間兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 3和圖 4。該結果表明，siHOAIR2的沉默效果最好，故選擇siHOAIR2序列用于后續實驗。
2.3 siHOTAIR2干擾后細胞中CD133 mRNA、N-cadherin mRNA及E-cadherin mRNA的表達結果
RT-PCR檢測結果表明，siHOTAIR2組細胞中CD133 mRNA和N-cadherin mRNA的表達水平均低于NC組和BC組（P < 0.05），但E-cadherin mRNA的表達水平卻高于NC組和BC組（P < 0.05）；NC組和BC組細胞中CD133 mRNA、N-cadherin mRNA及E-cadherin mRNA的表達水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05），見圖 5和圖 6。
2.4 siHOTAIR2干擾后細胞的遷移及侵襲能力
siHOTAIR2干擾后的細胞遷移實驗和侵襲實驗結果均表明，siHOTAIR2組的穿膜細胞數均低于NC組和BC組（P < 0.05），但NC組和BC組比較差異均無統計學意義（P > 0.05），見圖 7～9。
3 討論
腫瘤干細胞理論[11]認為，腫瘤干細胞是腫瘤組織中的一群具有自我更新和多向分化能力的干細胞亞群。腫瘤干細胞對腫瘤的存活、增殖、轉移、復發及化療耐藥均有著重要的影響。目前對腫瘤干細胞的研究主要涉及細胞表面標志物，如CD133、CD44、Musashi-1（RNA結合蛋白）等[2-3, 12]。CD133作為一種重要的腫瘤干細胞表面標志物，在多種實體瘤組織中表達[13-14]，且有研究[15-16]表明，CD133與肝癌、膠質瘤等多種腫瘤的化療耐藥有關。有研究[4]表明，在胃癌組織中，CD133的表達與化療耐藥和胃癌的早期復發均密切相關。本課題組前期的研究[10]表明，在胃癌KATO-Ⅲ細胞中，經免疫磁珠分選技術分選出的CD133陽性細胞中CD133陽性亞群細胞的比例高達85%以上，明顯高于CD133陰性細胞，且CD133陽性細胞的增殖及耐藥能力均高于CD133陰性細胞。因此本實驗采用免疫磁珠分選技術分選CD133陽性細胞。此外，本實驗RT-PCR結果也表明，CD133陽性細胞中CD133 mRNA的表達水平高于CD133陰性細胞。
EMT即上皮細胞通過特定的程序轉化為間質細胞的過程。在腫瘤細胞發生EMT期間，上皮細胞表面標志物E-cadherin的表達下調，而間質細胞標志物N-cadherin的表達上調，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接，表達的細胞黏附分子減少，細胞的遷移和侵襲能力增強，從而導致惡性腫瘤發生復發和轉移。已有實驗[17-18]表明，在腎癌、非小細胞肺癌等組織中，EMT可促進腫瘤轉移及化療耐藥。本課題組前期實驗研究[5]結果表明，胃癌CD133陽性細胞的遷移及侵襲能力均高于CD133陰性細胞，且與腫瘤細胞發生EMT密切相關。
LncRNA是近年來醫學研究的熱點領域，越來越多的研究[19-21]顯示，LncRNA，如HOTAIR、H19、人母系表達基因3（MEG3）等與胃癌的發生、發展、轉移等關系密切。最新研究[7-9]發現，HOTAIR在乳腺癌、結腸癌、胰腺癌等腫瘤組織中的表達明顯上調，并與腫瘤侵襲、轉移及患者的預后均呈正相關。另有研究[22-23]表明，HOTAIR的表達與EMT、乳腺癌干細胞及結腸癌干細胞特性的維持相關。既然HOTAIR與腫瘤干細胞、EMT、腫瘤侵襲及腫瘤轉移相關，為了研究HOTAIR在胃癌干細胞中的作用，本實驗采用免疫磁珠分選技術分選出了CD133陽性細胞，干擾其HOTAIR的表達，并采用RT-PCR法檢測其對CD133 mRNA、E-cadherin mRNA及N-cadherin mRNA表達的影響。結果發現，與NC組和BC組比較，siHOTAIR2干擾后HOTAIR mRNA的表達水平明顯降低，同時CD133 mRNA的表達水平也明顯降低；EMT相關因子中，E-cadherin mRNA的表達水平明顯升高，而N-cadherin mRNA的表達水平明顯降低。上述實驗結果提示，HOTAIR可促進胃癌細胞中CD133 mRNA的表達，促進細胞發生EMT。為了進一步研究干擾HOTAIR是否影響到胃癌干細胞的遷移及侵襲能力，筆者開展了Transwell實驗，結果發現，干擾HOTAIR后穿膜細胞數明顯減少，表明細胞的遷移及侵襲能力明顯降低。本實驗結果提示，HOTAIR與胃癌干細胞的EMT、侵襲及遷移均密切相關。
綜上所述，HOTAIR可調節CD133陽性胃癌細胞中CD133 mRNA的表達，還可通過EMT調節細胞的遷移及侵襲。本實驗進一步在基因水平上闡明了CD133陽性胃癌細胞侵襲及遷移的機理，或可為臨床在基因水平診斷和治療胃癌提供一定的理論依據。然而，HOTAIR調節CD133 mRNA表達的機理需進一步探索。此外，已有實驗[24-25]表明，LncRNA可通過信號轉導通路增強腫瘤對放化療的敏感性，但HOTAIR在胃癌干細胞放化療耐藥中的作用及其機理需進一步研究。
胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，在癌癥相關死亡中位列第三[1]。胃癌的發病率高、進展快，手術治療后易復發和轉移。胃癌干細胞是胃癌發生轉移、復發以及化療耐藥的重要原因。研究胃癌干細胞時主要以CD133、CD44等作為其細胞表面標志物[2-3]。在胃癌中，CD133的表達與化療耐藥和胃癌復發均密切相關[4]。本課題組前期研究[5]表明，胃癌CD133陽性細胞的遷移及侵襲能力均高于CD133陰性細胞，且其遷移與侵襲與胃癌細胞發生上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切相關。長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）是一類長度大于200 nt的不編碼任何蛋白的核糖核酸分子。雖然LncRNA不編碼任何蛋白，但其通過染色質修飾、轉錄激活與干擾等參與細胞內多種調控過程[6]。同源基因轉錄反義基因間RNA（HOTAIR）為LncRNA的一種類型，近年來成為研究的熱點。最新研究[7-9]表明，HOTAIR在乳腺癌、結腸癌、胰腺癌等腫瘤組織中的表達明顯上調，并與腫瘤侵襲、轉移及預后均呈正相關。然而，目前HOTAIR在胃癌干細胞中的作用尚不清楚。因此，本實驗進一步研究了HOTAIR在胃癌干細胞中的表達及其作用。
1 材料和方法
1.1 主要材料、試劑及設備
人胃癌KATO-Ⅲ細胞株購自美國ATCC公司，脂質體2000購自美國Invitrogen公司，Trizol試劑、PCR試劑盒、DNA loading buffer及DNA分子標準均購自日本Takara公司，CD133分選試劑盒購自德國Miltenyi公司，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶及0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）均購自美國Gibco公司，焦磷酸二乙酯（DEPC）水和結晶紫染液均購自中國江蘇碧云天生物公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇、電泳液及瓊脂糖粉均購自北京鼎國生物公司，DuGreen染液購自中國北京泛博生物化學有限公司。目的基因CD133、HOTAIR、E-鈣黏素（E-cadherin）、N-鈣黏素（N-cadherin）以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物序列均由中國上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成；小干擾RNA（siRNA）干擾序列由中國上海吉瑪生物制藥有限公司設計合成。細胞培養皿、基質膠和Transwell小室均購自美國Corning公司。設備：電熱恒溫培養箱和-80℃超低溫冰箱均購自美國Revco公司，生物安全柜購自美國Thermal公司，高壓消毒鍋、水浴鍋及超純水儀均購自日本Hirayama公司，紫外分光光度計、PCR擴增儀、凝膠掃描儀及凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad公司，電子天平購自德國Sartorius公司，倒置相差顯微鏡和數碼照相機均購自日本Olympus公司，高壓電泳儀購自中國上海天馬生物公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養及免疫磁珠分選
人胃癌KATO-Ⅲ細胞培養及免疫磁珠分選參照本課題組前期實驗[10]的步驟進行。分選后的細胞用含20μg/L上皮生長因子（EGF）及10μg/L堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的無血清伊思考夫改良杜爾貝可培養基（IMDM培養基）重懸培養，以供后續實驗使用。同時檢測CD133陽性組、CD133陰性組及未分選組細胞中CD133 mRNA和HOTAIR mRNA的表達水平。
1.2.2 半定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測相關mRNA的表達
以Trizol法提取總RNA。取500 ng總RNA逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增（操作按試劑盒說明書進行）。CD133基因的上游引物：5′-TTA-CGGCACTCTTCACCT-3′，下游引物：5′-TATTCCA-CAAGCAGCAAA-3′，產物長度為172 bp，退火溫度為55℃；HOTAIR基因的上游引物：5′-TTAGGAGGC-CCAAACAGAGT-3′，下游引物：5′-GGCTAGGGCT-GGTTTCACTT-3′，產物長度為320 bp，退火溫度為55℃；E-cadherin基因的上游引物：5′-TGCCCAGA-AAATGAAAAAGG-3′，下游引物：5′-GTGTATGTG-GCAATGCGTTC-3′，產物長度為200 bp，退火溫度為50℃；N-cadherin基因的上游引物：5′-ACAGTGGC-CACCTACAAAGG-3′，下游引物：5′-CCGAGATGG-GGTTGATAATG-3′，產物長度為201 bp，退火溫度為54℃；GAPDH為內參，其基因的上游引物：5′-ACG-GATTTGGTCGTATTGGGCG-3′，下游引物：5′-CTC-CTGGAAGATGGTGATGG-3′，產物長度為197 bp，退火溫度為55℃。分別取2μL GAPDH的PCR產物、5μL以上各待測樣品的PCR產物，在含2%瓊脂糖凝膠的電泳槽中進行電泳，采用凝膠成像系統保存電泳條帶的圖像，并以凝膠圖像分析軟件分析電泳產物的灰度值，以目的基因和GAPDH灰度值的比值表示目的基因的相對表達水平。每組重復實驗3次。
1.2.3 siRNA的合成及轉染
根據HOTAIR的基因序列，設計并合成3段HOTAIR干擾序列（siHOTAIR）及陰性干擾序列（表 1）。轉染所用細胞為分選后的CD133陽性細胞。將CD133陽性細胞分為5組：空白對照組（BC組）、陰性對照組（NC組）和3個干擾組（siHOTAIR1組、siHOTAIR2組及siHOTAIR3組），接種于含IMDM完全培養基（含10%胎牛血清）的6孔板內，細胞密度為（2～5）×105個/孔。每組設3個復孔。培養24 h、待融合度達到70%～90%時進行轉染（轉染操作按試劑盒說明書進行）。轉染后進行細胞培養，培養48 h后收集細胞，用RT-PCR法檢測HOTAIR mRNA的表達水平，選擇沉默效果最好的干擾基因進行后續實驗。確定干擾序列為siHOTAIR2后，將CD133陽性細胞分為3組：空白對照組（BC組）、陰性對照組（NC組）和siHOTAIR2組。分別進行轉染，步驟同前。轉染后進行細胞培養，培養48 h后收集細胞，再采用RT-PCR法檢測3組細胞中CD133 mRNA、E-cadherin mRNA及N-cadherin mRNA的表達水平，并開展Transwell實驗。
表1
4種siRNA序列
1.2.4 Transwell實驗檢測人胃癌KATO-Ⅲ細胞的侵襲（遷移）能力
收集上述3組細胞以進行Transwell實驗。將基質膠以1∶1的比例用無血清IMDM培養液稀釋混勻后，取50μL鋪于Transwell上室中，置于37℃、5% CO2培養箱中，待上室的基質膠凝結（細胞遷移實驗則無需鋪基質膠）。收集對數生長期的人胃癌KATO-Ⅲ細胞，用無血清IMDM培養基重懸成單個細胞〔密度為（1～2）×106個/mL）〕。取100μL細胞懸液加入Transwell上室中，調整每孔細胞濃度為（1～5）×105個；Transwell下室中加入含有20%胎牛血清的IMDM完全培養基。將上述處理后的細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去上室中的基質膠及細胞（細胞遷移實驗只需拭去上室細胞），行4%多聚甲醛固定、0.1%結晶紫染色，在高倍鏡下（100倍）平移非重疊觀察9個視野，計數其中同時穿過基質膠及Transwell膜的穿膜細胞數（細胞遷移實驗則計數穿過Transwell膜的穿膜細胞數），并計算平均數。每組重復實驗3次。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 CD133陽性組、CD133陰性組及未分選組細胞中CD133 mRNA及HOTAIR mRNA的表達結果
RT-PCR檢測結果表明，CD133陽性組細胞中CD133 mRNA和HOTAIR mRNA的表達水平均高于CD133陰性組和未分選組（P < 0.05），而CD133陰性組和未分選組細胞中CD133 mRNA和HOTAIR mRNA表達水平的差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 1和圖 2。
圖1
示3組細胞中CD133 mRNA及HOTAIR mRNA的瓊脂糖凝膠電泳結果。1A：CD133 mRNA；1B：HOTAIR mRNA。1：CD133陽性組；2：CD133陰性組；3：未分選組??圖 2??示CD133陽性組、CD133陰性組及未分選組細胞中CD133 mRNA及HOTAIR mRNA的表達水平結果。與CD133陽性組相應指標比較，* P < 0.05??圖 3??示5組細胞中HOTAIR mRNA的瓊脂糖凝膠電泳結果。1：siHOTAIR1組；2：siHOTAIR2組；3：siHOTAIR3組；4：NC組；5：BC組??圖 4??示5組細胞中HOTAIR mRNA的表達水平結果。與NC組和BC組比較，* P < 0.05；與siHOTAIR1組比較，# P < 0.05；與siHOTAIR2組比較，△P < 0.05??圖 5??示3組細胞中CD133 mRNA、E-cadherin mRNA及N-cadherin mRNA的瓊脂糖凝膠電泳結果。5A：CD133 mRNA；5B：E-cadherin mRNA；5C：N-cadherin mRNA。1：siHOTAIR2組；2：NC組；3：BC組??圖 6??示3組細胞中CD133 mRNA、E-cadherin mRNA及N-cadherin mRNA的表達水平結果。與siHOTAIR2組相應指標比較，* P < 0.05??圖 7??示3組Transwell實驗的穿膜細胞數。與siHOTAIR2組相應指標比較，* P < 0.05??圖 8??示3組細胞的遷移實驗結果（結晶紫染色×100）。8A：siHOTAIR2組；8B：NC組；8C：BC組??圖 9??示3組
2.2 siHOTAIR干擾后細胞中HOTAIR mRNA的表達結果
RT-PCR檢測結果表明，BC組和NC組細胞中HOTAIR mRNA表達水平的差異無統計學意義（P > 0.05）；與BC組和NC組比較，siHOTAIR1組、siHOTAIR2組及siHOTAIR3組細胞中HOTAIR mRNA的表達水平均較低（P < 0.05）；siHOTAIR1組、siHOTAIR2組及siHOTAIR3組細胞中HOTAIR mRNA的表達水平以siHOTAIR2組最低，siHOTAIR1組最高，3組間兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 3和圖 4。該結果表明，siHOAIR2的沉默效果最好，故選擇siHOAIR2序列用于后續實驗。
2.3 siHOTAIR2干擾后細胞中CD133 mRNA、N-cadherin mRNA及E-cadherin mRNA的表達結果
RT-PCR檢測結果表明，siHOTAIR2組細胞中CD133 mRNA和N-cadherin mRNA的表達水平均低于NC組和BC組（P < 0.05），但E-cadherin mRNA的表達水平卻高于NC組和BC組（P < 0.05）；NC組和BC組細胞中CD133 mRNA、N-cadherin mRNA及E-cadherin mRNA的表達水平比較差異均無統計學意義（P > 0.05），見圖 5和圖 6。
2.4 siHOTAIR2干擾后細胞的遷移及侵襲能力
siHOTAIR2干擾后的細胞遷移實驗和侵襲實驗結果均表明，siHOTAIR2組的穿膜細胞數均低于NC組和BC組（P < 0.05），但NC組和BC組比較差異均無統計學意義（P > 0.05），見圖 7～9。
3 討論
腫瘤干細胞理論[11]認為，腫瘤干細胞是腫瘤組織中的一群具有自我更新和多向分化能力的干細胞亞群。腫瘤干細胞對腫瘤的存活、增殖、轉移、復發及化療耐藥均有著重要的影響。目前對腫瘤干細胞的研究主要涉及細胞表面標志物，如CD133、CD44、Musashi-1（RNA結合蛋白）等[2-3, 12]。CD133作為一種重要的腫瘤干細胞表面標志物，在多種實體瘤組織中表達[13-14]，且有研究[15-16]表明，CD133與肝癌、膠質瘤等多種腫瘤的化療耐藥有關。有研究[4]表明，在胃癌組織中，CD133的表達與化療耐藥和胃癌的早期復發均密切相關。本課題組前期的研究[10]表明，在胃癌KATO-Ⅲ細胞中，經免疫磁珠分選技術分選出的CD133陽性細胞中CD133陽性亞群細胞的比例高達85%以上，明顯高于CD133陰性細胞，且CD133陽性細胞的增殖及耐藥能力均高于CD133陰性細胞。因此本實驗采用免疫磁珠分選技術分選CD133陽性細胞。此外，本實驗RT-PCR結果也表明，CD133陽性細胞中CD133 mRNA的表達水平高于CD133陰性細胞。
EMT即上皮細胞通過特定的程序轉化為間質細胞的過程。在腫瘤細胞發生EMT期間，上皮細胞表面標志物E-cadherin的表達下調，而間質細胞標志物N-cadherin的表達上調，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接，表達的細胞黏附分子減少，細胞的遷移和侵襲能力增強，從而導致惡性腫瘤發生復發和轉移。已有實驗[17-18]表明，在腎癌、非小細胞肺癌等組織中，EMT可促進腫瘤轉移及化療耐藥。本課題組前期實驗研究[5]結果表明，胃癌CD133陽性細胞的遷移及侵襲能力均高于CD133陰性細胞，且與腫瘤細胞發生EMT密切相關。
LncRNA是近年來醫學研究的熱點領域，越來越多的研究[19-21]顯示，LncRNA，如HOTAIR、H19、人母系表達基因3（MEG3）等與胃癌的發生、發展、轉移等關系密切。最新研究[7-9]發現，HOTAIR在乳腺癌、結腸癌、胰腺癌等腫瘤組織中的表達明顯上調，并與腫瘤侵襲、轉移及患者的預后均呈正相關。另有研究[22-23]表明，HOTAIR的表達與EMT、乳腺癌干細胞及結腸癌干細胞特性的維持相關。既然HOTAIR與腫瘤干細胞、EMT、腫瘤侵襲及腫瘤轉移相關，為了研究HOTAIR在胃癌干細胞中的作用，本實驗采用免疫磁珠分選技術分選出了CD133陽性細胞，干擾其HOTAIR的表達，并采用RT-PCR法檢測其對CD133 mRNA、E-cadherin mRNA及N-cadherin mRNA表達的影響。結果發現，與NC組和BC組比較，siHOTAIR2干擾后HOTAIR mRNA的表達水平明顯降低，同時CD133 mRNA的表達水平也明顯降低；EMT相關因子中，E-cadherin mRNA的表達水平明顯升高，而N-cadherin mRNA的表達水平明顯降低。上述實驗結果提示，HOTAIR可促進胃癌細胞中CD133 mRNA的表達，促進細胞發生EMT。為了進一步研究干擾HOTAIR是否影響到胃癌干細胞的遷移及侵襲能力，筆者開展了Transwell實驗，結果發現，干擾HOTAIR后穿膜細胞數明顯減少，表明細胞的遷移及侵襲能力明顯降低。本實驗結果提示，HOTAIR與胃癌干細胞的EMT、侵襲及遷移均密切相關。
綜上所述，HOTAIR可調節CD133陽性胃癌細胞中CD133 mRNA的表達，還可通過EMT調節細胞的遷移及侵襲。本實驗進一步在基因水平上闡明了CD133陽性胃癌細胞侵襲及遷移的機理，或可為臨床在基因水平診斷和治療胃癌提供一定的理論依據。然而，HOTAIR調節CD133 mRNA表達的機理需進一步探索。此外，已有實驗[24-25]表明，LncRNA可通過信號轉導通路增強腫瘤對放化療的敏感性，但HOTAIR在胃癌干細胞放化療耐藥中的作用及其機理需進一步研究。
