引用本文： 張蓬波, 丁偉超, 張秀忠, 張沖, 任澤強. 泛素特異性蛋白酶9X在胰腺癌組織中的表達分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(5): 601-604. doi: 10.7507/1007-9424.20150157 復制
近年來，胰腺癌的發病率逐年上升，因其早期診斷困難且預后差，已成為威脅人類健康的重要疾病之一[1-2]。作為去泛素化酶家族的亞家族泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases，USPs）的成員之一USP9X，其與一些腫瘤的生物學行為密切相關[3]。本研究應用免疫組織化學鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法檢測胰腺癌組織中USP9X的表達，旨在探討胰腺癌組織中USP9X的表達與胰腺癌的發生、發展及預后的關系。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集徐州醫學院附屬醫院2006年9月至2010年12月期間行根治性手術切除的胰腺導管腺癌患者55例，所有患者均獲隨訪，隨訪日期截止至2013年12月，隨訪方式為電話、書信隨訪或（和）門診復查。55例患者中男32例，女23例；年齡（61.76±9.97）歲（43～85歲）。所有患者均經病理診斷為原發性胰腺導管腺癌，且術前均未行放療、化療、免疫治療等。分化程度：高、中、低分化腺癌分別為7例、34例及14例；TNM分期[4]：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅳ期分別為25例、28例及2例。選取距離腫瘤邊緣2 cm以上的組織作為癌旁非腫瘤組織標本。
1.2 免疫組織化學檢測
采用SP法，具體步驟按照說明書進行操作。USP9X抗體工作濃度為1∶100，4℃過夜。兔抗人USP9X單克隆抗體、SP試劑盒、濃縮型3, 3-二氨基聯苯胺（3, 3′-diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。細胞質和（或）細胞膜染成黃色或棕褐色為陽性。每張切片任選5個400倍光鏡視野觀察。免疫組織化學檢測結果評分[5]：染色程度評分：不著色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；染色陽性細胞百分率評分：染色陽性細胞占計數細胞的百分率為0記0分，≤10%記1分，10%～50%記2分，51%～80%記3分，≥80%記4分。染色程度評分與染色陽性細胞百分率評分的乘積為最后得分，≤4分為低表達，> 4分為高表達。
1.3 統計學方法
應用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析。定性資料采用χ2檢驗，定量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 USP9X蛋白在胰腺癌組織及其癌旁非腫瘤組織中的表達情況
55例胰腺癌組織中有32例USP9X高表達（圖 1），高表達率為58.2%。癌旁非腫瘤組織中USP9X均為低表達（圖 2）。
圖1
USP9X蛋白在胰腺癌組織中的表達（SP??×400）。1A：高表達；1B：低表達????圖 2??USP9X在癌旁非腫瘤組織中低表達（SP??×400）
2.2 USP9X蛋白在胰腺癌組織中的表達與患者臨床病理特征的關系
結果見表 1。從表 1可見，USP9X蛋白在原發性胰腺導管腺癌組織中的表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位及腫瘤大小無關（P > 0.05），與腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移及TNM分期有關（P < 0.05）。
表1
USP9X蛋白在胰腺癌組織中的表達與患者臨床病理特征的關系（例）
2.3 影響預后的因素分析結果
單因素分析結果顯示，腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移及USP9X表達與胰腺癌患者臨床預后有關（P < 0.05），見表 2。進一步多因素Cox比例風險分析結果顯示，腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移及USP9X表達是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素（P < 0.05），見表 3。
表2
影響預后的單因素分析結果
表3
影響預后的多因素分析結果
2.4 USP9X表達與累積生存率的關系
Kaplan-Meier法生存分析顯示，USP9X高表達組患者預后明顯差于低表達組（P=0.002），在TNM分期Ⅱ期、淋巴結陰性及腫瘤分化程度中分化患者中，USP9X高表達患者預后也明顯差于低表達者（P < 0.05），見圖 3～5。
圖3
所有胰腺癌組織中USP9X表達的生存曲線??圖 4??TNM分期Ⅱ期患者的胰腺癌組織中USP9X表達的生存曲線??圖 5??淋巴結陰性患者的胰腺癌組織中USP9X表達的生存曲線??圖 6??腫瘤分化程度中分化患者的胰腺癌組織中USP9X表達的生存曲線
3 討論
隨著泛素化與腫瘤之間的關系越來越明朗化，其反向調控過程去泛素化最近也備受關注。目前認為，去泛素化酶在調控與腫瘤相關的許多途徑當中有重要作用[6-8]。而作為去泛素化酶家族中的一個亞家族成員，USP與腫瘤發生有著不可替代的聯系[9-11]。研究[12-13]發現，USP通過各種途徑影響腫瘤的發生、發展，如DNA損傷修復、細胞周期調控、信號通路調控等。USP家族是去泛素化酶家族中種類最多、結構最具多樣化的一個亞家族，成員共50多個[14]，可分為USP1、USP2、USP3……USP54、CYLD等。
Agrawal等[15]研究發現，USP9X能夠抑制mTOR信號通路激活，而mTOR的激活和人類腫瘤密切相關[16]。Schwickart等[17]研究證實，USP9X通過穩定抗凋亡蛋白MCL-1，從而促進腫瘤細胞的生長，但同時也可以通過穩定凋亡信號調控激酶，促進凋亡[18-19]。Trivigno等[20]則證明，USP9X穩定MCL-1，可能與腫瘤的放療耐受機制有關。而Harris等[21]研究發現，通過降低USP9X表達，可以激活結腸癌細胞的凋亡信號通路，并增強5-氟尿嘧啶（5-FU）的化療作用。另有文獻[22]報道，USP9X與膠質瘤細胞的放射后凋亡水平相關。
胰腺癌的發生、發展是一個多階段的復雜過程，因其早期診斷困難且預后差，已成為威脅人類健康的重要疾病之一[23-25]。關于USP9X與胰腺癌的關系既往報道罕見。本研究應用免疫組織化學SP法檢測胰腺癌組織中USP9X表達，結果顯示，胰腺癌組織中USP9X高表達率為58.2%，而癌旁非腫瘤組織中均為低表達，差異有統計學意義。USP9X表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小等無關，而與腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移、TNM分期等顯著相關。胰腺癌組織中USP9X高表達，癌旁非腫瘤組織中低表達，提示USP9X在胰腺癌的發生中發揮了重要作用。胰腺癌組織中USP9X表達與腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移、TNM分期等顯著相關，提示USP9X在胰腺癌的發展過程中也發揮重要作用，USP9X高表達的胰腺癌組織可能具有更強的侵襲性。
另外，本研究不僅通過生存分析顯示USP9X高表達組患者預后明顯差于低表達組（P < 0.05），亦通過Cox比例風險分析顯示USP9X高表達是影響預后的獨立危險因素（P < 0.05）；而且，在同種TNM分期（Ⅱ期組）、淋巴結轉移（陰性組）及腫瘤分化程度（中分化組）條件下，分別進行了生存分析，均顯示USP9X高表達組的生存期明顯低于低表達組，進一步說明了癌組織中USP9X的表達與胰腺癌預后存在獨立、密切的聯系。
綜上所述，USP9X與胰腺癌的發生、發展及預后密切相關，可作為判斷胰腺癌及其預后的指標之一，有助于指導胰腺癌術后患者的綜合治療及隨訪，延長患者生存期。
近年來，胰腺癌的發病率逐年上升，因其早期診斷困難且預后差，已成為威脅人類健康的重要疾病之一[1-2]。作為去泛素化酶家族的亞家族泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases，USPs）的成員之一USP9X，其與一些腫瘤的生物學行為密切相關[3]。本研究應用免疫組織化學鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法檢測胰腺癌組織中USP9X的表達，旨在探討胰腺癌組織中USP9X的表達與胰腺癌的發生、發展及預后的關系。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集徐州醫學院附屬醫院2006年9月至2010年12月期間行根治性手術切除的胰腺導管腺癌患者55例，所有患者均獲隨訪，隨訪日期截止至2013年12月，隨訪方式為電話、書信隨訪或（和）門診復查。55例患者中男32例，女23例；年齡（61.76±9.97）歲（43～85歲）。所有患者均經病理診斷為原發性胰腺導管腺癌，且術前均未行放療、化療、免疫治療等。分化程度：高、中、低分化腺癌分別為7例、34例及14例；TNM分期[4]：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅳ期分別為25例、28例及2例。選取距離腫瘤邊緣2 cm以上的組織作為癌旁非腫瘤組織標本。
1.2 免疫組織化學檢測
采用SP法，具體步驟按照說明書進行操作。USP9X抗體工作濃度為1∶100，4℃過夜。兔抗人USP9X單克隆抗體、SP試劑盒、濃縮型3, 3-二氨基聯苯胺（3, 3′-diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。細胞質和（或）細胞膜染成黃色或棕褐色為陽性。每張切片任選5個400倍光鏡視野觀察。免疫組織化學檢測結果評分[5]：染色程度評分：不著色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；染色陽性細胞百分率評分：染色陽性細胞占計數細胞的百分率為0記0分，≤10%記1分，10%～50%記2分，51%～80%記3分，≥80%記4分。染色程度評分與染色陽性細胞百分率評分的乘積為最后得分，≤4分為低表達，> 4分為高表達。
1.3 統計學方法
應用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析。定性資料采用χ2檢驗，定量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 USP9X蛋白在胰腺癌組織及其癌旁非腫瘤組織中的表達情況
55例胰腺癌組織中有32例USP9X高表達（圖 1），高表達率為58.2%。癌旁非腫瘤組織中USP9X均為低表達（圖 2）。
圖1
USP9X蛋白在胰腺癌組織中的表達（SP??×400）。1A：高表達；1B：低表達????圖 2??USP9X在癌旁非腫瘤組織中低表達（SP??×400）
2.2 USP9X蛋白在胰腺癌組織中的表達與患者臨床病理特征的關系
結果見表 1。從表 1可見，USP9X蛋白在原發性胰腺導管腺癌組織中的表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位及腫瘤大小無關（P > 0.05），與腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移及TNM分期有關（P < 0.05）。
表1
USP9X蛋白在胰腺癌組織中的表達與患者臨床病理特征的關系（例）
2.3 影響預后的因素分析結果
單因素分析結果顯示，腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移及USP9X表達與胰腺癌患者臨床預后有關（P < 0.05），見表 2。進一步多因素Cox比例風險分析結果顯示，腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移及USP9X表達是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素（P < 0.05），見表 3。
表2
影響預后的單因素分析結果
表3
影響預后的多因素分析結果
2.4 USP9X表達與累積生存率的關系
Kaplan-Meier法生存分析顯示，USP9X高表達組患者預后明顯差于低表達組（P=0.002），在TNM分期Ⅱ期、淋巴結陰性及腫瘤分化程度中分化患者中，USP9X高表達患者預后也明顯差于低表達者（P < 0.05），見圖 3～5。
圖3
所有胰腺癌組織中USP9X表達的生存曲線??圖 4??TNM分期Ⅱ期患者的胰腺癌組織中USP9X表達的生存曲線??圖 5??淋巴結陰性患者的胰腺癌組織中USP9X表達的生存曲線??圖 6??腫瘤分化程度中分化患者的胰腺癌組織中USP9X表達的生存曲線
3 討論
隨著泛素化與腫瘤之間的關系越來越明朗化，其反向調控過程去泛素化最近也備受關注。目前認為，去泛素化酶在調控與腫瘤相關的許多途徑當中有重要作用[6-8]。而作為去泛素化酶家族中的一個亞家族成員，USP與腫瘤發生有著不可替代的聯系[9-11]。研究[12-13]發現，USP通過各種途徑影響腫瘤的發生、發展，如DNA損傷修復、細胞周期調控、信號通路調控等。USP家族是去泛素化酶家族中種類最多、結構最具多樣化的一個亞家族，成員共50多個[14]，可分為USP1、USP2、USP3……USP54、CYLD等。
Agrawal等[15]研究發現，USP9X能夠抑制mTOR信號通路激活，而mTOR的激活和人類腫瘤密切相關[16]。Schwickart等[17]研究證實，USP9X通過穩定抗凋亡蛋白MCL-1，從而促進腫瘤細胞的生長，但同時也可以通過穩定凋亡信號調控激酶，促進凋亡[18-19]。Trivigno等[20]則證明，USP9X穩定MCL-1，可能與腫瘤的放療耐受機制有關。而Harris等[21]研究發現，通過降低USP9X表達，可以激活結腸癌細胞的凋亡信號通路，并增強5-氟尿嘧啶（5-FU）的化療作用。另有文獻[22]報道，USP9X與膠質瘤細胞的放射后凋亡水平相關。
胰腺癌的發生、發展是一個多階段的復雜過程，因其早期診斷困難且預后差，已成為威脅人類健康的重要疾病之一[23-25]。關于USP9X與胰腺癌的關系既往報道罕見。本研究應用免疫組織化學SP法檢測胰腺癌組織中USP9X表達，結果顯示，胰腺癌組織中USP9X高表達率為58.2%，而癌旁非腫瘤組織中均為低表達，差異有統計學意義。USP9X表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小等無關，而與腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移、TNM分期等顯著相關。胰腺癌組織中USP9X高表達，癌旁非腫瘤組織中低表達，提示USP9X在胰腺癌的發生中發揮了重要作用。胰腺癌組織中USP9X表達與腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移、TNM分期等顯著相關，提示USP9X在胰腺癌的發展過程中也發揮重要作用，USP9X高表達的胰腺癌組織可能具有更強的侵襲性。
另外，本研究不僅通過生存分析顯示USP9X高表達組患者預后明顯差于低表達組（P < 0.05），亦通過Cox比例風險分析顯示USP9X高表達是影響預后的獨立危險因素（P < 0.05）；而且，在同種TNM分期（Ⅱ期組）、淋巴結轉移（陰性組）及腫瘤分化程度（中分化組）條件下，分別進行了生存分析，均顯示USP9X高表達組的生存期明顯低于低表達組，進一步說明了癌組織中USP9X的表達與胰腺癌預后存在獨立、密切的聯系。
綜上所述，USP9X與胰腺癌的發生、發展及預后密切相關，可作為判斷胰腺癌及其預后的指標之一，有助于指導胰腺癌術后患者的綜合治療及隨訪，延長患者生存期。
