引用本文： 李金淼, 黃智民, 周桂臺. Metadherin在甲胎蛋白陰性肝癌組織中的表達及臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(5): 597-600. doi: 10.7507/1007-9424.20150156 復制
肝癌惡性程度差，有效的治療方式包括根治性切除及肝移植，但術后5年生存率為30%～40%，嚴重危害患者的生命健康[1]。AFP在肝癌預后判斷中發揮著重要作用，高血清AFP與患者P53突變、腫瘤大小、血管浸潤、早期復發密切相關，而且具有較低的生存率[2]。但臨床上有30%～40%的肝癌患者AFP表達陰性，目前對這部分患者尋找有效的分子預測指標對指導肝癌臨床治療具有重要的意義[3]。metadherin（MTDH）在促進腫瘤細胞增殖、轉移、侵襲中發揮重要作用[4]。目前在眾多的惡性腫瘤中均報道MTDH表達增高，且高MTDH表達提示較差的預后[5]。肝癌組織中也存在MTDH高表達[6]，但MTDH在AFP陰性肝癌組織中表達情況及MTDH表達對AFP陰性肝癌是否具有一定的預后價值，目前未見相關報道。本研究通過免疫組織化學方法檢測152例AFP陰性肝癌患者根治術后的肝癌組織中MTDH蛋白表達情況，分析MTDH蛋白表達與AFP陰性肝癌患者根治術后生存的關系，探討MTDH在AFP陰性肝癌患者臨床治療中的價值。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集湖北省通城縣人民醫院2002～2010年期間152例肝癌根治術前血清AFP < 20μg/L患者石蠟組織切片，肝癌根治術判斷標準為：所有腫瘤完全切除，鏡下腫瘤邊緣無腫瘤細胞殘存；肝門靜脈及其分支無血栓殘留。根據第7版Edmondson-Steiner分級，并整理其臨床病理指標。
1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學染色
主要步驟為：取4μm厚石蠟切片在二甲苯脫蠟，然后梯度乙醇水化，0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液（pH值為6）95℃抗原修復15 min，加入1∶100兔抗人單克隆抗體4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min，然后加入二抗室溫作用30 min，DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對照采用已知MTDH陽性染色的乳腺癌組織標本，陰性對照采用去除一抗的PBS 4℃過夜。
1.2.2 結果判斷
參照文獻[7]中MTDH免疫組織化學染色判斷標準，其陽性染色呈黃色，主要定位于細胞膜和細胞漿，結合染色強度及染色陽性百分比評價。染色強度評分：陰性為0分，弱表達為1分，中等表達為2分，強表達為3分；染色陽性百分比定義：< 21%為0分，21%～40%為1分，41%～60%為2分，61%～80%為3分，81%～100%為4分。染色強度評分和染色陽性百分比評分相乘的結果為最終評分結果。根據最終染色評分，0～6分為MTDH低表達，7～12分為MTDH高表達。
1.3 統計學方法
本研究中用頻率描述所有分類變量，患者臨床病理特征與MTDH表達狀況分析采用χ2檢驗分析。總生存時間定義為診斷患者肝癌到患者死于肝癌的時間，隨訪仍存活時則為刪失。Kaplan-Meier法計算1年、2年、3年的生存率，采用log-rank法比較生存率差異，Cox比例風險模型分析患者臨床病理指標與預后的關系。所有數據均使用SPSS 13.0統計軟件處理，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MTDH在AFP陰性肝癌組織中的表達情況
MTDH表達主要位于細胞漿，呈片、塊狀，但在表達強度較高的AFP陰性肝癌組織中MTDH表達也可在細胞核，見圖 1。152例AFP陰性肝癌患者中MTDH蛋白高表達率為60.53%（92/152）。
圖1
MTDH蛋白在AFP陰性肝癌組織中的表達情況（免疫組織化學??×200）。1A：陰性表達；1B：陽性表達
2.2 MTDH表達與AFP陰性肝癌患者的臨床病理特征的關系
結果見表 1。從表 1可見，MTDH蛋白高表達與患者腫瘤直徑（P=0.029）、Edmondson分級（P=0.032）、微血管浸潤（P=0.024）及腫瘤復發（P=0.014）有關，但與患者性別（P=0.959）、年齡（P=0.209）、HBsAg狀態（P=0.443）、BCLC分期（P=0.323）、包膜是否完整（P=0.413）、腫瘤結節數目（P=0.775）及肝內淋巴結轉移（P=0.087）無關。
表1
AFP陰性肝癌組織中MTDH表達情況與患者臨床病理特征的關系
2.3 MTDH表達與生存預后的關系
92例MTDH高表達組1、3、5年生存率分別為76.1%、47.9%和24.3%，而60例MTDH低表達組分別為88.3%、74.7%和52.1%。log-rank生存分析結果提示兩者差異具有統計學意義(χ2=10.582，P=0.002)，見圖 2。單因素分析結果顯示，腫瘤直徑、MTDH高表達、淋巴結有轉移、BCLC分期、腫瘤復發及有微血管浸潤與AFP陰性肝癌患者總生存有關（P < 0.05），見表 2；多因素分析結果顯示，MTDH高表達及淋巴結有轉移是影響AFP陰性肝癌患者總生存時間的獨立預后因素（P < 0.05），見表 3。
圖2
在AFP陰性肝癌組織中MTDH高表達和低表達患者的生存曲線
表2
單因素分析影響AFP陰性肝癌患者總生存率的因素
表3
多因素分析AFP陰性肝癌患者總生存率的因素
3 討論
肝癌的發生是多因素相互作用的結果，病因復雜，發病機理也未完全弄清。針對肝癌預后分子標志物的選擇在肝癌鑒別診斷、預后判斷及治療中均具有重要的價值[8]。MTDH基因定位在8q22，最初在星形膠質瘤細胞獲得完整克隆，在人類免疫缺陷病毒感染后明顯升高，也被稱為膠質瘤升高基因１（astrocyte elevated gene 1，AEG-1）[5]。2004年Brown等[9]在小鼠模型中發現，MTDH參與介導乳腺癌向肺臟轉移，因而被稱作轉移黏附基因/蛋白。目前研究發現，MTDH與多種腫瘤轉移有關，MTDH高表達于胃癌[10]、非小細胞肺癌[11]、膀胱癌[12]等幾乎全身所有系統的惡性腫瘤中，MTDH表達與患者腫瘤轉移復發、預后生存等臨床病理特點密切相關。
MTDH在惡性腫瘤進展中可通過激活多種信號通路，包括Wnt/β-catenin、MAPK/ERK、PI3K/AKT和AP-1，具有明顯促進腫瘤細胞增殖、轉移及侵襲的作用。MTDH可促進腫瘤侵襲，通過激活AKT，促進上皮-間質轉換相關蛋白表達[13]。有報道miRNAs通過調控MTDH表達在腫瘤發生中發揮一定作用。在頭頸部癌中miRNA375可靶向調節MTDH表達[14]。文獻[15]報道，肝癌中MTDH表達陽性率為54.2%（175/323），其高表達與微血管浸潤、組織低分化及腫瘤分期密切相關，基因敲除MTDH可下調N-cadherin及snail表達，上調E-cadherin及β-catenin表達。而通過抑制MTDH結合化療在人肝癌組織裸鼠移植瘤中發揮了重要作用，通過抑制MTDH可望在終末期肝癌治療中取得較大進展[16]。本研究發現，MTDH在AFP陰性肝癌組織中高表達率為60.53%，MTDH高表達與患者腫瘤級別高、微血管浸潤及腫瘤復發相關，提示MTDH與AFP陰性肝癌發生有關。
AFP在臨床用于檢測肝癌具有相對便宜而且容易獲得的特征，在診斷肝癌中敏感性為47.7%～52%，特異性高達97.1%～100% [17-18]。也有報道AFP診斷肝癌的敏感性高達70.1% [19]。AFP陽性肝癌患者在臨床上估計為60%～80%，在肝癌診斷和預后中具有重要意義[18]。AFP也被用于肝癌移植患者的監測，高血清AFP（> 1 000μg/L）患者肝移植術后更易發生復發，是肝癌患者較短生存期的預測指標之一[20]。血清AFP可作為肝癌診斷輔助檢查方法，血清AFP值為10μg/L診斷肝癌靈敏性可達82.6%，而特異性可達70.4%，200μg/L血清AFP值診斷肝癌靈敏性可達47.7%，而特異性可達97.1%[18]。2005年版美國肝臟研究學會（American Association for the Study of Liver Disease，AASLD）在更新的補充建議[21]中認為，血清AFP值有較高假陽性率而建議不用AFP作為肝癌診斷指標。歐亞太指南（European and Asian Pacific guidelines）[22]中仍認為200μg/L血清AFP值可作為可信的肝癌診斷指標。
AFP在肝癌預后判斷中也具有一定意義，而最近發現，在AFP陽性患者選擇肝部分切除、肝葉切除或擴大切除較肝移植獲得更好的生存率（59%～75.3%）[23]。然而有文獻[24]報道，AFP缺乏有效的特異性和敏感性，而針對AFP陰性肝癌患者目前缺乏有效的臨床預后監測手段，尋找新的有效的分子治療靶點仍有一定的意義。本研究中，我們在AFP陰性肝癌患者中對MTDH表達情況進行預后生存分析，單因素分析顯示，MTDH高表達與患者較差的生存率相關，而Cox比例風險模型分析提示，MTDH高表達在AFP陰性肝癌生存預測中具有較差的預后。因此，我們認為，MTDH在AFP陰性肝癌預后判斷中可能具有一定的作用，在臨床AFP陰性肝癌患者預后判斷中可能有一定價值。
總之，本研究發現，MTDH在AFP陰性肝癌組織中高表達，MTDH高表達與患者腫瘤級別高、微血管浸潤及腫瘤復發相關；單因素分析顯示，MTDH高表達與患者較差的生存率相關；Cox比例風險模型分析提示，MTDH高表達在AFP陰性肝癌生存預測中具有較差的預后作用。提示MTDH在臨床AFP陰性肝癌患者預后判斷中可能是重要的預后判斷分子指標。
肝癌惡性程度差，有效的治療方式包括根治性切除及肝移植，但術后5年生存率為30%～40%，嚴重危害患者的生命健康[1]。AFP在肝癌預后判斷中發揮著重要作用，高血清AFP與患者P53突變、腫瘤大小、血管浸潤、早期復發密切相關，而且具有較低的生存率[2]。但臨床上有30%～40%的肝癌患者AFP表達陰性，目前對這部分患者尋找有效的分子預測指標對指導肝癌臨床治療具有重要的意義[3]。metadherin（MTDH）在促進腫瘤細胞增殖、轉移、侵襲中發揮重要作用[4]。目前在眾多的惡性腫瘤中均報道MTDH表達增高，且高MTDH表達提示較差的預后[5]。肝癌組織中也存在MTDH高表達[6]，但MTDH在AFP陰性肝癌組織中表達情況及MTDH表達對AFP陰性肝癌是否具有一定的預后價值，目前未見相關報道。本研究通過免疫組織化學方法檢測152例AFP陰性肝癌患者根治術后的肝癌組織中MTDH蛋白表達情況，分析MTDH蛋白表達與AFP陰性肝癌患者根治術后生存的關系，探討MTDH在AFP陰性肝癌患者臨床治療中的價值。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集湖北省通城縣人民醫院2002～2010年期間152例肝癌根治術前血清AFP < 20μg/L患者石蠟組織切片，肝癌根治術判斷標準為：所有腫瘤完全切除，鏡下腫瘤邊緣無腫瘤細胞殘存；肝門靜脈及其分支無血栓殘留。根據第7版Edmondson-Steiner分級，并整理其臨床病理指標。
1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學染色
主要步驟為：取4μm厚石蠟切片在二甲苯脫蠟，然后梯度乙醇水化，0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液（pH值為6）95℃抗原修復15 min，加入1∶100兔抗人單克隆抗體4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min，然后加入二抗室溫作用30 min，DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對照采用已知MTDH陽性染色的乳腺癌組織標本，陰性對照采用去除一抗的PBS 4℃過夜。
1.2.2 結果判斷
參照文獻[7]中MTDH免疫組織化學染色判斷標準，其陽性染色呈黃色，主要定位于細胞膜和細胞漿，結合染色強度及染色陽性百分比評價。染色強度評分：陰性為0分，弱表達為1分，中等表達為2分，強表達為3分；染色陽性百分比定義：< 21%為0分，21%～40%為1分，41%～60%為2分，61%～80%為3分，81%～100%為4分。染色強度評分和染色陽性百分比評分相乘的結果為最終評分結果。根據最終染色評分，0～6分為MTDH低表達，7～12分為MTDH高表達。
1.3 統計學方法
本研究中用頻率描述所有分類變量，患者臨床病理特征與MTDH表達狀況分析采用χ2檢驗分析。總生存時間定義為診斷患者肝癌到患者死于肝癌的時間，隨訪仍存活時則為刪失。Kaplan-Meier法計算1年、2年、3年的生存率，采用log-rank法比較生存率差異，Cox比例風險模型分析患者臨床病理指標與預后的關系。所有數據均使用SPSS 13.0統計軟件處理，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MTDH在AFP陰性肝癌組織中的表達情況
MTDH表達主要位于細胞漿，呈片、塊狀，但在表達強度較高的AFP陰性肝癌組織中MTDH表達也可在細胞核，見圖 1。152例AFP陰性肝癌患者中MTDH蛋白高表達率為60.53%（92/152）。
圖1
MTDH蛋白在AFP陰性肝癌組織中的表達情況（免疫組織化學??×200）。1A：陰性表達；1B：陽性表達
2.2 MTDH表達與AFP陰性肝癌患者的臨床病理特征的關系
結果見表 1。從表 1可見，MTDH蛋白高表達與患者腫瘤直徑（P=0.029）、Edmondson分級（P=0.032）、微血管浸潤（P=0.024）及腫瘤復發（P=0.014）有關，但與患者性別（P=0.959）、年齡（P=0.209）、HBsAg狀態（P=0.443）、BCLC分期（P=0.323）、包膜是否完整（P=0.413）、腫瘤結節數目（P=0.775）及肝內淋巴結轉移（P=0.087）無關。
表1
AFP陰性肝癌組織中MTDH表達情況與患者臨床病理特征的關系
2.3 MTDH表達與生存預后的關系
92例MTDH高表達組1、3、5年生存率分別為76.1%、47.9%和24.3%，而60例MTDH低表達組分別為88.3%、74.7%和52.1%。log-rank生存分析結果提示兩者差異具有統計學意義(χ2=10.582，P=0.002)，見圖 2。單因素分析結果顯示，腫瘤直徑、MTDH高表達、淋巴結有轉移、BCLC分期、腫瘤復發及有微血管浸潤與AFP陰性肝癌患者總生存有關（P < 0.05），見表 2；多因素分析結果顯示，MTDH高表達及淋巴結有轉移是影響AFP陰性肝癌患者總生存時間的獨立預后因素（P < 0.05），見表 3。
圖2
在AFP陰性肝癌組織中MTDH高表達和低表達患者的生存曲線
表2
單因素分析影響AFP陰性肝癌患者總生存率的因素
表3
多因素分析AFP陰性肝癌患者總生存率的因素
3 討論
肝癌的發生是多因素相互作用的結果，病因復雜，發病機理也未完全弄清。針對肝癌預后分子標志物的選擇在肝癌鑒別診斷、預后判斷及治療中均具有重要的價值[8]。MTDH基因定位在8q22，最初在星形膠質瘤細胞獲得完整克隆，在人類免疫缺陷病毒感染后明顯升高，也被稱為膠質瘤升高基因１（astrocyte elevated gene 1，AEG-1）[5]。2004年Brown等[9]在小鼠模型中發現，MTDH參與介導乳腺癌向肺臟轉移，因而被稱作轉移黏附基因/蛋白。目前研究發現，MTDH與多種腫瘤轉移有關，MTDH高表達于胃癌[10]、非小細胞肺癌[11]、膀胱癌[12]等幾乎全身所有系統的惡性腫瘤中，MTDH表達與患者腫瘤轉移復發、預后生存等臨床病理特點密切相關。
MTDH在惡性腫瘤進展中可通過激活多種信號通路，包括Wnt/β-catenin、MAPK/ERK、PI3K/AKT和AP-1，具有明顯促進腫瘤細胞增殖、轉移及侵襲的作用。MTDH可促進腫瘤侵襲，通過激活AKT，促進上皮-間質轉換相關蛋白表達[13]。有報道miRNAs通過調控MTDH表達在腫瘤發生中發揮一定作用。在頭頸部癌中miRNA375可靶向調節MTDH表達[14]。文獻[15]報道，肝癌中MTDH表達陽性率為54.2%（175/323），其高表達與微血管浸潤、組織低分化及腫瘤分期密切相關，基因敲除MTDH可下調N-cadherin及snail表達，上調E-cadherin及β-catenin表達。而通過抑制MTDH結合化療在人肝癌組織裸鼠移植瘤中發揮了重要作用，通過抑制MTDH可望在終末期肝癌治療中取得較大進展[16]。本研究發現，MTDH在AFP陰性肝癌組織中高表達率為60.53%，MTDH高表達與患者腫瘤級別高、微血管浸潤及腫瘤復發相關，提示MTDH與AFP陰性肝癌發生有關。
AFP在臨床用于檢測肝癌具有相對便宜而且容易獲得的特征，在診斷肝癌中敏感性為47.7%～52%，特異性高達97.1%～100% [17-18]。也有報道AFP診斷肝癌的敏感性高達70.1% [19]。AFP陽性肝癌患者在臨床上估計為60%～80%，在肝癌診斷和預后中具有重要意義[18]。AFP也被用于肝癌移植患者的監測，高血清AFP（> 1 000μg/L）患者肝移植術后更易發生復發，是肝癌患者較短生存期的預測指標之一[20]。血清AFP可作為肝癌診斷輔助檢查方法，血清AFP值為10μg/L診斷肝癌靈敏性可達82.6%，而特異性可達70.4%，200μg/L血清AFP值診斷肝癌靈敏性可達47.7%，而特異性可達97.1%[18]。2005年版美國肝臟研究學會（American Association for the Study of Liver Disease，AASLD）在更新的補充建議[21]中認為，血清AFP值有較高假陽性率而建議不用AFP作為肝癌診斷指標。歐亞太指南（European and Asian Pacific guidelines）[22]中仍認為200μg/L血清AFP值可作為可信的肝癌診斷指標。
AFP在肝癌預后判斷中也具有一定意義，而最近發現，在AFP陽性患者選擇肝部分切除、肝葉切除或擴大切除較肝移植獲得更好的生存率（59%～75.3%）[23]。然而有文獻[24]報道，AFP缺乏有效的特異性和敏感性，而針對AFP陰性肝癌患者目前缺乏有效的臨床預后監測手段，尋找新的有效的分子治療靶點仍有一定的意義。本研究中，我們在AFP陰性肝癌患者中對MTDH表達情況進行預后生存分析，單因素分析顯示，MTDH高表達與患者較差的生存率相關，而Cox比例風險模型分析提示，MTDH高表達在AFP陰性肝癌生存預測中具有較差的預后。因此，我們認為，MTDH在AFP陰性肝癌預后判斷中可能具有一定的作用，在臨床AFP陰性肝癌患者預后判斷中可能有一定價值。
總之，本研究發現，MTDH在AFP陰性肝癌組織中高表達，MTDH高表達與患者腫瘤級別高、微血管浸潤及腫瘤復發相關；單因素分析顯示，MTDH高表達與患者較差的生存率相關；Cox比例風險模型分析提示，MTDH高表達在AFP陰性肝癌生存預測中具有較差的預后作用。提示MTDH在臨床AFP陰性肝癌患者預后判斷中可能是重要的預后判斷分子指標。
