引用本文： 于鵬飛, 顧國利, 魏學明, 李明, 顧晉. hMLH1、hMSH2、hMSH6在散發性結直腸癌中的表達狀態與其臨床病理特征的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(5): 581-585. doi: 10.7507/1007-9424.20150153 復制
錯配修復基因的種系突變及其所導致的微衛星不穩定在林奇綜合征發生中的作用已被人們所認知[1]。有研究[2]顯示，錯配修復基因的突變缺失也參與了散發性結直腸癌（sporadic colorectal carcinoma，SCRC）的發生、發展。但錯配修復基因蛋白在SCRC中的具體表達狀態及其與SCRC患者臨床病理參數之間的關系目前尚未明確，對此進行研究將有助于增加對結直腸癌的生物學行為及發病機制的認識。本研究采用免疫組織化學方法研究SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白表達缺失狀態及其與SCRC患者臨床病理參數之間的關系，旨在探討錯配修復基因蛋白表達缺失在SCRC腫瘤發生、發展中的作用，這有助于為SCRC患者制定個體化的化療方案和預后判斷提供一個客觀的參考指標。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取空軍總醫院普通外科和北京大學腫瘤醫院結直腸外科2008年3月至2012年3月期間收治的SCRC患者263例，其中男143例，女120例；年齡（62.7±11.2）歲（35～86歲）；腫瘤部位：右半結腸75例，左半結腸90例，直腸98例；組織分化程度：高分化腺癌20例，中分化腺癌165例，低分化及黏液性腺癌78例；淋巴結轉移：陽性149例，陰性114例；腫瘤浸潤深度：漿膜層48例、肌層及黏膜下層215例。所有病例均經組織學證實且術前均未接受過放化療。取其手術切除且經甲醛液固定和石蠟包埋的腫瘤組織標本進行研究。
1.2 免疫組織化學方法檢測SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白表達
1.2.1 主要材料
即用型hMLH1鼠抗人單克隆抗體（ZM-0154）、即用型hMSH2鼠抗人單克隆抗體（ZM-0156）、即用型hMSH6鼠抗人單克隆抗體（ZM-0387）均購自北京中杉金橋生物公司。試驗由LAB vision Autostainer 360自動染色儀系統（福建邁新公司）程控完成、鏡下圖像以Olympus Dp70圖像采集分析儀進行采集、分析。
1.2.2 免疫組織化學方法
嚴格按產品說明書進行操作。切片常規脫蠟至水，hMLH1、hMSH2、hMSH6經1 mmol/L pH 8.0的EDTA抗原修復液高壓熱修復。30 mL/L H2O2孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，滴加正常兔血清工作液，孵育10 min后傾去，不洗；滴加一抗37℃孵育2 h，PBS沖洗3 min×3次；滴加二抗，孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加三抗，孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。PBS代替一抗作陰性對照，正常大腸黏膜上皮表達情況作陽性對照。在200倍視野下隨機選取10個視野，計數每個視野中正常黏膜或腫瘤細胞的染色情況，取平均值。
1.2.3 結果判斷標準
hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達陽性均定位于細胞核。依據染色強度和陽性細胞率來計算評分[3-5]。染色強度：0分為陰性，1分為弱陽性（±），2分為陽性（+），3分為強陽性（++）。陽性細胞率：< 1%為0分、1%～25%為1分、25%～50%為2分、50%～75%為3分、≥75%為4分。以染色強度與陽性細胞率得分之和計算評分：0～2分為陰性（-）、3～5分為陽性（+）、6～7分為強陽性（++）。評分過程由兩名高年資病理科醫生雙盲法獨立完成。
1.3 統計學方法
應用SPSS 21.0統計軟件包進行統計分析。計數資料采用兩個（或多個）樣本率比較的χ2檢驗；相關性分析采用Spearman等級相關分析，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達情況
免疫組織化學染色結果顯示，hMLH1、hMSH2、hMSH6均定位于腫瘤細胞核，鏡下可見細胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒，細胞質可輕染，細胞膜和間質不染色（圖 1）。263例SCRC患者的腫瘤組織中hMLH1蛋白表達缺失率為13.3%（35/263），hMSH2蛋白表達缺失率為12.2%（32/263），hMSH6蛋白表達缺失率為28.9%（76/263），hMLH1/hMSH2表達共同缺失率為3.4%（9/263），hMLH1/hMSH6表達共同缺失率為10.2%（27/263），hMSH2/hMSH6表達共同缺失率為6.8%（18/263），hMLH1/hMSH2/hMSH6表達共同缺失率為3.4%（9/263）。hMSH6蛋白表達缺失率明顯高于hMLH1和hMSH2，差異有統計學意義（P < 0.05）。
圖1
SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達（免疫組織化學??×200）。1A：hMLH1核表達；1B：hMSH2核表達；1C：hMSH6核表達
2.2 hMLH1、hMSH2、hMSH6表達缺失與SCRC患者臨床病理參數之間的關系
①hMLH1表達缺失率與SCRC患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤浸潤深度、有無脈管癌栓、有無淋巴結轉移均無關（P > 0.05）；而僅與腫瘤分化程度有關（P < 0.05），即隨著分化程度增高，hMLH1表達缺失率增高。②hMSH2表達缺失率與SCRC患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、有無脈管癌栓、有無淋巴結轉移均無關（P > 0.05）；而僅與腫瘤大小有關（P < 0.05），即隨著腫瘤直徑增大，hMSH2表達缺失率增高。③hMSH6表達缺失率與SCRC患者年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、有無脈管癌栓均無關（P > 0.05）；而與患者性別、有無淋巴結轉移有關（P < 0.05），即在男性患者中的hMSH6表達缺失率明顯高于女性患者，在較少淋巴結轉移組的hMSH6表達缺失率明顯高于較多淋巴結轉移組。見表 1。
表1
hMLH1、hMSH2、hMSH6表達缺失與SCRC患者臨床病理參數間的關系〔例（%）〕
2.3 hMLH1、hMSH2、hMSH6三者之間表達的相關性分析結果
hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC腫瘤組織中表達的相關性結果見表 2，按照配對資料四格表計算可知：hMLH1與hMSH2的表達無明顯相關性（rs=0.073，P=0.253），hMLH1與hMSH6表達呈正相關（rs=0.446，P=0.000），hMSH2與hMSH6表達亦呈正相關（rs=0.373，P=0.013）。
表2
hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC中表達的相關性分析結果
3 討論
明確疾病發生、發展的生物學規律是疾病治療能夠得以突破的關鍵。目前，人們尚未徹底掌握結直腸癌發生、發展、侵襲、轉移等生物學行為的具體機制。研究[6-8]證實，錯配修復基因的種系突變及其所導致的微衛星不穩定是引起林奇綜合征發病的遺傳學病因。錯配修復基因突變導致其蛋白表達產物產生缺陷而失去錯配修復功能，從而導致微衛星不穩定或DNA復制錯誤，進而增加細胞基因組的不穩定，引起細胞增殖及異常分化增加，最終導致多種腫瘤的發生。錯配修復基因突變表現為其所指導合成的蛋白產物的表達障礙，hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達作為林奇綜合征診斷的依據已被公認。因此本研究通過免疫組織化學方法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6這三個最主要的錯配修復基因蛋白的表達情況來間接判斷SCRC腫瘤組織中錯配修復基因的突變情況具有較高的可信度和準確度。
雖然錯配修復基因蛋白在SCRC中的表達缺失率（27.2%）明顯低于林奇綜合征（46.7%～76.7%）[9-10]，但單獨一種錯配修復基因蛋白在SCRC中的表達缺失并不少見。本研究中hMLH1和hMSH2蛋白的表達缺失率大致相當（13.3%比12.2%），而hMSH6表達缺失（28.9%）比hMLH1、hMSH2缺失更常見，在SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6的表達情況與SCRC患者的年齡、腫瘤部位、腫瘤分化、侵襲轉移情況均明顯有別于林奇綜合征的生物學行為[11-13]。這說明以hMLH1、hMSH2、hMSH6為代表的錯配修復基因蛋白在SCRC腫瘤發生、發展中的作用與其在林奇綜合征中的作用是不同，錯配修復基因的突變缺失并非SCRC發病的主要因素。
本研究發現，hMLH1、hMSH2、hMSH6表達缺失率與SCRC臨床病理參數的關系明顯不同于林奇綜合征[14-15]，甚至有些結果截然相反。如：高分化的SCRC反而具有較高的hMLH1表達缺失率、淋巴結轉移較少的SCRC反而具有較高的hMSH6表達缺失率。分析原因為：①低分化的癌細胞增殖分裂加快，基因發生錯配的概率增加，對錯配修復基因系統的反饋增強，從而使錯配修復基因表達增強，導致hMLH1蛋白高表達。②免疫組織化學方法檢測到表達的hMLH1蛋白有可能是已發生突變、無錯配修復功能的蛋白[16]。因此，只有對SCRC腫瘤組織進行錯配修復基因蛋白聯合檢測才有助于避免單獨單一錯配修復基因蛋白檢測可能帶來的評判誤差。
本研究結果發現，hMSH2蛋白隨著SCRC腫瘤體積的增大而表達缺失率增高（P < 0.01），結果提示，hMSH2的表達可能參與了SCRC腫瘤的進展過程。另外，本研究還發現，hMLH1、hMSH2蛋白表達缺失率與SCRC患者的年齡、性別、腫瘤部位、浸潤深度和淋巴結轉移均無關，結果提示，SCRC腫瘤發生的初始階段可能已經發生hMLH1、hMSH2基因突變，且持續存在和作用于SCRC腫瘤的發展[17-19]。
有研究[20-23]顯示，hMSH6蛋白可單獨或通過與hMSH2蛋白形成異二聚體的形式來發揮DNA錯配修復作用，hMSH6單獨突變僅能導致錯配修復基因功能的部分缺失，而hMSH2的錯義突變卻可導致hMSH2/hMSH6依賴的錯配修復基因的失活。本研究結果顯示，hMSH6表達缺失率（28.9%）明顯高于hMLH1（13.3%）和hMSH2（12.2%），差異有統計學意義（P < 0.05），且在男性SCRC患者中的表達缺失明顯高于女性患者（P < 0.01），這與文獻[24-26]報道一致。雖然性別與hMSH6突變之間的關聯機制尚需進一步證實和探討，但是本研究結果提示，男性SCRC患者更應該進行hMSH6基因突變的篩檢。
綜上所述，hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白在SCRC中的表達缺失并不少見，且其表達缺失與SCRC患者臨床病理參數的關系也明顯不同于林奇綜合征。因此，以hMLH1、hMSH2、hMSH6為代表的錯配修復基因蛋白在SCRC發生、發展中的作用可能也有別于林奇綜合征。對SCRC腫瘤組織進行hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達狀態的檢測有助于為SCRC患者制定個體化的化療方案和預后判斷提供一個客觀的參考指標。
錯配修復基因的種系突變及其所導致的微衛星不穩定在林奇綜合征發生中的作用已被人們所認知[1]。有研究[2]顯示，錯配修復基因的突變缺失也參與了散發性結直腸癌（sporadic colorectal carcinoma，SCRC）的發生、發展。但錯配修復基因蛋白在SCRC中的具體表達狀態及其與SCRC患者臨床病理參數之間的關系目前尚未明確，對此進行研究將有助于增加對結直腸癌的生物學行為及發病機制的認識。本研究采用免疫組織化學方法研究SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白表達缺失狀態及其與SCRC患者臨床病理參數之間的關系，旨在探討錯配修復基因蛋白表達缺失在SCRC腫瘤發生、發展中的作用，這有助于為SCRC患者制定個體化的化療方案和預后判斷提供一個客觀的參考指標。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取空軍總醫院普通外科和北京大學腫瘤醫院結直腸外科2008年3月至2012年3月期間收治的SCRC患者263例，其中男143例，女120例；年齡（62.7±11.2）歲（35～86歲）；腫瘤部位：右半結腸75例，左半結腸90例，直腸98例；組織分化程度：高分化腺癌20例，中分化腺癌165例，低分化及黏液性腺癌78例；淋巴結轉移：陽性149例，陰性114例；腫瘤浸潤深度：漿膜層48例、肌層及黏膜下層215例。所有病例均經組織學證實且術前均未接受過放化療。取其手術切除且經甲醛液固定和石蠟包埋的腫瘤組織標本進行研究。
1.2 免疫組織化學方法檢測SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白表達
1.2.1 主要材料
即用型hMLH1鼠抗人單克隆抗體（ZM-0154）、即用型hMSH2鼠抗人單克隆抗體（ZM-0156）、即用型hMSH6鼠抗人單克隆抗體（ZM-0387）均購自北京中杉金橋生物公司。試驗由LAB vision Autostainer 360自動染色儀系統（福建邁新公司）程控完成、鏡下圖像以Olympus Dp70圖像采集分析儀進行采集、分析。
1.2.2 免疫組織化學方法
嚴格按產品說明書進行操作。切片常規脫蠟至水，hMLH1、hMSH2、hMSH6經1 mmol/L pH 8.0的EDTA抗原修復液高壓熱修復。30 mL/L H2O2孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，滴加正常兔血清工作液，孵育10 min后傾去，不洗；滴加一抗37℃孵育2 h，PBS沖洗3 min×3次；滴加二抗，孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加三抗，孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。PBS代替一抗作陰性對照，正常大腸黏膜上皮表達情況作陽性對照。在200倍視野下隨機選取10個視野，計數每個視野中正常黏膜或腫瘤細胞的染色情況，取平均值。
1.2.3 結果判斷標準
hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達陽性均定位于細胞核。依據染色強度和陽性細胞率來計算評分[3-5]。染色強度：0分為陰性，1分為弱陽性（±），2分為陽性（+），3分為強陽性（++）。陽性細胞率：< 1%為0分、1%～25%為1分、25%～50%為2分、50%～75%為3分、≥75%為4分。以染色強度與陽性細胞率得分之和計算評分：0～2分為陰性（-）、3～5分為陽性（+）、6～7分為強陽性（++）。評分過程由兩名高年資病理科醫生雙盲法獨立完成。
1.3 統計學方法
應用SPSS 21.0統計軟件包進行統計分析。計數資料采用兩個（或多個）樣本率比較的χ2檢驗；相關性分析采用Spearman等級相關分析，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達情況
免疫組織化學染色結果顯示，hMLH1、hMSH2、hMSH6均定位于腫瘤細胞核，鏡下可見細胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒，細胞質可輕染，細胞膜和間質不染色（圖 1）。263例SCRC患者的腫瘤組織中hMLH1蛋白表達缺失率為13.3%（35/263），hMSH2蛋白表達缺失率為12.2%（32/263），hMSH6蛋白表達缺失率為28.9%（76/263），hMLH1/hMSH2表達共同缺失率為3.4%（9/263），hMLH1/hMSH6表達共同缺失率為10.2%（27/263），hMSH2/hMSH6表達共同缺失率為6.8%（18/263），hMLH1/hMSH2/hMSH6表達共同缺失率為3.4%（9/263）。hMSH6蛋白表達缺失率明顯高于hMLH1和hMSH2，差異有統計學意義（P < 0.05）。
圖1
SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達（免疫組織化學??×200）。1A：hMLH1核表達；1B：hMSH2核表達；1C：hMSH6核表達
2.2 hMLH1、hMSH2、hMSH6表達缺失與SCRC患者臨床病理參數之間的關系
①hMLH1表達缺失率與SCRC患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤浸潤深度、有無脈管癌栓、有無淋巴結轉移均無關（P > 0.05）；而僅與腫瘤分化程度有關（P < 0.05），即隨著分化程度增高，hMLH1表達缺失率增高。②hMSH2表達缺失率與SCRC患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、有無脈管癌栓、有無淋巴結轉移均無關（P > 0.05）；而僅與腫瘤大小有關（P < 0.05），即隨著腫瘤直徑增大，hMSH2表達缺失率增高。③hMSH6表達缺失率與SCRC患者年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、有無脈管癌栓均無關（P > 0.05）；而與患者性別、有無淋巴結轉移有關（P < 0.05），即在男性患者中的hMSH6表達缺失率明顯高于女性患者，在較少淋巴結轉移組的hMSH6表達缺失率明顯高于較多淋巴結轉移組。見表 1。
表1
hMLH1、hMSH2、hMSH6表達缺失與SCRC患者臨床病理參數間的關系〔例（%）〕
2.3 hMLH1、hMSH2、hMSH6三者之間表達的相關性分析結果
hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC腫瘤組織中表達的相關性結果見表 2，按照配對資料四格表計算可知：hMLH1與hMSH2的表達無明顯相關性（rs=0.073，P=0.253），hMLH1與hMSH6表達呈正相關（rs=0.446，P=0.000），hMSH2與hMSH6表達亦呈正相關（rs=0.373，P=0.013）。
表2
hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC中表達的相關性分析結果
3 討論
明確疾病發生、發展的生物學規律是疾病治療能夠得以突破的關鍵。目前，人們尚未徹底掌握結直腸癌發生、發展、侵襲、轉移等生物學行為的具體機制。研究[6-8]證實，錯配修復基因的種系突變及其所導致的微衛星不穩定是引起林奇綜合征發病的遺傳學病因。錯配修復基因突變導致其蛋白表達產物產生缺陷而失去錯配修復功能，從而導致微衛星不穩定或DNA復制錯誤，進而增加細胞基因組的不穩定，引起細胞增殖及異常分化增加，最終導致多種腫瘤的發生。錯配修復基因突變表現為其所指導合成的蛋白產物的表達障礙，hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達作為林奇綜合征診斷的依據已被公認。因此本研究通過免疫組織化學方法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6這三個最主要的錯配修復基因蛋白的表達情況來間接判斷SCRC腫瘤組織中錯配修復基因的突變情況具有較高的可信度和準確度。
雖然錯配修復基因蛋白在SCRC中的表達缺失率（27.2%）明顯低于林奇綜合征（46.7%～76.7%）[9-10]，但單獨一種錯配修復基因蛋白在SCRC中的表達缺失并不少見。本研究中hMLH1和hMSH2蛋白的表達缺失率大致相當（13.3%比12.2%），而hMSH6表達缺失（28.9%）比hMLH1、hMSH2缺失更常見，在SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6的表達情況與SCRC患者的年齡、腫瘤部位、腫瘤分化、侵襲轉移情況均明顯有別于林奇綜合征的生物學行為[11-13]。這說明以hMLH1、hMSH2、hMSH6為代表的錯配修復基因蛋白在SCRC腫瘤發生、發展中的作用與其在林奇綜合征中的作用是不同，錯配修復基因的突變缺失并非SCRC發病的主要因素。
本研究發現，hMLH1、hMSH2、hMSH6表達缺失率與SCRC臨床病理參數的關系明顯不同于林奇綜合征[14-15]，甚至有些結果截然相反。如：高分化的SCRC反而具有較高的hMLH1表達缺失率、淋巴結轉移較少的SCRC反而具有較高的hMSH6表達缺失率。分析原因為：①低分化的癌細胞增殖分裂加快，基因發生錯配的概率增加，對錯配修復基因系統的反饋增強，從而使錯配修復基因表達增強，導致hMLH1蛋白高表達。②免疫組織化學方法檢測到表達的hMLH1蛋白有可能是已發生突變、無錯配修復功能的蛋白[16]。因此，只有對SCRC腫瘤組織進行錯配修復基因蛋白聯合檢測才有助于避免單獨單一錯配修復基因蛋白檢測可能帶來的評判誤差。
本研究結果發現，hMSH2蛋白隨著SCRC腫瘤體積的增大而表達缺失率增高（P < 0.01），結果提示，hMSH2的表達可能參與了SCRC腫瘤的進展過程。另外，本研究還發現，hMLH1、hMSH2蛋白表達缺失率與SCRC患者的年齡、性別、腫瘤部位、浸潤深度和淋巴結轉移均無關，結果提示，SCRC腫瘤發生的初始階段可能已經發生hMLH1、hMSH2基因突變，且持續存在和作用于SCRC腫瘤的發展[17-19]。
有研究[20-23]顯示，hMSH6蛋白可單獨或通過與hMSH2蛋白形成異二聚體的形式來發揮DNA錯配修復作用，hMSH6單獨突變僅能導致錯配修復基因功能的部分缺失，而hMSH2的錯義突變卻可導致hMSH2/hMSH6依賴的錯配修復基因的失活。本研究結果顯示，hMSH6表達缺失率（28.9%）明顯高于hMLH1（13.3%）和hMSH2（12.2%），差異有統計學意義（P < 0.05），且在男性SCRC患者中的表達缺失明顯高于女性患者（P < 0.01），這與文獻[24-26]報道一致。雖然性別與hMSH6突變之間的關聯機制尚需進一步證實和探討，但是本研究結果提示，男性SCRC患者更應該進行hMSH6基因突變的篩檢。
綜上所述，hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白在SCRC中的表達缺失并不少見，且其表達缺失與SCRC患者臨床病理參數的關系也明顯不同于林奇綜合征。因此，以hMLH1、hMSH2、hMSH6為代表的錯配修復基因蛋白在SCRC發生、發展中的作用可能也有別于林奇綜合征。對SCRC腫瘤組織進行hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達狀態的檢測有助于為SCRC患者制定個體化的化療方案和預后判斷提供一個客觀的參考指標。
