引用本文： 吳愷明, 何裕隆, 柳發鏗, 陳劍輝. 線粒體轉錄因子A在結腸癌中的表達和對增殖調控的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(5): 576-580. doi: 10.7507/1007-9424.20150152 復制
在全球范圍內，2012年結直腸癌病例新發1 361 000例，死亡694 000例；中國新發253 000例，死亡139 000例，發病率和死亡率在腫瘤疾病中均位居前列[1-2]。進展期結腸癌的治療原則是以手術為主的綜合治療，但綜合治療的有效率仍有待提高，腫瘤細胞的發生和生長調控機制仍未闡明。結腸癌的發生、發展受多基因多信號通道調控，改變通道中的信號可以促進腫瘤細胞的生長或誘發腫瘤細胞凋亡[3-6]。線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM，也稱為mtTFA）屬于典型的高遷移率族-box蛋白家族，從線粒體基因組的D-loop區結合激活轉錄。TFAM是編碼RNA，由核基因編碼，然后被轉入線粒體內發揮調節作用[7-9]。TFAM在子宮內膜癌[10]、宮頸癌[11]、乳腺癌[12]和胰腺癌[13]中高表達并與腫瘤的增殖相關，在胰腺癌中是預后不良指標[13]。TFAM下游的環氧化酶（COX）2蛋白高表達與癌細胞增殖呈正相關[14-17]。TFAM線粒體控制著腫瘤細胞的發生和發展。本研究擬探討TFAM在結腸癌組織和細胞中的表達及其對結腸癌細胞增殖的影響。
1 資料與方法
1.1 結腸癌組織和結腸癌細胞
1.1.1 結腸癌組織
收集中山大學附屬第一醫院2013年3月至2013年4月期間手術切除的30例結腸癌患者的手術標本。30例患者中男18例，女12例；平均年齡59歲。腫瘤位于乙狀結腸15例，降結腸7例，升結腸8例。根據NCCN 2014年第3版指南的TNM分期，Ⅲ期28例（93.3%），Ⅱ期2例（6.7%）。30例結腸癌患者的癌組織均經病理學檢查確診為原發性結腸腺癌，接受結腸癌根治術+淋巴結廓清術，術后至少活檢12枚淋巴結，病理資料及隨訪記錄完整。排除有其他原發腫瘤病史、有遠處轉移（如腹膜、肝、腦等）、接受新輔助放化療或進行其他針對腫瘤的特殊治療及患者住院期間死亡患者。在結腸癌手術標本離體20 min內，在距結腸癌灶邊緣10 cm的正常結腸處取直徑約5 mm的結腸黏膜作為正常結腸組織取材，在結腸癌灶質硬、隆起樣改變處取直徑約5 mm的組織塊作為結腸癌組織取材。標本分兩管凍存于液氮，一管用于進行蛋白提取，一管用于進行RNA提取。
1.1.2 結腸癌細胞
人正常結腸細胞購于ATCC細胞庫，結腸癌細胞SW480、HT-29和HCT116購于中國科學院細胞庫。
1.2 方法
1.2.1 real-time PCR法檢測結腸癌組織和癌旁正常結腸組織中TFAM mRNA表達
設計PCR引物，TFAM上游引物為5'-ATGGCGTTTCTCCGAAGC-AT-3'，下游引物為5'-TCCGCCCTATAAGCATCTTGA-3'。按照Invitrogen公司的Trizol操作說明書進行總RNA抽提，根據Promega公司的M-MLV操作說明書進行RNA逆轉錄獲得cDNA，利用SYBR GreenⅠ試劑盒（Tiangen公司）進行實時熒光定量PCR檢測，每個樣品均行3個平行試驗。利用熒光定量PCR曲線給出的Ct值，分別計算出TFAM和β-actin的平均Ct值，利用公式△Ct=Ct TFAM-Ctβ-actin計算出△Ct，最后根據公式“表達量的比值=2-△△Ct”得到TFAM和β-actin表達水平的比值。
1.2.2 real-time PCR法檢測TFAM mRNA在不同結腸癌細胞中的表達
按照Invitrogen公司的Trizol操作說明書進行總RNA抽提，根據Promega公司的M-MLV操作說明書進行RNA逆轉錄獲得cDNA，利用SYBR GreenⅠ試劑盒（Tiangen公司）進行實時熒光定量PCR檢測，每個樣品均行3個平行試驗。利用熒光定量PCR曲線給出的Ct值，分別計算出TFAM和β-actin的平均Ct值，利用公式△Ct=CtTFAM-Ctβ-actin計算出△Ct，最后根據公式“表達量的比值=2-△△Ct”得到TFAM和β-actin表達水平的比值。
1.2.3 Western blot法檢測TFAM蛋白在不同結腸癌細胞中的表達
將處于對數生長期的人正常結腸上皮細胞和SW480、HCT116、HT-29細胞消化后吹打成均勻單細胞懸液，分別接種至6孔培養板。培養24 h后，去除培養基，加入細胞裂解液，刮取細胞蛋白，4℃超聲5 s，4℃12 000 r/min（r=7.2 cm）離心10 min。留取上清蛋白液，BCA方法測定蛋白濃度，配平容積后進行SDS-PAGE蛋白電泳，并轉至PVDF膜。一抗4℃孵育過夜，二抗室溫下孵育1 h，化學發光法膠片曝光。TFAM一抗（Boster）和β-actin一抗（Boster）的濃度均為1∶500，羊抗兔二抗（Invitrogen）的濃度為1∶4 000。顯色曝光后予Gel pro 4.0對圖像進行灰度分析。
1.2.4 質粒轉染上調TFAM的表達
將處于對數生長期的SW480細胞消化、吹打成單細胞懸液后，按每孔1×104/孔接種在96孔板上。按照Invitrogen Lipo2000說明書的操作步驟轉染細胞。將20μL Lipo2000與2 mL Opti-MEM混勻后靜置10 min；將TFAM表達載體pcDNA3.1-TFAM與2 mL Opti-MEM混勻后，將上述兩種混合物混勻并靜置20 min；細胞去除上清，加入100μL轉染液，孵育6 h后更換為普通培養基，得到pcDNA3.1-TFAM-SW480細胞（轉染組）。無義對照組采用pcDNA3.1空載體進行轉染，得到pcDNA3.1-SW480細胞。
1.2.5 MTT實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響
將按1.2.4描述方法處理后細胞分別于0、24、48、72、96和120 h每孔加入10μL MTT溶液（5 mg/mL），細胞培養箱孵育4 h。棄上清液，各孔加入100μL DMSO，搖動15 min后，讀取每孔在490 nm的吸光度（A490 nm）值。每個時間點各組設置3個復孔，結果以均數±標準差表示。
1.2.6 BrdU實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響
將按1.2.4描述方法處理細胞后，按照BrdU細胞增殖檢測試劑盒操作步驟，檢測細胞增殖能力。加入含BrdU培養基孵育，分別于24及48 h移除培養基，固定細胞，并依次孵育BrdU一抗（鼠抗，1∶100稀釋）和FITC標記的山羊抗小鼠二抗（1∶50，DAKO公司），用流式細胞儀進行檢測FITC陽性率，每組實驗重復3次，結果以均數±標準差表示。
1.3 統計學方法
使用SPSS 15.0軟件進行統計分析。計量資料用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TFAM mRNA在結腸癌組織中的表達情況
real-time PCR結果顯示，TFAM mRNA在結腸癌組織中的表達較在配對的癌旁正常結腸組織中明顯升高（P < 0.000 1），見圖 1。
圖1
TFAM mRNA在配對的結腸癌組織及癌旁正常組織中的表達情況
2.2 TFAM mRNA在不同結腸癌細胞中的表達情況
real-time PCR結果顯示，與正常結腸細胞相比，TFAM mRNA在SW480、HT-29和HCT116細胞中的表達均明顯升高，差異有統計學意義（分別P=0.000 8、P=0.002 3、P=0.000 6）。其中TFAM mRNA在SW480細胞中增幅更明顯，見圖 2。
圖2
TFAM mRNA在不同細胞中的表達
2.3 TFAM蛋白在不同結腸癌細胞中的表達情況
Western blot結果顯示，與正常結腸細胞相比，TFAM蛋白在SW480、HT-29和HCT116細胞中的表達均明顯增強或升高，差異有統計學意義（分別P=0.000 2、P=0.003 8、P=0.001 6）。其中TFAM蛋白在SW480細胞中增幅最明顯，見圖 3、4。
圖3
TFAM蛋白在不同結腸細胞中的定性表達結果
圖4
FAM蛋白在不同結腸細胞中的半定量表達結果
2.4 MTT實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響
隨著時間推移，3組細胞均增殖。在轉染96 h內，3組細胞的A490 nm值比較差異無統計學意義（P > 0.05）。在轉染96 h和120 h時，無義對照組和空白對照組間的A490 nm值比較差異無統計學意義（P > 0.05），但轉染組的A490 nm值明顯高于無義對照組（P < 0.000 1）和空白對照組（P < 0.000 1）。見圖 5。
圖5
MTT實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響結果。與無義對照組和空白對照組比較，* P < 0.000 1
2.5 BrdU實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響
轉染后24 h時，3組間細胞增殖吸光度值比較差異無統計學意義（P > 0.05）。轉染后48 h時，無義對照組和空白對照組的細胞增殖吸光度值比較差異無統計學意義（P > 0.05），轉染組的細胞增殖吸光度值明顯高于無義對照組（P < 0.001）和空白對照組（P < 0.001）。見圖 6。
圖6
BrdU實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響。與無義對照組和空白對照組比較，* P < 0.001
3 討論
線粒體解偶聯，介導細胞代謝轉向為有氧糖酵解[18]。線粒體在細胞的新陳代謝中起重要作用，所以對細胞的增殖至關重要。因此，線粒體控制著腫瘤細胞的發生和發展。此外，線粒體的數量與腫瘤細胞的生存率密切相關[9]，所以線粒體是調控腫瘤細胞增殖的潛在靶細胞器。
TFAM由核基因編碼，然后被轉入線粒體內發揮調節作用。TFAM的基本生物學功能包括：①激活線粒體DNA的轉錄；②調節線粒體DNA的拷貝數；③改善線粒體功能[8, 19-20]。已有文獻[16-17]報道，TFAM下游的COX2蛋白高表達可以促進結腸癌細胞的生長。所以，TFAM可能也與結腸癌細胞生長相關。
本研究選擇TFAM作為線粒體靶向的調控信號后，首先證實了其mRNA在結腸癌組織中高表達，為細胞實驗提供了初步依據，但組織樣本中混雜因素較多，需行純度高的細胞實驗。
在細胞實驗中，先普選了SW480、HT-29和HCT116三株結腸癌細胞株。SW480是從一50歲男性患者結腸腺癌中分離得到的人結腸癌細胞系，是原發性結腸癌細胞，該細胞在ras基因的第12個密碼子發生突變，常用于ras基因密碼子突變PCR檢測的陽性對照。HT-29細胞是從一44歲女性患者分離得到的人結腸腺癌細胞，具備人結腸癌細胞的基本特性，突變未明。HCT116細胞是從成年男性患者結腸腺癌中分離得到的人結腸癌細胞系，是原發性結腸癌細胞，該細胞在ras基因的第13個密碼子發生突變，也常用于ras基因密碼子突變PCR檢測的陽性對照。所以上述三株細胞株均可用于研究原發性結腸癌。
本研究結果顯示，TFAM的mRNA和蛋白均在SW480細胞株中表達最高。所以，后續的細胞增殖調控實驗僅在SW480細胞株中進行，以節約人力物力。TFAM在HT-29和HCT116細胞中高表達的結果，也可為該兩株細胞的其他研究提供可用的信息。本實驗結果顯示，TFAM在結腸癌組織和細胞中均高表達，基于癌細胞比正常細胞高增殖的特性，TFAM可能參與了結腸癌細胞增殖的信號傳遞，是潛在調控mRNA。上調TFAM，預期可促進結腸癌細胞增殖。本研究在MTT實驗和BrdU實驗中，選擇上調而非下調TFAM的表達，正是基于上調TFAM能促進SW480增殖的預期，換句話說就是如果下調TFAM，則預期SW480增殖下降，但在細胞增殖下降的結果容易受細胞培養過程中諸多技術細節的影響，容易產生偏倚。所以，本研究最終選擇了上調TFAM的干預手段。結果顯示，經質粒轉染TFAM后，SW480的增殖上升，符合預期。
目前普遍猜想，細胞增殖的通信調控網絡應該是金字塔形的，越上游調控信號的數量將越少，調控功能也越多[21-24]。如microRNA，它通過與靶mRNA的3' UTR（非翻譯區）完全互補導致mRNA降解或不完全互補結合抑制mRNA翻譯[25-27]，目前已有研究提出microRNA參與了結腸癌的增殖調控[28]。在本研究中不僅發現TFAM在結腸癌組織和結腸癌細胞中均高表達，還發現其促進結腸癌細胞的增殖，充分說明TFAM和結腸癌的增殖相關。在進一步的研究中或將尋找調控TFAM的microRNA。
從本研究結果初步得出，TFAM是結腸癌細胞增殖的調控信號，上調TFAM可以促進結腸癌細胞的增殖。
在全球范圍內，2012年結直腸癌病例新發1 361 000例，死亡694 000例；中國新發253 000例，死亡139 000例，發病率和死亡率在腫瘤疾病中均位居前列[1-2]。進展期結腸癌的治療原則是以手術為主的綜合治療，但綜合治療的有效率仍有待提高，腫瘤細胞的發生和生長調控機制仍未闡明。結腸癌的發生、發展受多基因多信號通道調控，改變通道中的信號可以促進腫瘤細胞的生長或誘發腫瘤細胞凋亡[3-6]。線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM，也稱為mtTFA）屬于典型的高遷移率族-box蛋白家族，從線粒體基因組的D-loop區結合激活轉錄。TFAM是編碼RNA，由核基因編碼，然后被轉入線粒體內發揮調節作用[7-9]。TFAM在子宮內膜癌[10]、宮頸癌[11]、乳腺癌[12]和胰腺癌[13]中高表達并與腫瘤的增殖相關，在胰腺癌中是預后不良指標[13]。TFAM下游的環氧化酶（COX）2蛋白高表達與癌細胞增殖呈正相關[14-17]。TFAM線粒體控制著腫瘤細胞的發生和發展。本研究擬探討TFAM在結腸癌組織和細胞中的表達及其對結腸癌細胞增殖的影響。
1 資料與方法
1.1 結腸癌組織和結腸癌細胞
1.1.1 結腸癌組織
收集中山大學附屬第一醫院2013年3月至2013年4月期間手術切除的30例結腸癌患者的手術標本。30例患者中男18例，女12例；平均年齡59歲。腫瘤位于乙狀結腸15例，降結腸7例，升結腸8例。根據NCCN 2014年第3版指南的TNM分期，Ⅲ期28例（93.3%），Ⅱ期2例（6.7%）。30例結腸癌患者的癌組織均經病理學檢查確診為原發性結腸腺癌，接受結腸癌根治術+淋巴結廓清術，術后至少活檢12枚淋巴結，病理資料及隨訪記錄完整。排除有其他原發腫瘤病史、有遠處轉移（如腹膜、肝、腦等）、接受新輔助放化療或進行其他針對腫瘤的特殊治療及患者住院期間死亡患者。在結腸癌手術標本離體20 min內，在距結腸癌灶邊緣10 cm的正常結腸處取直徑約5 mm的結腸黏膜作為正常結腸組織取材，在結腸癌灶質硬、隆起樣改變處取直徑約5 mm的組織塊作為結腸癌組織取材。標本分兩管凍存于液氮，一管用于進行蛋白提取，一管用于進行RNA提取。
1.1.2 結腸癌細胞
人正常結腸細胞購于ATCC細胞庫，結腸癌細胞SW480、HT-29和HCT116購于中國科學院細胞庫。
1.2 方法
1.2.1 real-time PCR法檢測結腸癌組織和癌旁正常結腸組織中TFAM mRNA表達
設計PCR引物，TFAM上游引物為5'-ATGGCGTTTCTCCGAAGC-AT-3'，下游引物為5'-TCCGCCCTATAAGCATCTTGA-3'。按照Invitrogen公司的Trizol操作說明書進行總RNA抽提，根據Promega公司的M-MLV操作說明書進行RNA逆轉錄獲得cDNA，利用SYBR GreenⅠ試劑盒（Tiangen公司）進行實時熒光定量PCR檢測，每個樣品均行3個平行試驗。利用熒光定量PCR曲線給出的Ct值，分別計算出TFAM和β-actin的平均Ct值，利用公式△Ct=Ct TFAM-Ctβ-actin計算出△Ct，最后根據公式“表達量的比值=2-△△Ct”得到TFAM和β-actin表達水平的比值。
1.2.2 real-time PCR法檢測TFAM mRNA在不同結腸癌細胞中的表達
按照Invitrogen公司的Trizol操作說明書進行總RNA抽提，根據Promega公司的M-MLV操作說明書進行RNA逆轉錄獲得cDNA，利用SYBR GreenⅠ試劑盒（Tiangen公司）進行實時熒光定量PCR檢測，每個樣品均行3個平行試驗。利用熒光定量PCR曲線給出的Ct值，分別計算出TFAM和β-actin的平均Ct值，利用公式△Ct=CtTFAM-Ctβ-actin計算出△Ct，最后根據公式“表達量的比值=2-△△Ct”得到TFAM和β-actin表達水平的比值。
1.2.3 Western blot法檢測TFAM蛋白在不同結腸癌細胞中的表達
將處于對數生長期的人正常結腸上皮細胞和SW480、HCT116、HT-29細胞消化后吹打成均勻單細胞懸液，分別接種至6孔培養板。培養24 h后，去除培養基，加入細胞裂解液，刮取細胞蛋白，4℃超聲5 s，4℃12 000 r/min（r=7.2 cm）離心10 min。留取上清蛋白液，BCA方法測定蛋白濃度，配平容積后進行SDS-PAGE蛋白電泳，并轉至PVDF膜。一抗4℃孵育過夜，二抗室溫下孵育1 h，化學發光法膠片曝光。TFAM一抗（Boster）和β-actin一抗（Boster）的濃度均為1∶500，羊抗兔二抗（Invitrogen）的濃度為1∶4 000。顯色曝光后予Gel pro 4.0對圖像進行灰度分析。
1.2.4 質粒轉染上調TFAM的表達
將處于對數生長期的SW480細胞消化、吹打成單細胞懸液后，按每孔1×104/孔接種在96孔板上。按照Invitrogen Lipo2000說明書的操作步驟轉染細胞。將20μL Lipo2000與2 mL Opti-MEM混勻后靜置10 min；將TFAM表達載體pcDNA3.1-TFAM與2 mL Opti-MEM混勻后，將上述兩種混合物混勻并靜置20 min；細胞去除上清，加入100μL轉染液，孵育6 h后更換為普通培養基，得到pcDNA3.1-TFAM-SW480細胞（轉染組）。無義對照組采用pcDNA3.1空載體進行轉染，得到pcDNA3.1-SW480細胞。
1.2.5 MTT實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響
將按1.2.4描述方法處理后細胞分別于0、24、48、72、96和120 h每孔加入10μL MTT溶液（5 mg/mL），細胞培養箱孵育4 h。棄上清液，各孔加入100μL DMSO，搖動15 min后，讀取每孔在490 nm的吸光度（A490 nm）值。每個時間點各組設置3個復孔，結果以均數±標準差表示。
1.2.6 BrdU實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響
將按1.2.4描述方法處理細胞后，按照BrdU細胞增殖檢測試劑盒操作步驟，檢測細胞增殖能力。加入含BrdU培養基孵育，分別于24及48 h移除培養基，固定細胞，并依次孵育BrdU一抗（鼠抗，1∶100稀釋）和FITC標記的山羊抗小鼠二抗（1∶50，DAKO公司），用流式細胞儀進行檢測FITC陽性率，每組實驗重復3次，結果以均數±標準差表示。
1.3 統計學方法
使用SPSS 15.0軟件進行統計分析。計量資料用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TFAM mRNA在結腸癌組織中的表達情況
real-time PCR結果顯示，TFAM mRNA在結腸癌組織中的表達較在配對的癌旁正常結腸組織中明顯升高（P < 0.000 1），見圖 1。
圖1
TFAM mRNA在配對的結腸癌組織及癌旁正常組織中的表達情況
2.2 TFAM mRNA在不同結腸癌細胞中的表達情況
real-time PCR結果顯示，與正常結腸細胞相比，TFAM mRNA在SW480、HT-29和HCT116細胞中的表達均明顯升高，差異有統計學意義（分別P=0.000 8、P=0.002 3、P=0.000 6）。其中TFAM mRNA在SW480細胞中增幅更明顯，見圖 2。
圖2
TFAM mRNA在不同細胞中的表達
2.3 TFAM蛋白在不同結腸癌細胞中的表達情況
Western blot結果顯示，與正常結腸細胞相比，TFAM蛋白在SW480、HT-29和HCT116細胞中的表達均明顯增強或升高，差異有統計學意義（分別P=0.000 2、P=0.003 8、P=0.001 6）。其中TFAM蛋白在SW480細胞中增幅最明顯，見圖 3、4。
圖3
TFAM蛋白在不同結腸細胞中的定性表達結果
圖4
FAM蛋白在不同結腸細胞中的半定量表達結果
2.4 MTT實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響
隨著時間推移，3組細胞均增殖。在轉染96 h內，3組細胞的A490 nm值比較差異無統計學意義（P > 0.05）。在轉染96 h和120 h時，無義對照組和空白對照組間的A490 nm值比較差異無統計學意義（P > 0.05），但轉染組的A490 nm值明顯高于無義對照組（P < 0.000 1）和空白對照組（P < 0.000 1）。見圖 5。
圖5
MTT實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響結果。與無義對照組和空白對照組比較，* P < 0.000 1
2.5 BrdU實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響
轉染后24 h時，3組間細胞增殖吸光度值比較差異無統計學意義（P > 0.05）。轉染后48 h時，無義對照組和空白對照組的細胞增殖吸光度值比較差異無統計學意義（P > 0.05），轉染組的細胞增殖吸光度值明顯高于無義對照組（P < 0.001）和空白對照組（P < 0.001）。見圖 6。
圖6
BrdU實驗檢測上調TFAM表達對SW480細胞增殖的影響。與無義對照組和空白對照組比較，* P < 0.001
3 討論
線粒體解偶聯，介導細胞代謝轉向為有氧糖酵解[18]。線粒體在細胞的新陳代謝中起重要作用，所以對細胞的增殖至關重要。因此，線粒體控制著腫瘤細胞的發生和發展。此外，線粒體的數量與腫瘤細胞的生存率密切相關[9]，所以線粒體是調控腫瘤細胞增殖的潛在靶細胞器。
TFAM由核基因編碼，然后被轉入線粒體內發揮調節作用。TFAM的基本生物學功能包括：①激活線粒體DNA的轉錄；②調節線粒體DNA的拷貝數；③改善線粒體功能[8, 19-20]。已有文獻[16-17]報道，TFAM下游的COX2蛋白高表達可以促進結腸癌細胞的生長。所以，TFAM可能也與結腸癌細胞生長相關。
本研究選擇TFAM作為線粒體靶向的調控信號后，首先證實了其mRNA在結腸癌組織中高表達，為細胞實驗提供了初步依據，但組織樣本中混雜因素較多，需行純度高的細胞實驗。
在細胞實驗中，先普選了SW480、HT-29和HCT116三株結腸癌細胞株。SW480是從一50歲男性患者結腸腺癌中分離得到的人結腸癌細胞系，是原發性結腸癌細胞，該細胞在ras基因的第12個密碼子發生突變，常用于ras基因密碼子突變PCR檢測的陽性對照。HT-29細胞是從一44歲女性患者分離得到的人結腸腺癌細胞，具備人結腸癌細胞的基本特性，突變未明。HCT116細胞是從成年男性患者結腸腺癌中分離得到的人結腸癌細胞系，是原發性結腸癌細胞，該細胞在ras基因的第13個密碼子發生突變，也常用于ras基因密碼子突變PCR檢測的陽性對照。所以上述三株細胞株均可用于研究原發性結腸癌。
本研究結果顯示，TFAM的mRNA和蛋白均在SW480細胞株中表達最高。所以，后續的細胞增殖調控實驗僅在SW480細胞株中進行，以節約人力物力。TFAM在HT-29和HCT116細胞中高表達的結果，也可為該兩株細胞的其他研究提供可用的信息。本實驗結果顯示，TFAM在結腸癌組織和細胞中均高表達，基于癌細胞比正常細胞高增殖的特性，TFAM可能參與了結腸癌細胞增殖的信號傳遞，是潛在調控mRNA。上調TFAM，預期可促進結腸癌細胞增殖。本研究在MTT實驗和BrdU實驗中，選擇上調而非下調TFAM的表達，正是基于上調TFAM能促進SW480增殖的預期，換句話說就是如果下調TFAM，則預期SW480增殖下降，但在細胞增殖下降的結果容易受細胞培養過程中諸多技術細節的影響，容易產生偏倚。所以，本研究最終選擇了上調TFAM的干預手段。結果顯示，經質粒轉染TFAM后，SW480的增殖上升，符合預期。
目前普遍猜想，細胞增殖的通信調控網絡應該是金字塔形的，越上游調控信號的數量將越少，調控功能也越多[21-24]。如microRNA，它通過與靶mRNA的3' UTR（非翻譯區）完全互補導致mRNA降解或不完全互補結合抑制mRNA翻譯[25-27]，目前已有研究提出microRNA參與了結腸癌的增殖調控[28]。在本研究中不僅發現TFAM在結腸癌組織和結腸癌細胞中均高表達，還發現其促進結腸癌細胞的增殖，充分說明TFAM和結腸癌的增殖相關。在進一步的研究中或將尋找調控TFAM的microRNA。
從本研究結果初步得出，TFAM是結腸癌細胞增殖的調控信號，上調TFAM可以促進結腸癌細胞的增殖。
