引用本文： 馮穎, 朱駿, 唐發兵. E2F1、ID1和Bax蛋白在膽囊腺癌中的表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(4): 455-459. doi: 10.7507/1007-9424.20150120 復制
膽囊腺癌是膽管系統最常見的惡性腫瘤之一，占膽管癌的80%～90%，名列胃腸道腫瘤的第6位[1]。眾多研究證實，細胞增殖失控在腫瘤的形成過程中發揮重要作用，而細胞增殖受多種因子調控，如轉錄因子1（E2F1）[2]、分化抑制因子（inhibitor of diferentiation 1，ID1）[3-4]、凋亡調控因子Bax[5]、p53基因、c-myc基因等。本研究采用免疫組織化學方法檢測了E2F1、ID1和Bax蛋白在膽囊腺癌、腺上皮內瘤變以及膽囊炎癥組織中的表達，探討其在膽囊腺癌組織中的表達及其臨床意義。
1 資料和方法
1.1 標本來源
收集蘭州大學第一醫院病理科自2000～2013年12年期間經手術及病理學檢查證實的膽囊腺癌標本70例，年齡37～78歲，中位年齡57歲。按國際病理學分級，高、中、低分化者分別為21例、27例和22例。另取同期20例膽囊高級別腺上皮內瘤變、30例膽囊低級別腺上皮內瘤變及20例膽囊炎癥組織標本作為對照。
1.2 主要試劑
一抗E2F1、ID1及Bax購自Santa Cruz公司，羊血清、二抗、鏈霉素卵白素及DAB購自ZSGB-BIO公司。
1.3 檢測指標及方法
取上述石蠟包埋的組織、常規切片，用二甲苯和梯度乙醇各15 min脫蠟，枸櫞酸鹽緩沖液修復抗原，3% H2O2室溫封閉15 min，羊血清(ZSGB-BIO)封閉15 min，分別加E2F1、ID1和Bax一抗，4℃過夜；室溫復溫30 min，山羊抗兔二抗溫室孵育15 min，鏈霉卵白素孵育15 min，DAB顯色，自來水終止反應，蘇木精復染，分化返藍，脫水封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，Santa Cruz公司提供陽性對照片。
1.4 染色結果判斷
以細胞質中有棕黃色顆粒者判為陽性細胞。F2F1和ID1均以細胞質或核膜染色為主，Bax則以細胞質染色為主。每張切片隨機選擇10個視野，在高倍（×400）顯微鏡下觀察染色強度并計數陽性細胞數；然后根據染色強度及陽性細胞所占百分比分別評分。染色強度評分標準：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞計數評分標準：無陽性細胞為0分，陽性細胞所占百分比< 10%為1分，達10%～50%為2分，> 50%為3分。最后將染色強度評分與陽性細胞所占百分比評分之和分為4級[6]：即0分判為陰性(-)；1～2分判為弱陽性(+)；3～4分判為陽性(++)；5～6分判為強陽性(+++)。染色強度與陽性細胞數得分之和> 3分則判為陽性表達。
1.5 統計學方法
采用SPSS 19統計軟件進行統計分析。采用四格表的精確概率法，所有數據應用χ2檢驗；E2F1、ID1和Bax蛋白表達間相關性應用Spearman相關分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 E2F1、ID1和Bax蛋白在不同膽囊病變組織中的表達特征
本研究利用免疫組化方法檢測E2F1、ID1以及Bax蛋白在膽囊腺癌、高級別膽囊腺上皮內瘤變、低級別膽囊腺上皮內瘤變和膽囊炎癥組織中的表達。對其進行細胞定位，結果如圖 1～圖 3所示，陽性信號呈現棕黃色；ID1和E2F1蛋白表達于膽囊腺上皮及癌細胞的細胞核或細胞質，Bax蛋白表達于膽囊腺上皮及癌細胞的細胞質。
圖1
示E2F1蛋白在不同膽囊病變組織中的表達。1A:膽囊腺癌組織; 1B:膽囊高級別腺上皮內瘤變組織; 1C:膽囊低級別腺上皮內瘤變組織; 1D:膽囊炎癥組織??圖 2示ID1蛋白在不同膽囊病變組織中的表達。2A:膽囊腺癌組織; 2B:膽囊高級別腺上皮內瘤變組織; 2C:膽囊低級別腺上皮內瘤變組織; 2D:膽囊炎癥組織??圖 3示Bax蛋白在不同膽囊病變組織中的表達。3A:膽囊腺癌組織; 3B:膽囊高級別腺上皮內瘤變組織; 3C:膽囊低級別腺上皮內瘤變組織; 3D:膽囊炎癥組織
2.2 E2F1、ID1和Bax蛋白在不同膽囊病變組織中表達檢測結果
結果見表 1。由表 1可見，E2F1、ID1和Bax蛋白在膽囊腺癌、高級別腺上皮內瘤變、低級別腺上皮內瘤變和炎癥組織中表達的差異均有統計學意義（P < 0.05）。E2F1蛋白在膽囊腺癌組織中表達陽性率高于高級別腺上皮內瘤變組織、低級別腺上皮瘤變組織及膽囊炎癥組織，其差異均有統計學意義（P < 0.05）；E2F1蛋白在高級別腺上皮內瘤變組織中表達陽性率高于低級別腺上皮內瘤變組織及膽囊炎癥組織，其差異有統計學意義（P < 0.05)。ID1蛋白在膽囊腺癌組織中表達陽性率與高級別腺上皮內瘤變組織比較，差異無統計學意義（P > 0.05）, 但高于低級別腺上皮內瘤變組織及膽囊炎癥組織，其差異有統計學意義（P < 0.05)；ID1蛋白在高級別腺上皮內瘤變表達陽性率高于低級別腺上皮內瘤變組織及膽囊炎癥組織，其差異有統計學意義（P < 0.05)。Bax蛋白在膽囊腺癌組織中的表達陽性率則低于其他3種組織，其差異均有統計學意義（P < 0.05）；Bax蛋白在高級別腺上皮內瘤變組織、低級別腺上皮內瘤變組織及膽囊炎癥組織中的表達陽性率間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05)。
表1
E2F1、ID1和Bax蛋白在膽囊腺癌、腺上皮內瘤變和炎癥增生組織中的表達
2.3 膽囊腺癌組織中E2F1、ID1和Bax蛋白的表達與其臨床病理特征間的關系
結果見表 2。由表 2可見，E2F1和ID1蛋白在Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期組織中的表達陽性率顯著高于Ⅳ~Ⅴ期，E2F1和ID1蛋白的表達與膽囊癌的Nevin分期相關，差異有統計學意義（P < 0.05）。E2F1和ID1蛋白的表達與膽囊腺癌的分化程度無關（P > 0.05）。高分化膽囊腺癌中Bax蛋白表達陽性率顯著高于中、低分化組織，Bax蛋白的表達與膽囊癌的分化程度相關，差異具有統計學意義（P < 0.05）。Bax蛋白在Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期膽囊癌組織中表達陽性率高于Ⅳ~Ⅴ期，但差異無統計學意義（P > 0.05）。E2F1、ID1和Bax蛋白在膽囊腺癌組織中的表達與發病年齡和性別無關（P > 0.05），與膽囊癌的大體類型及腫瘤部位無關（P > 0.05）。
表2
膽囊腺癌組織中E2F1、ID1和Bax蛋白的表達與其臨床病理特征間的關系
2.4 膽囊腺癌組織中E2F1、ID1和Bax蛋白表達的相關性分析結果
70例膽囊腺癌患者E2F1蛋白表達陽性59例，Bax蛋白表達陽性18例，二者的表達呈負相關關系（r=-0.375，P < 0.05）；ID1蛋白表達陽性49例，Bax蛋白表達陽性者18例，二者間無相關性（r=-0.185，P > 0.05）E2F1蛋白表達陽性59例，ID1蛋白表達陽性者49例，二者呈正相關關系（r=7.031，P < 0.05）。
3 討論
膽囊腺癌是膽管系統最常見的惡性腫瘤之一，近年來發病呈上升趨勢，并且起病隱匿，惡性程度高，預后極差[7]。細胞的無限增殖在腫瘤發生及發展過程中發揮重要的作用。
E2F1作為E2Fs轉錄因子家族的一員，調控DNA復制及細胞周期進程相關基因的表達[8]，過表達的E2F1促進細胞從G0 /G1期進入S期，促進細胞增殖及惡性轉化。國內外研究[9-13]表明，E2F1在胃癌、乳腺浸潤性導管癌、膀胱癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤中呈過表達。本研究發現，E2F1蛋白在膽囊腺癌表達陽性率高于膽囊腺上皮內瘤變及膽囊炎癥組織，提示E2F1與膽囊腺癌的發生相關。
分化抑制因子ID1是ID蛋白家族中的一種亞型，是螺旋-環-螺旋轉錄因子家族的成員之一。已有研究證實，ID1與腫瘤血管生成相關[14]，抑制細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖[15-17]，且是淋巴結陰性乳腺癌患者的獨立預后因子[18]。Gupta等[19]發現，在人類三陰（ER、PR及HER2均陰性）乳腺癌亞型中ID1是其肺轉移的調控者。本研究發現，ID1蛋白在膽囊腺癌的表達陽性率高于低級別膽囊腺上皮內瘤變及膽囊炎癥，提示其與膽囊腺癌的發生相關；同時顯示，E2F1和ID1蛋白表達均與膽囊腺癌的臨床分期有關。該結果提示，E2F1和ID1蛋白的表達與膽囊腺癌的浸潤和轉移有關，因此對膽囊腺癌的臨床分期可能有重要的指導意義。
Bax和bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調節細胞凋亡[20]，抑制細胞增殖。本研究結果顯示，Bax蛋白在膽囊炎癥及膽囊腺上皮內瘤變中的表達陽性率高于膽囊腺癌組織，這和張力等[21]的觀察結果一致，推測炎癥組織及上皮內瘤變組織中高表達的Bax使其形成同源二聚體的可能性增加[22-25]，促進細胞凋亡，防止膽囊癌的發生。
本研究還發現，膽囊腺癌組織中，E2F1蛋白表達與Bax蛋白表達呈負相關關系，ID1蛋白表達與Bax蛋白表達無關，E2F1蛋白表達與ID1蛋白表達正相關。提示聯合檢測E2F1、ID1和Bax蛋白的表達可能有助于膽囊腺癌的輔助診斷。
膽囊腺癌是膽管系統最常見的惡性腫瘤之一，占膽管癌的80%～90%，名列胃腸道腫瘤的第6位[1]。眾多研究證實，細胞增殖失控在腫瘤的形成過程中發揮重要作用，而細胞增殖受多種因子調控，如轉錄因子1（E2F1）[2]、分化抑制因子（inhibitor of diferentiation 1，ID1）[3-4]、凋亡調控因子Bax[5]、p53基因、c-myc基因等。本研究采用免疫組織化學方法檢測了E2F1、ID1和Bax蛋白在膽囊腺癌、腺上皮內瘤變以及膽囊炎癥組織中的表達，探討其在膽囊腺癌組織中的表達及其臨床意義。
1 資料和方法
1.1 標本來源
收集蘭州大學第一醫院病理科自2000～2013年12年期間經手術及病理學檢查證實的膽囊腺癌標本70例，年齡37～78歲，中位年齡57歲。按國際病理學分級，高、中、低分化者分別為21例、27例和22例。另取同期20例膽囊高級別腺上皮內瘤變、30例膽囊低級別腺上皮內瘤變及20例膽囊炎癥組織標本作為對照。
1.2 主要試劑
一抗E2F1、ID1及Bax購自Santa Cruz公司，羊血清、二抗、鏈霉素卵白素及DAB購自ZSGB-BIO公司。
1.3 檢測指標及方法
取上述石蠟包埋的組織、常規切片，用二甲苯和梯度乙醇各15 min脫蠟，枸櫞酸鹽緩沖液修復抗原，3% H2O2室溫封閉15 min，羊血清(ZSGB-BIO)封閉15 min，分別加E2F1、ID1和Bax一抗，4℃過夜；室溫復溫30 min，山羊抗兔二抗溫室孵育15 min，鏈霉卵白素孵育15 min，DAB顯色，自來水終止反應，蘇木精復染，分化返藍，脫水封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，Santa Cruz公司提供陽性對照片。
1.4 染色結果判斷
以細胞質中有棕黃色顆粒者判為陽性細胞。F2F1和ID1均以細胞質或核膜染色為主，Bax則以細胞質染色為主。每張切片隨機選擇10個視野，在高倍（×400）顯微鏡下觀察染色強度并計數陽性細胞數；然后根據染色強度及陽性細胞所占百分比分別評分。染色強度評分標準：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞計數評分標準：無陽性細胞為0分，陽性細胞所占百分比< 10%為1分，達10%～50%為2分，> 50%為3分。最后將染色強度評分與陽性細胞所占百分比評分之和分為4級[6]：即0分判為陰性(-)；1～2分判為弱陽性(+)；3～4分判為陽性(++)；5～6分判為強陽性(+++)。染色強度與陽性細胞數得分之和> 3分則判為陽性表達。
1.5 統計學方法
采用SPSS 19統計軟件進行統計分析。采用四格表的精確概率法，所有數據應用χ2檢驗；E2F1、ID1和Bax蛋白表達間相關性應用Spearman相關分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 E2F1、ID1和Bax蛋白在不同膽囊病變組織中的表達特征
本研究利用免疫組化方法檢測E2F1、ID1以及Bax蛋白在膽囊腺癌、高級別膽囊腺上皮內瘤變、低級別膽囊腺上皮內瘤變和膽囊炎癥組織中的表達。對其進行細胞定位，結果如圖 1～圖 3所示，陽性信號呈現棕黃色；ID1和E2F1蛋白表達于膽囊腺上皮及癌細胞的細胞核或細胞質，Bax蛋白表達于膽囊腺上皮及癌細胞的細胞質。
圖1
示E2F1蛋白在不同膽囊病變組織中的表達。1A:膽囊腺癌組織; 1B:膽囊高級別腺上皮內瘤變組織; 1C:膽囊低級別腺上皮內瘤變組織; 1D:膽囊炎癥組織??圖 2示ID1蛋白在不同膽囊病變組織中的表達。2A:膽囊腺癌組織; 2B:膽囊高級別腺上皮內瘤變組織; 2C:膽囊低級別腺上皮內瘤變組織; 2D:膽囊炎癥組織??圖 3示Bax蛋白在不同膽囊病變組織中的表達。3A:膽囊腺癌組織; 3B:膽囊高級別腺上皮內瘤變組織; 3C:膽囊低級別腺上皮內瘤變組織; 3D:膽囊炎癥組織
2.2 E2F1、ID1和Bax蛋白在不同膽囊病變組織中表達檢測結果
結果見表 1。由表 1可見，E2F1、ID1和Bax蛋白在膽囊腺癌、高級別腺上皮內瘤變、低級別腺上皮內瘤變和炎癥組織中表達的差異均有統計學意義（P < 0.05）。E2F1蛋白在膽囊腺癌組織中表達陽性率高于高級別腺上皮內瘤變組織、低級別腺上皮瘤變組織及膽囊炎癥組織，其差異均有統計學意義（P < 0.05）；E2F1蛋白在高級別腺上皮內瘤變組織中表達陽性率高于低級別腺上皮內瘤變組織及膽囊炎癥組織，其差異有統計學意義（P < 0.05)。ID1蛋白在膽囊腺癌組織中表達陽性率與高級別腺上皮內瘤變組織比較，差異無統計學意義（P > 0.05）, 但高于低級別腺上皮內瘤變組織及膽囊炎癥組織，其差異有統計學意義（P < 0.05)；ID1蛋白在高級別腺上皮內瘤變表達陽性率高于低級別腺上皮內瘤變組織及膽囊炎癥組織，其差異有統計學意義（P < 0.05)。Bax蛋白在膽囊腺癌組織中的表達陽性率則低于其他3種組織，其差異均有統計學意義（P < 0.05）；Bax蛋白在高級別腺上皮內瘤變組織、低級別腺上皮內瘤變組織及膽囊炎癥組織中的表達陽性率間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05)。
表1
E2F1、ID1和Bax蛋白在膽囊腺癌、腺上皮內瘤變和炎癥增生組織中的表達
2.3 膽囊腺癌組織中E2F1、ID1和Bax蛋白的表達與其臨床病理特征間的關系
結果見表 2。由表 2可見，E2F1和ID1蛋白在Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期組織中的表達陽性率顯著高于Ⅳ~Ⅴ期，E2F1和ID1蛋白的表達與膽囊癌的Nevin分期相關，差異有統計學意義（P < 0.05）。E2F1和ID1蛋白的表達與膽囊腺癌的分化程度無關（P > 0.05）。高分化膽囊腺癌中Bax蛋白表達陽性率顯著高于中、低分化組織，Bax蛋白的表達與膽囊癌的分化程度相關，差異具有統計學意義（P < 0.05）。Bax蛋白在Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期膽囊癌組織中表達陽性率高于Ⅳ~Ⅴ期，但差異無統計學意義（P > 0.05）。E2F1、ID1和Bax蛋白在膽囊腺癌組織中的表達與發病年齡和性別無關（P > 0.05），與膽囊癌的大體類型及腫瘤部位無關（P > 0.05）。
表2
膽囊腺癌組織中E2F1、ID1和Bax蛋白的表達與其臨床病理特征間的關系
2.4 膽囊腺癌組織中E2F1、ID1和Bax蛋白表達的相關性分析結果
70例膽囊腺癌患者E2F1蛋白表達陽性59例，Bax蛋白表達陽性18例，二者的表達呈負相關關系（r=-0.375，P < 0.05）；ID1蛋白表達陽性49例，Bax蛋白表達陽性者18例，二者間無相關性（r=-0.185，P > 0.05）E2F1蛋白表達陽性59例，ID1蛋白表達陽性者49例，二者呈正相關關系（r=7.031，P < 0.05）。
3 討論
膽囊腺癌是膽管系統最常見的惡性腫瘤之一，近年來發病呈上升趨勢，并且起病隱匿，惡性程度高，預后極差[7]。細胞的無限增殖在腫瘤發生及發展過程中發揮重要的作用。
E2F1作為E2Fs轉錄因子家族的一員，調控DNA復制及細胞周期進程相關基因的表達[8]，過表達的E2F1促進細胞從G0 /G1期進入S期，促進細胞增殖及惡性轉化。國內外研究[9-13]表明，E2F1在胃癌、乳腺浸潤性導管癌、膀胱癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤中呈過表達。本研究發現，E2F1蛋白在膽囊腺癌表達陽性率高于膽囊腺上皮內瘤變及膽囊炎癥組織，提示E2F1與膽囊腺癌的發生相關。
分化抑制因子ID1是ID蛋白家族中的一種亞型，是螺旋-環-螺旋轉錄因子家族的成員之一。已有研究證實，ID1與腫瘤血管生成相關[14]，抑制細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖[15-17]，且是淋巴結陰性乳腺癌患者的獨立預后因子[18]。Gupta等[19]發現，在人類三陰（ER、PR及HER2均陰性）乳腺癌亞型中ID1是其肺轉移的調控者。本研究發現，ID1蛋白在膽囊腺癌的表達陽性率高于低級別膽囊腺上皮內瘤變及膽囊炎癥，提示其與膽囊腺癌的發生相關；同時顯示，E2F1和ID1蛋白表達均與膽囊腺癌的臨床分期有關。該結果提示，E2F1和ID1蛋白的表達與膽囊腺癌的浸潤和轉移有關，因此對膽囊腺癌的臨床分期可能有重要的指導意義。
Bax和bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調節細胞凋亡[20]，抑制細胞增殖。本研究結果顯示，Bax蛋白在膽囊炎癥及膽囊腺上皮內瘤變中的表達陽性率高于膽囊腺癌組織，這和張力等[21]的觀察結果一致，推測炎癥組織及上皮內瘤變組織中高表達的Bax使其形成同源二聚體的可能性增加[22-25]，促進細胞凋亡，防止膽囊癌的發生。
本研究還發現，膽囊腺癌組織中，E2F1蛋白表達與Bax蛋白表達呈負相關關系，ID1蛋白表達與Bax蛋白表達無關，E2F1蛋白表達與ID1蛋白表達正相關。提示聯合檢測E2F1、ID1和Bax蛋白的表達可能有助于膽囊腺癌的輔助診斷。
