引用本文： 文藝, 祁巧, 劉丹青, 黃尚清, 林寧, 石力, 陳濤, 湯禮軍. Roux-en-Y胃旁路術對2型糖尿病大鼠腎臟早期損害的保護作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(4): 404-411. doi: 10.7507/1007-9424.20150109 復制
2型糖尿病（T2DM）是一種常見的慢性代謝性疾病，相較于傳統治療，Roux-en-Y胃旁路術能明顯而持久地改善80%～100% T2DM患者的血糖、胰島素和糖化血紅蛋白，同時也可糾正糖耐量異常和胰島素抵抗[1]。糖尿病腎病是糖尿病主要的微血管并發癥，是引起T2DM患者死亡的主要原因之一。近年來的臨床觀察[2-3]表明，T2DM患者經胃轉流術治療后其受損的腎臟功能有一定改善，但尚缺乏進一步的研究。本實驗擬采用高脂飲食加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素建立大鼠T2DM模型，觀察胃轉流術后對大鼠腎臟組織病理形態學、炎性因子及細胞因子的影響，探討胃轉流術對糖尿病大鼠腎臟保護的可能作用機理。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及飼料
8周齡SPF級SD大鼠40只，雄性，體質量170～190 g，由簡陽達碩動物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（川）2004。實驗動物基礎飼料由簡陽達碩動物科技有限公司提供，高脂飼料由基礎鼠飼料（72%）加煉豬油（15%）、蔗糖（10%）和蛋黃（3%）按比搭配制成高脂高糖飼料。
1.2 主要試劑
鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma公司，檸檬酸緩沖液及穩步型血糖儀購自美國雅培公司。PAS染色試劑盒和Masson染色試劑盒購自南京建成科技有限公司。尿8-羥基脫氧鳥酐（8-OhdG）Elisa試劑盒購自南京建成生物工程研究所。
1.3 糖尿病動物模型復制、分組及處理
雄性SD大鼠40只，按隨機數字表法隨機分為正常對照組（NC組）8只和糖尿病建模動物32只，NC組動物給予基礎飼料，建模動物給予高脂飼料。建模動物喂養4周后，禁食12 h，于左下腹腔一次性注射STZ 35 mg/kg（用0.1 mol/L、pH 4.4的檸檬酸緩沖液在避光和冰浴下配制成濃度為1% STZ溶液，現配現用）。1周后行口服糖耐量試驗（OGTT）試驗（禁食12 h，葡萄糖1.5 g/kg灌胃，測2 h血糖），篩選血糖值大于11.1 mmol /L的大鼠確定為糖尿病大鼠（成模30只，成模率為93.8%）[4]。模型穩定1周后，將成模的30只糖尿病大鼠按隨機數字表法隨機分為3組，即糖尿病模型對照組8只、假手術組8只和Roux-en-Y胃旁路手術組14只。假手術組行胃竇十二指腸離斷原位吻合術，Roux-en-Y胃旁路手術組行胃轉流術：大鼠術前禁食12 h，不限飲水，0.5％戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔內注射麻醉后固定于手術臺，無菌條件下取上腹部正中切口長3 cm切開進腹，閉合胃遠端，距Treitz韌帶10 cm切斷空腸，遠端腸襻行胃空腸吻合，距胃腸吻合口遠端10 cm行空腸側側吻合，完成吻合后用甲硝唑溶液5 mL沖洗腹腔后關腹。手術14只，術后8周存活6只，存活率為42.9%。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 血糖測定
分別于術前及術后8周，大鼠尾尖取血0.1 mL，用雅培Optium Xceed血糖儀檢測各組各時間點大鼠的空腹血糖值
1.4.2 血清總膽固醇（Tch）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（FFA）、尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）測定
分別于術前及術后8周獲取大鼠眶靜脈血1.5 mL，采用全自動生化分析儀測定各組大鼠的Tch、TG、BUN及Cr，用ELISA法測定FFA。
1.4.3 尿微量白蛋白及尿8-OhdG的測定
分別與術前及術后8周，搜集各組大鼠24 h尿液，采用全自動生化分析儀測定各組大鼠24 h尿微量白蛋白，用ELISA法測定尿8-OhdG水平。
1.4.4 腎臟病理組織學觀察及腎重指數、腎小球平均截面積（MGA）和腎小球平均體積（MGV）的測定
于術后8周將大鼠麻醉開腹行腎臟灌注后取下雙側腎臟并稱重，計算腎重指數，腎重指數（mg/g）=雙側腎重/體質量；然后將大鼠左側腎臟沿縱軸切開后分別用10%中性甲醛溶液和Carrnoy固定液固定24 h后，脫水透明，石蠟包埋，切割制備4μm厚的組織切片，分別進行HE染色、Masson染色和PAS染色，于光鏡下觀察各組大鼠腎組織的形態學變化；應用Image-ProPlus圖像分析軟件對病理染色切片（×400）進行圖像分析，每張切片隨機選擇10個正切的腎小球，測定其截面積，取其平均值作為每個標本的MGA，根據公式MGV=1.25×（MGA）3/2計算MGV。
1.4.5 免疫組化染色檢測纖連蛋白(FN)、Ⅳ型膠原（CoⅣ）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶4（NOX4）和Bcl-2蛋白表達
取已制備的各組大鼠腎臟組織石蠟切片，采用PV兩步法檢測，其操作步驟參照試劑盒說明書進行，用PBS代替一抗作為陰性對照，含有以上蛋白抗原的肝臟組織石蠟切片作為陽性對照。兔抗大鼠TGF-β1、FN、CoⅣ、ICAM-1、NOX4及Bcl-2多克隆抗體（購自武漢博士德）按1∶100稀釋，每張切片在Olympus顯微鏡400倍下，用Image-ProPlus圖像采集系統隨機選取10個含腎小球的視野, 用Image-ProPlus圖像分析軟件測量免疫組化染色的積分光密度值（integral optical density，IOD）[5]，計算各組大鼠目標蛋白平均IOD值，IOD值越高則蛋白表達量越高。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 4組大鼠血糖和腎重指數檢測結果
結果見表 1。由表 1可見，與正常對照組相比，糖尿病對照組和假手組的腎重指數明顯升高（P < 0.05）；Roux-en-Y胃旁路手術組的腎重指數與糖尿病對照組和假手組相比有一定程度降低，其差異具有統計學意義（P < 0.05），但與正常對照組相比，其差異無統計學意義（P > 0.05）。與正常對照組相比，術前糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組的血糖均明顯升高（P < 0.05)；術后8周，Roux-en-Y胃旁路手術組的血糖明顯下降，接近正常對照組，而糖尿病對照組和假手術組的血糖則進一步升高，其差異有統計學意義（P < 0.05)。提示胃轉流術具有明顯的降糖作用。
表1
各組大鼠血糖和腎重指數檢測結果（2.2 4組大鼠血清BUN及Cr檢測結果
結果見表 2。由表 2可見，術前各組的血清BUN和Cr水平接近，其差異均無統計學意義（P > 0.05）。與正常對照組相比，術后4周及8周糖尿病對照組和假手組的血清BUN和Cr均有不同程度升高，腎功能逐漸惡化，其差異具有統計學意義（P < 0.05）；Roux-en-Y胃旁路手術組的血清BUN及Cr在術后4周和8周的變化不大，接近術前水平，明顯低于糖尿病對照組和假手組，其差異具有統計學意義（P < 0.05）。
表2
各組大鼠血清BUN及Cr檢測結果（2.3 4組大鼠血清TC、TG及FFA檢測結果
結果見表 3。由表 3可見，與正常對照組相比，糖尿病模型組血清TC、TG、FFA均升高明顯，差異具有統計學意義（P < 0.001）；術后8周，與糖尿病對照組及假手組相比，Roux-en-Y胃旁路手術組血清TC、TG及FFA均有不同程度降低，差異具有統計學意義（P < 0.05）。提示Roux-en-Y胃旁路手術能在一定程度上改善糖尿病大鼠的血脂水平。
表3
各組大鼠血清TC、TG及FFA檢測結果（2.4 4組大鼠的MGA及MGV檢測結果
結果見表 4。如表 4所示，術后8周，與正常對照組相比，糖尿病對照組及假手術組的MGA和MGV均明顯增大，其差異具有統計學意義（P < 0.05）；與糖尿病對照組及假手術組相比，Roux-en-Y胃旁路手術組的MGA及MGV明顯減小，其差異具有統計學意義（P < 0.05），并接近正常對照組。
表4
各組大鼠的MGA和MGV檢測結果（2.5 4組大鼠24 h尿微量白蛋白及尿8-OhdG測定結果
結果見表 5。如表 5所示，術前，與正常對照組相比，糖尿病對照組24 h尿微量白蛋白輕度升高，差異具有統計學意義（P < 0.05），尿8-OHdG升高不明顯，差異無統計學意義（P > 0.05）；術后8周，Roux-en-Y胃旁路手術組較糖尿病對照組和假手術組24 h尿微量白蛋白和尿8-OHdG均明顯降低，差異具有統計學意義（P < 0.05）。
表5
各組大鼠24 h尿微量白蛋白及尿8-OHdG檢測結果比較（2.6 4組大鼠腎臟組織病理形態學的改變
腎臟組織HE染色結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病對照組的腎小球體積明顯增大，系膜區增寬，系膜細胞增生，腎小囊腔受壓縮小，而Roux-en-Y胃旁路手術組較糖尿病對照組腎小球體積明顯減小，系膜增生有一定改善（圖 1A～圖 1D）。腎臟組織PAS染色結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病對照組的腎小球體積增大，系膜區基質明顯增多，系膜區擴大，腎小球毛細血管袢受壓，基底膜增厚，而Roux-en-Y胃旁路手術組的上述改變較糖尿病對照組有明顯的改善（圖 2A～圖 2D）。腎臟組織Masson染色藍染區主要為膠原成分，通過觀察可見正常對照組大鼠的腎小球結構清晰，僅在腎小球基底膜和系膜基質可見少許藍染的膠原纖維；糖尿病對照組大鼠在腎小球中可見藍染的膠原纖維區域明顯增大，基底膜增厚，系膜區膠原沉積；而Roux-en-Y胃旁路手術組的腎小球膠原沉積明顯減少（圖 3A～圖 3D）。
圖1
示胃轉流術對糖尿病大鼠腎臟組織病理學變化的影響(HE×400)。1A:正常組; 1B:糖尿病對照組, 見腎小球體積增大, 腎小囊腔受壓縮小; 1C:假手術組; 1D:Roux-en-Y胃旁路手術組, 見腎小球體積明顯減小??圖 2示胃轉流術對糖尿病大鼠腎臟組織病理學變化的影響(PAS×400)。2A:正常組; 2B:糖尿病對照組, 見腎小球體積增大, 腎小球毛細血管袢受壓, 基底膜增厚; 2C:假手術組; 2D:Roux-en-Y胃旁路手術組, 見腎小球體積明顯減小??圖 3示胃轉流術對糖尿病大鼠腎臟組織病理學變化的影響(Masson×400)。3A:正常組; 3B:糖尿病對照組, 見腎小球中可見藍染的膠原纖維區域明顯增大, 系膜區膠原沉積; 3C:假手術組; 3D:Roux-en-Y胃旁路手術組, 見腎小球膠原沉積明顯減少??圖 4示各組大鼠腎臟組織的FN(4A~4D)及CoⅣ(4E~4H)的表達(PV×400)。4A及4E:正常對照組; 4B及4F:糖尿病對照組; 4C及4G:假手術組; 4D及4H:Roux-en-Y胃旁路手術組
2.7 4組大鼠腎臟皮質纖連蛋白（FN）、Ⅳ型膠原（CoⅣ）的檢測結果
圖 4A～4D示4組大鼠腎小球及腎小管間質FN的表達，術后8周時糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組腎小球及腎小管間質的FN表達均明顯高于正常對照組（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手術組FN的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯降低（P < 0.05）；圖 4E～4H示4組大鼠腎小球的CoⅣ的表達，術后8周時糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組腎小球CoⅣ的表達均明顯高于正常對照組（P < 0.05），Roux-en-Y胃旁路手術組CoⅣ的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯降低（P < 0.05）。具體見表 6。
表6
各組大鼠腎臟皮質FN、CoⅣ、TGF-β1、NOX4、Bcl-2和ICAM-1表達檢測結果（IOD值，2.8 4組大鼠腎臟皮質TGF-β1、NOX4、Bcl-2及ICAM-1表達檢測結果
圖 5A~5D示4組大鼠腎臟皮質TGF-β1的表達，術后8周時糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組腎小球及腎小管中TGF-β1的表達均明顯高于正常對照組（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手術組TGF-β1的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯降低（P < 0.05）；圖 5E～5H示4組大鼠腎臟皮質NOX4的表達，術后8周時糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組腎小球及腎小管NOX4的表達均明顯高于正常對照組（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手術組NOX4的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯降低（P < 0.05），見表 6。圖 6A～6D示4組大鼠腎臟皮質Bcl-2的表達，術后8周時糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組腎小管Bcl-2的表達均明顯低于正常對照組（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手術組Bcl-2的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯增高（P < 0.05）；圖 6E～6H示4組大鼠腎臟皮質ICAM-1的表達，術后8周時糖尿病對照組和假手術組腎小球及腎小管ICAM-1的表達均明顯高于正常對照組（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手術組ICAM-1的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯降低（P < 0.05），見表 6。
圖5
示各組大鼠腎臟組織TGF-β1(5A~5D)及NOX4(5E~5H)的表達(PV×400)。5A及5E:正常對照組; 5B及5F:糖尿病對照組; 5C及5G:假手術組; 5D及5H:Roux-en-Y胃旁路手術組??圖 6示各組大鼠腎臟組織Bcl-2(6A~6D)及ICAM-1(6E~6H)的表達(PV×100)。6A及6E:正常對照組; 6B及6F:糖尿病對照組; 6C及6G:假手術組; 6D及6H:Roux-en-Y胃旁路手術組
3 討論
糖尿病腎病是糖尿病主要的微血管并發癥之一，糖尿病患者中糖尿病腎病的發病率為20%～40%。在我國，隨著糖尿病患者人數的增加及壽命的延長，糖尿病腎病的發病率呈逐年攀升的趨勢。T2DM腎臟呈緩慢進行性損害，在出現臨床癥狀前，腎臟即已存在腎小球內高灌注和高濾過[6]，腎小球毛細血管袢基底膜增厚和系膜基質增多、腎小球硬化[7]等。本研究采用高脂飲食加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素的方法建立T2DM大鼠模型，病理學觀察結果表明，糖尿病模型動物出現腎小球系膜細胞和系膜基質輕至中度增生，腎小球毛細血管袢受壓，基底膜增厚，與糖尿病腎病早期病變基本一致。
近年一些回顧性研究發現，代謝綜合征以及肥胖型T2DM患者經胃旁路術治療后其尿微量白蛋白和尿白蛋白/肌酐比值顯著降低[2-3]，對已存在腎功能損害及慢性腎功能衰竭的患者實施胃旁路術后，其尿蛋白、血肌酐及腎臟病理改變都較術前有所降低和改善[8-9]。本實驗也發現，行胃轉流手術后糖尿病大鼠血BUN、Cr及24 h尿微量白蛋白都明顯降低。因其具體機理目前尚不十分清楚，因此本研究擬初步探討胃旁路術對腎臟保護的可能作用機理。
3.1 胃轉流術對T2DM大鼠腎臟纖維化的影響
腎小球系膜基質的過度沉積及基底膜增厚是糖尿病腎病超微結構改變的主要標志之一。目前的研究[10]已經證實，TGF-β信號轉導通路的異常激活是糖尿病腎臟纖維化的主要機理。TGF-β是一類調節細胞生長和分化的TGF-β超家族，其主要作用包括調節細胞增殖和分化、介導腎小管上皮細胞向間充質細胞轉變分化、趨化和活化炎性細胞、促進細胞外基質的沉積、抑制免疫反應等。在腎臟以TGF-β1的表達為主, 主要在腎小球及腎小管上皮細胞表達，本研究也同樣證實了這一點。TGF-β1可以通過自分泌和旁分泌的方式直接促使腎臟系膜細胞肥大，在細胞增殖及纖維化中發揮重要作用，是促進基質沉積和組織纖維化的關鍵細胞因子之一[11]。Petersen等[12]的研究發現，在給予TGF-β1Ⅰ型和Ⅱ型受體激酶抑制劑后能明顯減輕腎臟系膜區增生及纖維化程度。TGF-β1的過度表達在糖尿病腎病的發展過程中是一個起重要作用的因素，TGF-β1的表達量是判斷腎臟早期損害的敏感指標之一[13]。因此本研究檢測TGF-β1在腎臟的表達以評估各組大鼠腎臟損害的進展情況。本研究術后8周，糖尿病大鼠腎臟皮質腎小球及腎小管可見TGF-β1大量表達，腎小球體積增大，PAS和Masson染色可見系膜增生、基底膜增厚，FN及CoⅣ在腎小球及腎小管間質大量沉積。TGF-β1的這種擴大化效應，可能是不斷促進腎臟組織纖維化進程，加速糖尿病腎病發展的重要原因之一。然而，胃轉流手術后大鼠TGF-β1的表達明顯降低，細胞外基質的沉積明顯減少，系膜細胞增生得到明顯抑制，有效緩解了糖尿病早期腎臟損害的繼續發展。推測手術可能通過降低腎臟TGF-β1表達從而實現對腎臟的保護作用，但手術與TGF-β1之間的直接作用關系尚不明確，仍需進一步研究。
3.2 胃轉流術對T2DM大鼠腎臟氧化應激的影響
氧化應急在糖尿病腎病的發生發展中同樣起著重要作用，氧化應急和炎性反應在糖尿病的發展中密切聯系且相互影響，共同形成一惡性循環。糖尿病腎病時氧化應急水平的升高主要是活性氧簇（ROS）的產生增多，在ROS中，超氧陰離子（O-）是最主要的組分，NADPH氧化酶是產生O-的主要調控酶之一[14]，糖尿病氧化應激水平的升高與NADPH氧化酶的活化有關。Gorin等[15]的研究顯示，STZ誘導的糖尿病大鼠腎病模型中，腎臟NADPH氧化酶，尤其是NADPH氧化酶4是加重腎臟氧化應激損傷的主要因素。NADPH氧化酶4主要由腎小球系膜細胞和內皮細胞產生[16-17]，在正常狀態下處于低表達狀態。本研究也證實NADPH氧化酶4能在腎小球系膜區表達，并糖尿病大鼠腎小球系膜區NADPH氧化酶4的表達明顯高于正常大鼠，而胃轉流手術后大鼠腎小球系膜區NADPH氧化酶4的表達明顯降低，推測其可能和促炎細胞因子釋放減少、超濾正常化及血糖血脂的改善有關。此外，Etoh等[17]發現，尿8-OHdG的降低與NADPH氧化酶4表達水平降低及表達范圍的減小平行，故NADPH氧化酶4表達的降低可能是尿8-OHdG降低的一個重要原因。術后腎臟功能的改善可能與氧化應激狀態的下調有關，從而改善腎臟相關的血管并發癥。
3.3 胃轉流術對T2DM大鼠腎臟細胞凋亡和炎性細胞浸潤的影響
細胞凋亡在糖尿病腎病的發展過程中也起著重要作用。糖尿病狀態下糖脂代謝的紊亂使細胞凋亡增加是發生糖尿病腎病的重要原因之一，細胞凋亡密切參與了糖尿病腎病的發病[18]。細胞凋亡的發生主要是由細胞內凋亡相關的分子介導，Bcl-2是目前公認的抗凋亡基因，是迄今研究最深入和廣泛的凋亡調控基因之一，它是一類膜整合蛋白，通過廣泛抑制各種刺激劑誘導的細胞凋亡, 延長細胞活力而發揮作用[19]。Ortiz等[20]發現，糖尿病大鼠腎小管上皮細胞抗凋亡基因Bcl-2表達明顯降低，細胞凋亡數目增加，認為糖尿病狀態下糖脂的代謝異常可能改變了凋亡基因的表達，從而使細胞凋亡增加，引起腎臟功能損害。本實驗也發現，Bcl-2在正常大鼠腎小管上皮細胞大量表達，而糖尿病大鼠腎小管上皮細胞Bcl-2的表達明顯減少；胃轉流手術能顯著改善糖尿病大鼠的血糖和血脂，術后8周手術組大鼠腎小管上皮細胞Bcl-2的表達明顯高于糖尿病大鼠，推測手術對腎臟功能的保護作用可能與術后上調Bcl-2的表達有關。其次，手術后諸多胃腸道激素的改變是否對Bcl-2有直接作用尚需實驗進一步證實。
單核/巨噬細胞在腎小球和腎間質的浸潤也是糖尿病腎病的特征性表現之一。黏附分子（adhesion molecules，AMs）是一類調節細胞之間和細胞與細胞外基質間相互黏附結合的一類糖蛋白，在糖尿病腎病的發生發展中起重要作用。ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族的重要成員。有研究[21]證實，ICAM-1可導介單核細胞/巨噬細胞和淋巴細胞黏附，致炎性細胞浸潤到腎臟組織，產生各種炎性因子和細胞因子，參與了糖尿病腎病的病程進展。Sugimoto等[22]的研究發現，在糖尿病動物模型中拮抗ICAM-1表達的同時，腎實質內巨噬細胞的浸潤也相應減少，表明在糖尿病腎病的發展過程中ICAM-1是炎性細胞浸潤的關鍵分子。本實驗結果顯示，糖尿病大鼠腎臟ICAM-1的表達明顯高于正常對照組大鼠，廣泛表達于腎小球及腎小管上皮細胞；術后8周，Roux-en-Y胃旁路手術組大鼠ICAM-1的表達則明顯降低，腎臟功能得到改善。手術后ICAM-1的降低可能與術后腎臟微炎性反應狀態、氧化應激、血糖血脂等的改善有關，但本實驗并未檢測腎臟炎性細胞的浸潤情況，這也是本實驗一個不足的地方。
綜上所述，胃旁路術后能改善糖尿病大鼠的腎臟功能和病理損害，對腎臟具有保護作用, 其作用機理是多方面的，可能通過降低TGF-β1、NADPH氧化酶4、Bcl-2、ICAM-1等的表達，從而改善糖尿病狀態下腎臟的微炎性反應狀態、氧化應激等，預防和延緩糖尿病腎病的發生和發展。
2型糖尿病（T2DM）是一種常見的慢性代謝性疾病，相較于傳統治療，Roux-en-Y胃旁路術能明顯而持久地改善80%～100% T2DM患者的血糖、胰島素和糖化血紅蛋白，同時也可糾正糖耐量異常和胰島素抵抗[1]。糖尿病腎病是糖尿病主要的微血管并發癥，是引起T2DM患者死亡的主要原因之一。近年來的臨床觀察[2-3]表明，T2DM患者經胃轉流術治療后其受損的腎臟功能有一定改善，但尚缺乏進一步的研究。本實驗擬采用高脂飲食加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素建立大鼠T2DM模型，觀察胃轉流術后對大鼠腎臟組織病理形態學、炎性因子及細胞因子的影響，探討胃轉流術對糖尿病大鼠腎臟保護的可能作用機理。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及飼料
8周齡SPF級SD大鼠40只，雄性，體質量170～190 g，由簡陽達碩動物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（川）2004。實驗動物基礎飼料由簡陽達碩動物科技有限公司提供，高脂飼料由基礎鼠飼料（72%）加煉豬油（15%）、蔗糖（10%）和蛋黃（3%）按比搭配制成高脂高糖飼料。
1.2 主要試劑
鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma公司，檸檬酸緩沖液及穩步型血糖儀購自美國雅培公司。PAS染色試劑盒和Masson染色試劑盒購自南京建成科技有限公司。尿8-羥基脫氧鳥酐（8-OhdG）Elisa試劑盒購自南京建成生物工程研究所。
1.3 糖尿病動物模型復制、分組及處理
雄性SD大鼠40只，按隨機數字表法隨機分為正常對照組（NC組）8只和糖尿病建模動物32只，NC組動物給予基礎飼料，建模動物給予高脂飼料。建模動物喂養4周后，禁食12 h，于左下腹腔一次性注射STZ 35 mg/kg（用0.1 mol/L、pH 4.4的檸檬酸緩沖液在避光和冰浴下配制成濃度為1% STZ溶液，現配現用）。1周后行口服糖耐量試驗（OGTT）試驗（禁食12 h，葡萄糖1.5 g/kg灌胃，測2 h血糖），篩選血糖值大于11.1 mmol /L的大鼠確定為糖尿病大鼠（成模30只，成模率為93.8%）[4]。模型穩定1周后，將成模的30只糖尿病大鼠按隨機數字表法隨機分為3組，即糖尿病模型對照組8只、假手術組8只和Roux-en-Y胃旁路手術組14只。假手術組行胃竇十二指腸離斷原位吻合術，Roux-en-Y胃旁路手術組行胃轉流術：大鼠術前禁食12 h，不限飲水，0.5％戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔內注射麻醉后固定于手術臺，無菌條件下取上腹部正中切口長3 cm切開進腹，閉合胃遠端，距Treitz韌帶10 cm切斷空腸，遠端腸襻行胃空腸吻合，距胃腸吻合口遠端10 cm行空腸側側吻合，完成吻合后用甲硝唑溶液5 mL沖洗腹腔后關腹。手術14只，術后8周存活6只，存活率為42.9%。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 血糖測定
分別于術前及術后8周，大鼠尾尖取血0.1 mL，用雅培Optium Xceed血糖儀檢測各組各時間點大鼠的空腹血糖值
1.4.2 血清總膽固醇（Tch）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（FFA）、尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）測定
分別于術前及術后8周獲取大鼠眶靜脈血1.5 mL，采用全自動生化分析儀測定各組大鼠的Tch、TG、BUN及Cr，用ELISA法測定FFA。
1.4.3 尿微量白蛋白及尿8-OhdG的測定
分別與術前及術后8周，搜集各組大鼠24 h尿液，采用全自動生化分析儀測定各組大鼠24 h尿微量白蛋白，用ELISA法測定尿8-OhdG水平。
1.4.4 腎臟病理組織學觀察及腎重指數、腎小球平均截面積（MGA）和腎小球平均體積（MGV）的測定
于術后8周將大鼠麻醉開腹行腎臟灌注后取下雙側腎臟并稱重，計算腎重指數，腎重指數（mg/g）=雙側腎重/體質量；然后將大鼠左側腎臟沿縱軸切開后分別用10%中性甲醛溶液和Carrnoy固定液固定24 h后，脫水透明，石蠟包埋，切割制備4μm厚的組織切片，分別進行HE染色、Masson染色和PAS染色，于光鏡下觀察各組大鼠腎組織的形態學變化；應用Image-ProPlus圖像分析軟件對病理染色切片（×400）進行圖像分析，每張切片隨機選擇10個正切的腎小球，測定其截面積，取其平均值作為每個標本的MGA，根據公式MGV=1.25×（MGA）3/2計算MGV。
1.4.5 免疫組化染色檢測纖連蛋白(FN)、Ⅳ型膠原（CoⅣ）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶4（NOX4）和Bcl-2蛋白表達
取已制備的各組大鼠腎臟組織石蠟切片，采用PV兩步法檢測，其操作步驟參照試劑盒說明書進行，用PBS代替一抗作為陰性對照，含有以上蛋白抗原的肝臟組織石蠟切片作為陽性對照。兔抗大鼠TGF-β1、FN、CoⅣ、ICAM-1、NOX4及Bcl-2多克隆抗體（購自武漢博士德）按1∶100稀釋，每張切片在Olympus顯微鏡400倍下，用Image-ProPlus圖像采集系統隨機選取10個含腎小球的視野, 用Image-ProPlus圖像分析軟件測量免疫組化染色的積分光密度值（integral optical density，IOD）[5]，計算各組大鼠目標蛋白平均IOD值，IOD值越高則蛋白表達量越高。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 4組大鼠血糖和腎重指數檢測結果
結果見表 1。由表 1可見，與正常對照組相比，糖尿病對照組和假手組的腎重指數明顯升高（P < 0.05）；Roux-en-Y胃旁路手術組的腎重指數與糖尿病對照組和假手組相比有一定程度降低，其差異具有統計學意義（P < 0.05），但與正常對照組相比，其差異無統計學意義（P > 0.05）。與正常對照組相比，術前糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組的血糖均明顯升高（P < 0.05)；術后8周，Roux-en-Y胃旁路手術組的血糖明顯下降，接近正常對照組，而糖尿病對照組和假手術組的血糖則進一步升高，其差異有統計學意義（P < 0.05)。提示胃轉流術具有明顯的降糖作用。
表1
各組大鼠血糖和腎重指數檢測結果（2.2 4組大鼠血清BUN及Cr檢測結果
結果見表 2。由表 2可見，術前各組的血清BUN和Cr水平接近，其差異均無統計學意義（P > 0.05）。與正常對照組相比，術后4周及8周糖尿病對照組和假手組的血清BUN和Cr均有不同程度升高，腎功能逐漸惡化，其差異具有統計學意義（P < 0.05）；Roux-en-Y胃旁路手術組的血清BUN及Cr在術后4周和8周的變化不大，接近術前水平，明顯低于糖尿病對照組和假手組，其差異具有統計學意義（P < 0.05）。
表2
各組大鼠血清BUN及Cr檢測結果（2.3 4組大鼠血清TC、TG及FFA檢測結果
結果見表 3。由表 3可見，與正常對照組相比，糖尿病模型組血清TC、TG、FFA均升高明顯，差異具有統計學意義（P < 0.001）；術后8周，與糖尿病對照組及假手組相比，Roux-en-Y胃旁路手術組血清TC、TG及FFA均有不同程度降低，差異具有統計學意義（P < 0.05）。提示Roux-en-Y胃旁路手術能在一定程度上改善糖尿病大鼠的血脂水平。
表3
各組大鼠血清TC、TG及FFA檢測結果（2.4 4組大鼠的MGA及MGV檢測結果
結果見表 4。如表 4所示，術后8周，與正常對照組相比，糖尿病對照組及假手術組的MGA和MGV均明顯增大，其差異具有統計學意義（P < 0.05）；與糖尿病對照組及假手術組相比，Roux-en-Y胃旁路手術組的MGA及MGV明顯減小，其差異具有統計學意義（P < 0.05），并接近正常對照組。
表4
各組大鼠的MGA和MGV檢測結果（2.5 4組大鼠24 h尿微量白蛋白及尿8-OhdG測定結果
結果見表 5。如表 5所示，術前，與正常對照組相比，糖尿病對照組24 h尿微量白蛋白輕度升高，差異具有統計學意義（P < 0.05），尿8-OHdG升高不明顯，差異無統計學意義（P > 0.05）；術后8周，Roux-en-Y胃旁路手術組較糖尿病對照組和假手術組24 h尿微量白蛋白和尿8-OHdG均明顯降低，差異具有統計學意義（P < 0.05）。
表5
各組大鼠24 h尿微量白蛋白及尿8-OHdG檢測結果比較（2.6 4組大鼠腎臟組織病理形態學的改變
腎臟組織HE染色結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病對照組的腎小球體積明顯增大，系膜區增寬，系膜細胞增生，腎小囊腔受壓縮小，而Roux-en-Y胃旁路手術組較糖尿病對照組腎小球體積明顯減小，系膜增生有一定改善（圖 1A～圖 1D）。腎臟組織PAS染色結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病對照組的腎小球體積增大，系膜區基質明顯增多，系膜區擴大，腎小球毛細血管袢受壓，基底膜增厚，而Roux-en-Y胃旁路手術組的上述改變較糖尿病對照組有明顯的改善（圖 2A～圖 2D）。腎臟組織Masson染色藍染區主要為膠原成分，通過觀察可見正常對照組大鼠的腎小球結構清晰，僅在腎小球基底膜和系膜基質可見少許藍染的膠原纖維；糖尿病對照組大鼠在腎小球中可見藍染的膠原纖維區域明顯增大，基底膜增厚，系膜區膠原沉積；而Roux-en-Y胃旁路手術組的腎小球膠原沉積明顯減少（圖 3A～圖 3D）。
圖1
示胃轉流術對糖尿病大鼠腎臟組織病理學變化的影響(HE×400)。1A:正常組; 1B:糖尿病對照組, 見腎小球體積增大, 腎小囊腔受壓縮小; 1C:假手術組; 1D:Roux-en-Y胃旁路手術組, 見腎小球體積明顯減小??圖 2示胃轉流術對糖尿病大鼠腎臟組織病理學變化的影響(PAS×400)。2A:正常組; 2B:糖尿病對照組, 見腎小球體積增大, 腎小球毛細血管袢受壓, 基底膜增厚; 2C:假手術組; 2D:Roux-en-Y胃旁路手術組, 見腎小球體積明顯減小??圖 3示胃轉流術對糖尿病大鼠腎臟組織病理學變化的影響(Masson×400)。3A:正常組; 3B:糖尿病對照組, 見腎小球中可見藍染的膠原纖維區域明顯增大, 系膜區膠原沉積; 3C:假手術組; 3D:Roux-en-Y胃旁路手術組, 見腎小球膠原沉積明顯減少??圖 4示各組大鼠腎臟組織的FN(4A~4D)及CoⅣ(4E~4H)的表達(PV×400)。4A及4E:正常對照組; 4B及4F:糖尿病對照組; 4C及4G:假手術組; 4D及4H:Roux-en-Y胃旁路手術組
2.7 4組大鼠腎臟皮質纖連蛋白（FN）、Ⅳ型膠原（CoⅣ）的檢測結果
圖 4A～4D示4組大鼠腎小球及腎小管間質FN的表達，術后8周時糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組腎小球及腎小管間質的FN表達均明顯高于正常對照組（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手術組FN的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯降低（P < 0.05）；圖 4E～4H示4組大鼠腎小球的CoⅣ的表達，術后8周時糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組腎小球CoⅣ的表達均明顯高于正常對照組（P < 0.05），Roux-en-Y胃旁路手術組CoⅣ的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯降低（P < 0.05）。具體見表 6。
表6
各組大鼠腎臟皮質FN、CoⅣ、TGF-β1、NOX4、Bcl-2和ICAM-1表達檢測結果（IOD值，2.8 4組大鼠腎臟皮質TGF-β1、NOX4、Bcl-2及ICAM-1表達檢測結果
圖 5A~5D示4組大鼠腎臟皮質TGF-β1的表達，術后8周時糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組腎小球及腎小管中TGF-β1的表達均明顯高于正常對照組（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手術組TGF-β1的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯降低（P < 0.05）；圖 5E～5H示4組大鼠腎臟皮質NOX4的表達，術后8周時糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組腎小球及腎小管NOX4的表達均明顯高于正常對照組（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手術組NOX4的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯降低（P < 0.05），見表 6。圖 6A～6D示4組大鼠腎臟皮質Bcl-2的表達，術后8周時糖尿病對照組、假手術組和Roux-en-Y胃旁路手術組腎小管Bcl-2的表達均明顯低于正常對照組（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手術組Bcl-2的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯增高（P < 0.05）；圖 6E～6H示4組大鼠腎臟皮質ICAM-1的表達，術后8周時糖尿病對照組和假手術組腎小球及腎小管ICAM-1的表達均明顯高于正常對照組（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手術組ICAM-1的表達則較糖尿病對照組和假手術組明顯降低（P < 0.05），見表 6。
圖5
示各組大鼠腎臟組織TGF-β1(5A~5D)及NOX4(5E~5H)的表達(PV×400)。5A及5E:正常對照組; 5B及5F:糖尿病對照組; 5C及5G:假手術組; 5D及5H:Roux-en-Y胃旁路手術組??圖 6示各組大鼠腎臟組織Bcl-2(6A~6D)及ICAM-1(6E~6H)的表達(PV×100)。6A及6E:正常對照組; 6B及6F:糖尿病對照組; 6C及6G:假手術組; 6D及6H:Roux-en-Y胃旁路手術組
3 討論
糖尿病腎病是糖尿病主要的微血管并發癥之一，糖尿病患者中糖尿病腎病的發病率為20%～40%。在我國，隨著糖尿病患者人數的增加及壽命的延長，糖尿病腎病的發病率呈逐年攀升的趨勢。T2DM腎臟呈緩慢進行性損害，在出現臨床癥狀前，腎臟即已存在腎小球內高灌注和高濾過[6]，腎小球毛細血管袢基底膜增厚和系膜基質增多、腎小球硬化[7]等。本研究采用高脂飲食加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素的方法建立T2DM大鼠模型，病理學觀察結果表明，糖尿病模型動物出現腎小球系膜細胞和系膜基質輕至中度增生，腎小球毛細血管袢受壓，基底膜增厚，與糖尿病腎病早期病變基本一致。
近年一些回顧性研究發現，代謝綜合征以及肥胖型T2DM患者經胃旁路術治療后其尿微量白蛋白和尿白蛋白/肌酐比值顯著降低[2-3]，對已存在腎功能損害及慢性腎功能衰竭的患者實施胃旁路術后，其尿蛋白、血肌酐及腎臟病理改變都較術前有所降低和改善[8-9]。本實驗也發現，行胃轉流手術后糖尿病大鼠血BUN、Cr及24 h尿微量白蛋白都明顯降低。因其具體機理目前尚不十分清楚，因此本研究擬初步探討胃旁路術對腎臟保護的可能作用機理。
3.1 胃轉流術對T2DM大鼠腎臟纖維化的影響
腎小球系膜基質的過度沉積及基底膜增厚是糖尿病腎病超微結構改變的主要標志之一。目前的研究[10]已經證實，TGF-β信號轉導通路的異常激活是糖尿病腎臟纖維化的主要機理。TGF-β是一類調節細胞生長和分化的TGF-β超家族，其主要作用包括調節細胞增殖和分化、介導腎小管上皮細胞向間充質細胞轉變分化、趨化和活化炎性細胞、促進細胞外基質的沉積、抑制免疫反應等。在腎臟以TGF-β1的表達為主, 主要在腎小球及腎小管上皮細胞表達，本研究也同樣證實了這一點。TGF-β1可以通過自分泌和旁分泌的方式直接促使腎臟系膜細胞肥大，在細胞增殖及纖維化中發揮重要作用，是促進基質沉積和組織纖維化的關鍵細胞因子之一[11]。Petersen等[12]的研究發現，在給予TGF-β1Ⅰ型和Ⅱ型受體激酶抑制劑后能明顯減輕腎臟系膜區增生及纖維化程度。TGF-β1的過度表達在糖尿病腎病的發展過程中是一個起重要作用的因素，TGF-β1的表達量是判斷腎臟早期損害的敏感指標之一[13]。因此本研究檢測TGF-β1在腎臟的表達以評估各組大鼠腎臟損害的進展情況。本研究術后8周，糖尿病大鼠腎臟皮質腎小球及腎小管可見TGF-β1大量表達，腎小球體積增大，PAS和Masson染色可見系膜增生、基底膜增厚，FN及CoⅣ在腎小球及腎小管間質大量沉積。TGF-β1的這種擴大化效應，可能是不斷促進腎臟組織纖維化進程，加速糖尿病腎病發展的重要原因之一。然而，胃轉流手術后大鼠TGF-β1的表達明顯降低，細胞外基質的沉積明顯減少，系膜細胞增生得到明顯抑制，有效緩解了糖尿病早期腎臟損害的繼續發展。推測手術可能通過降低腎臟TGF-β1表達從而實現對腎臟的保護作用，但手術與TGF-β1之間的直接作用關系尚不明確，仍需進一步研究。
3.2 胃轉流術對T2DM大鼠腎臟氧化應激的影響
氧化應急在糖尿病腎病的發生發展中同樣起著重要作用，氧化應急和炎性反應在糖尿病的發展中密切聯系且相互影響，共同形成一惡性循環。糖尿病腎病時氧化應急水平的升高主要是活性氧簇（ROS）的產生增多，在ROS中，超氧陰離子（O-）是最主要的組分，NADPH氧化酶是產生O-的主要調控酶之一[14]，糖尿病氧化應激水平的升高與NADPH氧化酶的活化有關。Gorin等[15]的研究顯示，STZ誘導的糖尿病大鼠腎病模型中，腎臟NADPH氧化酶，尤其是NADPH氧化酶4是加重腎臟氧化應激損傷的主要因素。NADPH氧化酶4主要由腎小球系膜細胞和內皮細胞產生[16-17]，在正常狀態下處于低表達狀態。本研究也證實NADPH氧化酶4能在腎小球系膜區表達，并糖尿病大鼠腎小球系膜區NADPH氧化酶4的表達明顯高于正常大鼠，而胃轉流手術后大鼠腎小球系膜區NADPH氧化酶4的表達明顯降低，推測其可能和促炎細胞因子釋放減少、超濾正常化及血糖血脂的改善有關。此外，Etoh等[17]發現，尿8-OHdG的降低與NADPH氧化酶4表達水平降低及表達范圍的減小平行，故NADPH氧化酶4表達的降低可能是尿8-OHdG降低的一個重要原因。術后腎臟功能的改善可能與氧化應激狀態的下調有關，從而改善腎臟相關的血管并發癥。
3.3 胃轉流術對T2DM大鼠腎臟細胞凋亡和炎性細胞浸潤的影響
細胞凋亡在糖尿病腎病的發展過程中也起著重要作用。糖尿病狀態下糖脂代謝的紊亂使細胞凋亡增加是發生糖尿病腎病的重要原因之一，細胞凋亡密切參與了糖尿病腎病的發病[18]。細胞凋亡的發生主要是由細胞內凋亡相關的分子介導，Bcl-2是目前公認的抗凋亡基因，是迄今研究最深入和廣泛的凋亡調控基因之一，它是一類膜整合蛋白，通過廣泛抑制各種刺激劑誘導的細胞凋亡, 延長細胞活力而發揮作用[19]。Ortiz等[20]發現，糖尿病大鼠腎小管上皮細胞抗凋亡基因Bcl-2表達明顯降低，細胞凋亡數目增加，認為糖尿病狀態下糖脂的代謝異常可能改變了凋亡基因的表達，從而使細胞凋亡增加，引起腎臟功能損害。本實驗也發現，Bcl-2在正常大鼠腎小管上皮細胞大量表達，而糖尿病大鼠腎小管上皮細胞Bcl-2的表達明顯減少；胃轉流手術能顯著改善糖尿病大鼠的血糖和血脂，術后8周手術組大鼠腎小管上皮細胞Bcl-2的表達明顯高于糖尿病大鼠，推測手術對腎臟功能的保護作用可能與術后上調Bcl-2的表達有關。其次，手術后諸多胃腸道激素的改變是否對Bcl-2有直接作用尚需實驗進一步證實。
單核/巨噬細胞在腎小球和腎間質的浸潤也是糖尿病腎病的特征性表現之一。黏附分子（adhesion molecules，AMs）是一類調節細胞之間和細胞與細胞外基質間相互黏附結合的一類糖蛋白，在糖尿病腎病的發生發展中起重要作用。ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族的重要成員。有研究[21]證實，ICAM-1可導介單核細胞/巨噬細胞和淋巴細胞黏附，致炎性細胞浸潤到腎臟組織，產生各種炎性因子和細胞因子，參與了糖尿病腎病的病程進展。Sugimoto等[22]的研究發現，在糖尿病動物模型中拮抗ICAM-1表達的同時，腎實質內巨噬細胞的浸潤也相應減少，表明在糖尿病腎病的發展過程中ICAM-1是炎性細胞浸潤的關鍵分子。本實驗結果顯示，糖尿病大鼠腎臟ICAM-1的表達明顯高于正常對照組大鼠，廣泛表達于腎小球及腎小管上皮細胞；術后8周，Roux-en-Y胃旁路手術組大鼠ICAM-1的表達則明顯降低，腎臟功能得到改善。手術后ICAM-1的降低可能與術后腎臟微炎性反應狀態、氧化應激、血糖血脂等的改善有關，但本實驗并未檢測腎臟炎性細胞的浸潤情況，這也是本實驗一個不足的地方。
綜上所述，胃旁路術后能改善糖尿病大鼠的腎臟功能和病理損害，對腎臟具有保護作用, 其作用機理是多方面的，可能通過降低TGF-β1、NADPH氧化酶4、Bcl-2、ICAM-1等的表達，從而改善糖尿病狀態下腎臟的微炎性反應狀態、氧化應激等，預防和延緩糖尿病腎病的發生和發展。
