引用本文： 李之令, 張東, 劉江偉, 王皓, 李瑞, 李建英. 姜黃素對大鼠重癥急性胰腺炎腎臟iNOS表達的影響及其保護機理研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(4): 412-417. doi: 10.7507/1007-9424.20150110 復制
臨床上發現，重癥急性胰腺炎（severe acute pan-creatitis，SAP）常可導致腎臟、心血管、肝、肺等機體重要器官損傷，而且急性胰腺炎的嚴重程度常與腎臟器官的損傷程度呈正相關[1]。在SAP相關性腎損傷中，炎癥反應在其腎損傷中起到了重要的作用。誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是炎癥反應中重要的誘導酶，可以導致機體產生過量的NO，在SAP相關性腎損傷中起到直接的損傷作用。姜黃是我國一種傳統中藥，具有抗凝[2]、抗氧化[3-4]、抗腫瘤[5-6]等作用，而且毒性很低[7], 我國很早就應用于對急性胰腺炎的防治，但其治療機理還未完全闡述清楚。本研究通過觀察姜黃素對SAP相關性腎損傷腎臟組織iNOS表達以及細胞因子IL-1β、IL-6和IL-10的影響，旨在探討姜黃素對SAP相關性腎損傷的治療機理。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑和儀器
1.1.1 實驗動物
8～10周齡SD大鼠，SPF級，24只，雌雄不限，平均體質量（320±25）g，購自新疆醫科大學實驗動物中心，室溫〔（21±1）℃〕下自由進食水。
1.1.2 主要試劑
3%戊巴比妥鈉（武漢人福科技），姜黃素（上海生工生物），生理鹽水（四川科倫醫藥），SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所），IL-1β、IL-6和IL-10試劑盒（上海依科賽生物制品有限公司），原位末端標記（TUNEL）試劑盒（Roche，USA），DAB顯色劑（北京中山金橋生物技術有限公司），TRIZOL（北京康為世紀生物技術有限公司），氯仿（天津福晨化學試劑廠），異丙醇（天津福晨化學試劑廠），無水乙醇（天津市化學三廠），反轉錄試劑盒（invtrogen，USA），SYBR Green Select Master Mix（Life Technologies Corporation），5×TBE（上海生工生物），瓊脂糖（invitrogen，USA），核酸染料、Marker及Ladder（北京天根生物有限公司），引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
1.1.3 主要儀器
全自動生化分析儀（邁瑞公司），奧林巴斯光學顯微鏡（日本），電泳儀（北京六一儀器廠），分光光度計（Bio-Rad，USA），PCR基因擴增（Bio-Rad，singapore），RT-PCR儀（Bio-Rad，USA）。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組
將健康SD大鼠24只根據窩別及體質量按隨機數表法隨機分為對照組、SAP相關性腎損傷組（簡稱損傷組）和姜黃素治療組（簡稱治療組），每組8只。
1.2.2 術前準備
實驗動物術前12 h禁食，自由飲水。經3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后固定、備皮、碘伏消毒手術區后常規鋪巾。姜黃素生理鹽水稀釋液的配制：根據大鼠的體質量按200 mg/kg的量計算出治療組每只大鼠所需的姜黃素量，再把姜黃素稀釋成1.5 mL姜黃素生理鹽水稀釋液待用。對照組和損傷組大鼠在建模前3 h分別予以1.5 mL生理鹽水灌胃，而治療組大鼠在建模前3 h予以1.5 mL的姜黃素生理鹽水稀釋液灌胃。
1.2.3 SAP模型建立
損傷組和治療組大鼠采用胰頭夾閉法[8]建立SAP模型，對照組大鼠不做任何對胰腺有損害的處理。
1.2.4 術后處理
造模后放回飼養箱，4 h后可進食水。造模后12 h，對照組和損傷組大鼠予以1.5 mL生理鹽水灌胃，治療組則予以1.5 mL姜黃素生理鹽水稀釋液灌胃。
1.2.5 標本采集
各組大鼠于造模完成后18 h經3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，常規消毒、鋪巾、拆線，進入腹腔觀察腹腔內各臟器的大體情況，然后尋找出下腔靜脈用促凝管2只各抽取3 mL靜脈血，一只行血淀粉酶、肌酐及尿素氮檢測，另一只經3 000 r/min (r=13.5 cm)離心10 min后，小心吸取上層血清保存于-70℃備測IL-1β、IL-6和IL-10含量。取左腎約1 cm見方的組織塊用10%甲醛液固定后石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色（HE），進行腎臟組織病理學觀察。取右腎用無菌鹽水紗布擦凈血跡后放入凍存管中密封編號、液氮冷凍保存備檢。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 腎臟細胞凋亡的檢測
取處理好的石蠟切片固定在防脫片上后采用TUNEL法標記凋亡細胞（按試劑盒說明操作），DAB顯色，在光鏡下分析結果。每張切片觀察5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，計算每100個細胞中陽性細胞數，即凋亡指數，取其均值。
1.3.2 血清淀粉酶、肌酐及尿素氮水平檢測
把已經離心好的待測血清嚴格按操作規范及流程使用邁瑞公司的全自動生化分析儀進行檢測，檢測前把生化分析儀均進行校準，保證質控數據均在質控范圍內。
1.3.3 血清IL-1β、IL-6及IL-10含量測定
采用雙抗體夾心ELISA法檢測，具體步驟嚴格按試劑盒使用說明書進行操作。通過繪制標準曲線得出樣品中相應細胞因子含量，該法檢測IL-1β、IL-6及IL-10的靈敏度為15 pg/mL。
1.3.4 腎組織中iNOS mRNA表達的檢測
采用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測。從凍存管中取0.1 g腎組織放入加有液氮的研缽中，不斷加入液氮轉動杵子直至腎組織研磨成粉末狀后加入1 mL TRIZOL，按說明書提取腎組織RNA。通過分光光度計測定其RNA的濃度，并根據分光光度計所測260 nm/280 nm處的吸光度比值來判定其純度，滿意后取樣品的RNA 5μg進行反轉錄合成cDNA。再取待測樣品的cDNA按說明書配制成總體積為20μL的RT-PCR反應體系。iNOS PCR上游引物序列為5′-GTGCTAATGCGGAAGGTCATG-3′，下游引物序列為3′-GCTTCCGACTTTCCTGTCTCAGTA-5′；β-actin PCR上游引物序列為5′-GCCAGGATAGAGCCA-CCAATC-3′，下游引物序列為3′-ACTGCCCTGGCT-CCTAGCA-5′。β-actin反應條件：95℃3 min，95℃10 s，60℃30 s，40循環；65℃10 s，61循環。iNOS反應條件：95℃3 min，95℃10 s，56℃30 s，40循環；65℃10 s，61循環。各PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳回收后稀釋8個濃度梯度制作DNA標準曲線，各樣本的基因濃度結果直接由機器生成。每個樣本的iNOS基因的濃度與其β-actin基因濃度的比值即為iNOS mRNA的相對表達量。
1.4 統計學方法
應用SPSS 17.0軟件包進行統計學處理。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 胰腺大體觀察結果及病理學改變
對照組在建模完成時及造模完成后18 h，胰腺無明顯變化；損傷組和治療組在造模完成時大體可見胰腺組織輕度腫脹，造模完成后18 h見腹腔有血性腹水，胰腺出現出血、壞死及皂化斑形成，但治療組較損傷組其胰腺損傷減輕，胰腺出血壞死不如損傷組明顯，僅有少量的皂化斑出現，腹腔血性腹水也較損傷組減少。光鏡下見：對照組胰腺無明顯充血水腫，胰腺間質和腺小葉未見炎性細胞浸潤，無出血及壞死點（圖 1A）；損傷組胰腺充血腫脹，胰腺間質和腺小葉大量炎性細胞浸潤，部分胰腺組織呈彌漫性出血及壞死，胰周脂肪壞死，部分腺泡細胞溶解，只剩下解體細胞殘留（圖 1B）；治療組見胰腺仍充血腫脹，但胰腺間質只有少量炎性細胞浸潤，血管充血不如損傷組明顯，僅有片狀出血與壞死（圖 1C）。
圖1
示3組大鼠胰腺組織病理變化情況(HE×400)。1A:對照組; 1B:損傷組; 1C:治療組??圖 2示3組大鼠腎臟組織病理變化情況(HE×400)。2A:對照組; 2B:損傷組; 2C:治療組??圖 3示3組大鼠腎臟組織細胞凋亡情況(TUNEL×400)。3A:對照組; 3B:損傷組; 3C:治療組
2.2 腎臟大體觀察結果及病理學改變
3組大鼠在造模完成時其腎臟體積和外觀均無明顯變化。造模完成后18 h，對照組見腎組織大體未見明顯變化；損傷組見腎臟體積略增大，外觀呈暗紫色；而治療組腎臟體積增大不明顯，外觀顏色改變不明顯。光鏡下見對照組腎小球及腎小管結構正常，細胞無充血水腫及壞死（圖 2A）；而損傷組腎小管上皮細胞水腫、個別細胞壞死脫落進入管腔，管腔變窄、腎小球中度淤血（圖 2B）；治療組見腎小管上皮細胞水腫不如損傷組明顯，管腔輕度變窄，腎小球輕度淤血（圖 2C）。
2.3 腎臟細胞凋亡情況檢測結果
在高倍鏡下見對照組腎小球及腎小管結構完整，未見到凋亡細胞（圖 3A）；損傷組有大量凋亡細胞，沿腎小管分布為主，腎小球偶見少許凋亡細胞（圖 3B）；治療組的腎小管凋亡細胞明顯減少，腎小球未見凋亡細胞（圖 3C）。對照組、損傷組及治療組的腎臟細胞凋亡指數分別為0、（42.0±7.4）%和（25.4±5.4）%，3組間兩兩比較其差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.4 血清淀粉酶、肌酐及尿素氮檢測結果
損傷組及治療組較對照組血清淀粉酶、肌酐及尿素氮水平均明顯升高（P < 0.05），而治療組上述3項指標的升高不如損傷組明顯，均較損傷組明顯下降（P < 0.05），見表 1。
表1
3組大鼠血清淀粉酶、肌酐及尿素氮檢測結果（2.5 血清IL-1β、IL-6及IL-10含量檢測結果
損傷組及治療組較對照組血清IL-1β、IL-6及IL-10水平均明顯升高（P < 0.05）；但治療組血清IL-1β和IL-6水平低于損傷組（P < 0.05），而IL-10水平則高于損傷組（P < 0.05）。見表 2。
表2
3組大鼠血清細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10含量檢測結果（2.6 腎組織中iNOS mRNA表達檢測結果
mRNA表達（相對表達量為0），損傷組和治療組腎組織中iNOS mRNA相對表達量分別為（8.3±1.2）×10-1和（6.0±1.0）×10-1，明顯高于對照組（P < 0.05），但治療組又明顯低于損傷組（P < 0.05）。
3 討論
腎損傷是SAP時嚴重的相關靶器官損傷之一，其中炎性因子在其損傷中起到了主要的作用。NO、IL-1及IL-6是機體的主要炎性因子，參與機體很多重要器官的損傷[9-11]；而IL-10在炎性反應中主要起拮抗作用[12]。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是機體內NO生成的主要限速酶[13]，NO產生量的多少主要受NOS的調控。由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）提供電子，黃素腺嘌呤二核苷酸、四氫生物蝶呤、黃素單核苷酸及Fe2+傳遞電子和在1個氧分子的參與下，NOS催化L-精氨酸（L-Arg）降解為胍氨酸并釋放出NO。
NOS可分為結構型（cNOS）和誘導型（iNOS）。iNOS為一種機體內重要的促炎性酶，在正常生理條件下不表達，當機體受到損傷時表達于多種細胞，誘導機體產生過量的NO，發揮病理損傷作用[14]。一般認為，iNOS是一種NADPH依賴性酶，主要分布在巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、血管內皮細胞及平滑肌細胞[15]。當機體處于應激狀態時，葡萄糖的糖代謝磷酸戊糖途徑加強，產生NADPH的量相應增加，激活機體合成更多的iNOS酶，促使內皮細胞產生大量的NO。高濃度的NO是一種具有較強細胞毒性的效應分子[16]，可以強烈的舒張腎皮質和腎髓質的微小血管導致微小血管的內皮細胞間間隙增寬, 血管通透性改變，促進大量炎性因子通過微小血管的內皮細胞間間隙進入血液且隨血液循環損傷機體遠處的靶器官，導致全身多器官功能障礙，進一步加重機體的損傷。而且高濃度的NO還可以通過誘導機體內皮細胞形態結構改變，致使血管屏障功能受到損害，大量炎性損害因子進入血管并與內皮細胞相互作用，促使大量活性氧彈性蛋白酶和溶酶體酶釋放、激活補體, 再次對腎小球及腎小管血管內皮細胞直接產生損傷作用，大量炎性細胞及血小板聚集在受損傷的血管處導致腎臟內血管出現淤血及出血, 腎小球及腎小管細胞出現充血水腫以及壞死。NO過度生成與呼吸鏈復合體Ⅲ所釋放的超氧化物結合形成過氧化亞硝酸鹽，可以阻斷線粒體的呼吸作用，造成線粒體損傷[17]；而且局部過量的NO與氧自由基相互作用后對腎組織細胞起直接毒性作用[18]，導致腎臟的細胞出現大量的凋亡。NO與亞鐵血紅素具有很強的親和力，可以與血紅蛋白結合形成亞硝酸鹽血紅蛋白使血紅蛋白失去攜帶氧氣的能力，進一步加重機體的缺氧。本研究中，損傷組腎臟組織中iNOS mRNA的相對表達量明顯升高，而治療組iNOS mRNA的相對表達量相對于損傷組則明顯下降（P < 0.05），提示姜黃素對SAP相關性腎損傷中iNOS mRNA的表達具有明顯的抑制作用；同時觀察到，治療組腎臟細胞的凋亡指數明顯低于損傷組（P < 0.05），其肌酐和尿素氮水平也明顯低于損傷組（P < 0.05）。該結果提示，姜黃素可能通過下調腎組織中iNOS mRNA的表達，以減少機體產生大量的NO，從而減輕對腎臟細胞的破壞作用，因此腎臟的結構和功能得到了很好的保護。
有文獻[19]證實, 姜黃素含有一種熱穩定蛋白-抗氧化蛋白（TAP）, 具有清除氧自由基從而發揮抗氧化活性。TAP還可以穩定腎臟組織的細胞膜，對提高超氧化物歧化酶（SOD）活性也可能起到一定作用[20]。SOD可以很好地清除機體內的氧自由基, 減輕氧自由基對腎臟細胞的損害作用從而對腎臟細胞起到很好的保護作用。姜黃素可能通過抑制脂多糖引起的腎小管上皮細胞炎性因子的釋放[21]以及促進抗炎性因子的表達，減少機體的炎性反應，從而對腎臟起到保護作用。當SAP病情不斷加重時，大量活化的胰蛋白酶可以將前彈力酶、羧基肽酶原及非活性型磷脂酶A2激活釋放進入血液，其中磷脂酶A2（PLA2）使細胞膜的磷脂和卵磷脂分解激發機體產生大量的內毒素及促炎性因子如TNF-α、IL-1、IL-6等，機體的單核巨噬細胞釋放刺激粒細胞的活化，粒細胞與內皮細胞的黏附，刺激吞噬細胞功能的激活，釋放活性自由基以及蛋白酶和水解酶。大量炎性介質的活化和氧自由基產生以及溶酶體對細胞膜造成損傷；而且活化了的炎性細胞黏附在腎臟血管內皮，腎毛細血管壁嚴重受損。同時機體還伴有血小板活化因子（PAF）、血栓素A2（TXA2）的促凝物質的釋放，血液黏度明顯增加，促進微循環血栓的形成，加之機體的低血容量造成腎血容量灌注不足，進一步加重腎損傷[22]。隨著腎損傷的不斷加重，抗炎性因子IL-10在刺激因素的不斷作用下表達不斷增強。抗炎性因子IL-10不但可以抑制炎性因子的表達，而且還可以誘導合成促炎性因子拮抗劑來發揮對炎性因子的抵抗作用[23]。本研究的姜黃素治療組中，促炎性細胞因子IL-1β及IL-6水平明顯下降，而抑炎癥因子IL-10水平則明顯升高（P < 0.01）, 表明姜黃素能抑制炎性介質的釋放[24]，具有很好的抗炎能力[25]。
綜上，本研究觀察到姜黃素治療SAP腎損傷的大鼠模型取得了較好的實驗效果，其可能的治療機理是：姜黃素可能通過抑制促炎性因子IL-1β及IL-6的表達，促進抗炎性因子IL-10表達，下調iNOS mRNA的表達來抑制大量NO的產生，從而減少氧自由基的生成以及溶酶體對細胞膜的損害，保護完整的腎臟細胞功能，維持正常的腎臟功能，對腎臟起到很好的保護作用。但姜黃素治療SAP腎損傷有無其他治療機理的參與，還需要我們做進一步的研究來證實。
臨床上發現，重癥急性胰腺炎（severe acute pan-creatitis，SAP）常可導致腎臟、心血管、肝、肺等機體重要器官損傷，而且急性胰腺炎的嚴重程度常與腎臟器官的損傷程度呈正相關[1]。在SAP相關性腎損傷中，炎癥反應在其腎損傷中起到了重要的作用。誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是炎癥反應中重要的誘導酶，可以導致機體產生過量的NO，在SAP相關性腎損傷中起到直接的損傷作用。姜黃是我國一種傳統中藥，具有抗凝[2]、抗氧化[3-4]、抗腫瘤[5-6]等作用，而且毒性很低[7], 我國很早就應用于對急性胰腺炎的防治，但其治療機理還未完全闡述清楚。本研究通過觀察姜黃素對SAP相關性腎損傷腎臟組織iNOS表達以及細胞因子IL-1β、IL-6和IL-10的影響，旨在探討姜黃素對SAP相關性腎損傷的治療機理。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑和儀器
1.1.1 實驗動物
8～10周齡SD大鼠，SPF級，24只，雌雄不限，平均體質量（320±25）g，購自新疆醫科大學實驗動物中心，室溫〔（21±1）℃〕下自由進食水。
1.1.2 主要試劑
3%戊巴比妥鈉（武漢人福科技），姜黃素（上海生工生物），生理鹽水（四川科倫醫藥），SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所），IL-1β、IL-6和IL-10試劑盒（上海依科賽生物制品有限公司），原位末端標記（TUNEL）試劑盒（Roche，USA），DAB顯色劑（北京中山金橋生物技術有限公司），TRIZOL（北京康為世紀生物技術有限公司），氯仿（天津福晨化學試劑廠），異丙醇（天津福晨化學試劑廠），無水乙醇（天津市化學三廠），反轉錄試劑盒（invtrogen，USA），SYBR Green Select Master Mix（Life Technologies Corporation），5×TBE（上海生工生物），瓊脂糖（invitrogen，USA），核酸染料、Marker及Ladder（北京天根生物有限公司），引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
1.1.3 主要儀器
全自動生化分析儀（邁瑞公司），奧林巴斯光學顯微鏡（日本），電泳儀（北京六一儀器廠），分光光度計（Bio-Rad，USA），PCR基因擴增（Bio-Rad，singapore），RT-PCR儀（Bio-Rad，USA）。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組
將健康SD大鼠24只根據窩別及體質量按隨機數表法隨機分為對照組、SAP相關性腎損傷組（簡稱損傷組）和姜黃素治療組（簡稱治療組），每組8只。
1.2.2 術前準備
實驗動物術前12 h禁食，自由飲水。經3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后固定、備皮、碘伏消毒手術區后常規鋪巾。姜黃素生理鹽水稀釋液的配制：根據大鼠的體質量按200 mg/kg的量計算出治療組每只大鼠所需的姜黃素量，再把姜黃素稀釋成1.5 mL姜黃素生理鹽水稀釋液待用。對照組和損傷組大鼠在建模前3 h分別予以1.5 mL生理鹽水灌胃，而治療組大鼠在建模前3 h予以1.5 mL的姜黃素生理鹽水稀釋液灌胃。
1.2.3 SAP模型建立
損傷組和治療組大鼠采用胰頭夾閉法[8]建立SAP模型，對照組大鼠不做任何對胰腺有損害的處理。
1.2.4 術后處理
造模后放回飼養箱，4 h后可進食水。造模后12 h，對照組和損傷組大鼠予以1.5 mL生理鹽水灌胃，治療組則予以1.5 mL姜黃素生理鹽水稀釋液灌胃。
1.2.5 標本采集
各組大鼠于造模完成后18 h經3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，常規消毒、鋪巾、拆線，進入腹腔觀察腹腔內各臟器的大體情況，然后尋找出下腔靜脈用促凝管2只各抽取3 mL靜脈血，一只行血淀粉酶、肌酐及尿素氮檢測，另一只經3 000 r/min (r=13.5 cm)離心10 min后，小心吸取上層血清保存于-70℃備測IL-1β、IL-6和IL-10含量。取左腎約1 cm見方的組織塊用10%甲醛液固定后石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色（HE），進行腎臟組織病理學觀察。取右腎用無菌鹽水紗布擦凈血跡后放入凍存管中密封編號、液氮冷凍保存備檢。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 腎臟細胞凋亡的檢測
取處理好的石蠟切片固定在防脫片上后采用TUNEL法標記凋亡細胞（按試劑盒說明操作），DAB顯色，在光鏡下分析結果。每張切片觀察5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，計算每100個細胞中陽性細胞數，即凋亡指數，取其均值。
1.3.2 血清淀粉酶、肌酐及尿素氮水平檢測
把已經離心好的待測血清嚴格按操作規范及流程使用邁瑞公司的全自動生化分析儀進行檢測，檢測前把生化分析儀均進行校準，保證質控數據均在質控范圍內。
1.3.3 血清IL-1β、IL-6及IL-10含量測定
采用雙抗體夾心ELISA法檢測，具體步驟嚴格按試劑盒使用說明書進行操作。通過繪制標準曲線得出樣品中相應細胞因子含量，該法檢測IL-1β、IL-6及IL-10的靈敏度為15 pg/mL。
1.3.4 腎組織中iNOS mRNA表達的檢測
采用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測。從凍存管中取0.1 g腎組織放入加有液氮的研缽中，不斷加入液氮轉動杵子直至腎組織研磨成粉末狀后加入1 mL TRIZOL，按說明書提取腎組織RNA。通過分光光度計測定其RNA的濃度，并根據分光光度計所測260 nm/280 nm處的吸光度比值來判定其純度，滿意后取樣品的RNA 5μg進行反轉錄合成cDNA。再取待測樣品的cDNA按說明書配制成總體積為20μL的RT-PCR反應體系。iNOS PCR上游引物序列為5′-GTGCTAATGCGGAAGGTCATG-3′，下游引物序列為3′-GCTTCCGACTTTCCTGTCTCAGTA-5′；β-actin PCR上游引物序列為5′-GCCAGGATAGAGCCA-CCAATC-3′，下游引物序列為3′-ACTGCCCTGGCT-CCTAGCA-5′。β-actin反應條件：95℃3 min，95℃10 s，60℃30 s，40循環；65℃10 s，61循環。iNOS反應條件：95℃3 min，95℃10 s，56℃30 s，40循環；65℃10 s，61循環。各PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳回收后稀釋8個濃度梯度制作DNA標準曲線，各樣本的基因濃度結果直接由機器生成。每個樣本的iNOS基因的濃度與其β-actin基因濃度的比值即為iNOS mRNA的相對表達量。
1.4 統計學方法
應用SPSS 17.0軟件包進行統計學處理。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 胰腺大體觀察結果及病理學改變
對照組在建模完成時及造模完成后18 h，胰腺無明顯變化；損傷組和治療組在造模完成時大體可見胰腺組織輕度腫脹，造模完成后18 h見腹腔有血性腹水，胰腺出現出血、壞死及皂化斑形成，但治療組較損傷組其胰腺損傷減輕，胰腺出血壞死不如損傷組明顯，僅有少量的皂化斑出現，腹腔血性腹水也較損傷組減少。光鏡下見：對照組胰腺無明顯充血水腫，胰腺間質和腺小葉未見炎性細胞浸潤，無出血及壞死點（圖 1A）；損傷組胰腺充血腫脹，胰腺間質和腺小葉大量炎性細胞浸潤，部分胰腺組織呈彌漫性出血及壞死，胰周脂肪壞死，部分腺泡細胞溶解，只剩下解體細胞殘留（圖 1B）；治療組見胰腺仍充血腫脹，但胰腺間質只有少量炎性細胞浸潤，血管充血不如損傷組明顯，僅有片狀出血與壞死（圖 1C）。
圖1
示3組大鼠胰腺組織病理變化情況(HE×400)。1A:對照組; 1B:損傷組; 1C:治療組??圖 2示3組大鼠腎臟組織病理變化情況(HE×400)。2A:對照組; 2B:損傷組; 2C:治療組??圖 3示3組大鼠腎臟組織細胞凋亡情況(TUNEL×400)。3A:對照組; 3B:損傷組; 3C:治療組
2.2 腎臟大體觀察結果及病理學改變
3組大鼠在造模完成時其腎臟體積和外觀均無明顯變化。造模完成后18 h，對照組見腎組織大體未見明顯變化；損傷組見腎臟體積略增大，外觀呈暗紫色；而治療組腎臟體積增大不明顯，外觀顏色改變不明顯。光鏡下見對照組腎小球及腎小管結構正常，細胞無充血水腫及壞死（圖 2A）；而損傷組腎小管上皮細胞水腫、個別細胞壞死脫落進入管腔，管腔變窄、腎小球中度淤血（圖 2B）；治療組見腎小管上皮細胞水腫不如損傷組明顯，管腔輕度變窄，腎小球輕度淤血（圖 2C）。
2.3 腎臟細胞凋亡情況檢測結果
在高倍鏡下見對照組腎小球及腎小管結構完整，未見到凋亡細胞（圖 3A）；損傷組有大量凋亡細胞，沿腎小管分布為主，腎小球偶見少許凋亡細胞（圖 3B）；治療組的腎小管凋亡細胞明顯減少，腎小球未見凋亡細胞（圖 3C）。對照組、損傷組及治療組的腎臟細胞凋亡指數分別為0、（42.0±7.4）%和（25.4±5.4）%，3組間兩兩比較其差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.4 血清淀粉酶、肌酐及尿素氮檢測結果
損傷組及治療組較對照組血清淀粉酶、肌酐及尿素氮水平均明顯升高（P < 0.05），而治療組上述3項指標的升高不如損傷組明顯，均較損傷組明顯下降（P < 0.05），見表 1。
表1
3組大鼠血清淀粉酶、肌酐及尿素氮檢測結果（2.5 血清IL-1β、IL-6及IL-10含量檢測結果
損傷組及治療組較對照組血清IL-1β、IL-6及IL-10水平均明顯升高（P < 0.05）；但治療組血清IL-1β和IL-6水平低于損傷組（P < 0.05），而IL-10水平則高于損傷組（P < 0.05）。見表 2。
表2
3組大鼠血清細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10含量檢測結果（2.6 腎組織中iNOS mRNA表達檢測結果
mRNA表達（相對表達量為0），損傷組和治療組腎組織中iNOS mRNA相對表達量分別為（8.3±1.2）×10-1和（6.0±1.0）×10-1，明顯高于對照組（P < 0.05），但治療組又明顯低于損傷組（P < 0.05）。
3 討論
腎損傷是SAP時嚴重的相關靶器官損傷之一，其中炎性因子在其損傷中起到了主要的作用。NO、IL-1及IL-6是機體的主要炎性因子，參與機體很多重要器官的損傷[9-11]；而IL-10在炎性反應中主要起拮抗作用[12]。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是機體內NO生成的主要限速酶[13]，NO產生量的多少主要受NOS的調控。由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）提供電子，黃素腺嘌呤二核苷酸、四氫生物蝶呤、黃素單核苷酸及Fe2+傳遞電子和在1個氧分子的參與下，NOS催化L-精氨酸（L-Arg）降解為胍氨酸并釋放出NO。
NOS可分為結構型（cNOS）和誘導型（iNOS）。iNOS為一種機體內重要的促炎性酶，在正常生理條件下不表達，當機體受到損傷時表達于多種細胞，誘導機體產生過量的NO，發揮病理損傷作用[14]。一般認為，iNOS是一種NADPH依賴性酶，主要分布在巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、血管內皮細胞及平滑肌細胞[15]。當機體處于應激狀態時，葡萄糖的糖代謝磷酸戊糖途徑加強，產生NADPH的量相應增加，激活機體合成更多的iNOS酶，促使內皮細胞產生大量的NO。高濃度的NO是一種具有較強細胞毒性的效應分子[16]，可以強烈的舒張腎皮質和腎髓質的微小血管導致微小血管的內皮細胞間間隙增寬, 血管通透性改變，促進大量炎性因子通過微小血管的內皮細胞間間隙進入血液且隨血液循環損傷機體遠處的靶器官，導致全身多器官功能障礙，進一步加重機體的損傷。而且高濃度的NO還可以通過誘導機體內皮細胞形態結構改變，致使血管屏障功能受到損害，大量炎性損害因子進入血管并與內皮細胞相互作用，促使大量活性氧彈性蛋白酶和溶酶體酶釋放、激活補體, 再次對腎小球及腎小管血管內皮細胞直接產生損傷作用，大量炎性細胞及血小板聚集在受損傷的血管處導致腎臟內血管出現淤血及出血, 腎小球及腎小管細胞出現充血水腫以及壞死。NO過度生成與呼吸鏈復合體Ⅲ所釋放的超氧化物結合形成過氧化亞硝酸鹽，可以阻斷線粒體的呼吸作用，造成線粒體損傷[17]；而且局部過量的NO與氧自由基相互作用后對腎組織細胞起直接毒性作用[18]，導致腎臟的細胞出現大量的凋亡。NO與亞鐵血紅素具有很強的親和力，可以與血紅蛋白結合形成亞硝酸鹽血紅蛋白使血紅蛋白失去攜帶氧氣的能力，進一步加重機體的缺氧。本研究中，損傷組腎臟組織中iNOS mRNA的相對表達量明顯升高，而治療組iNOS mRNA的相對表達量相對于損傷組則明顯下降（P < 0.05），提示姜黃素對SAP相關性腎損傷中iNOS mRNA的表達具有明顯的抑制作用；同時觀察到，治療組腎臟細胞的凋亡指數明顯低于損傷組（P < 0.05），其肌酐和尿素氮水平也明顯低于損傷組（P < 0.05）。該結果提示，姜黃素可能通過下調腎組織中iNOS mRNA的表達，以減少機體產生大量的NO，從而減輕對腎臟細胞的破壞作用，因此腎臟的結構和功能得到了很好的保護。
有文獻[19]證實, 姜黃素含有一種熱穩定蛋白-抗氧化蛋白（TAP）, 具有清除氧自由基從而發揮抗氧化活性。TAP還可以穩定腎臟組織的細胞膜，對提高超氧化物歧化酶（SOD）活性也可能起到一定作用[20]。SOD可以很好地清除機體內的氧自由基, 減輕氧自由基對腎臟細胞的損害作用從而對腎臟細胞起到很好的保護作用。姜黃素可能通過抑制脂多糖引起的腎小管上皮細胞炎性因子的釋放[21]以及促進抗炎性因子的表達，減少機體的炎性反應，從而對腎臟起到保護作用。當SAP病情不斷加重時，大量活化的胰蛋白酶可以將前彈力酶、羧基肽酶原及非活性型磷脂酶A2激活釋放進入血液，其中磷脂酶A2（PLA2）使細胞膜的磷脂和卵磷脂分解激發機體產生大量的內毒素及促炎性因子如TNF-α、IL-1、IL-6等，機體的單核巨噬細胞釋放刺激粒細胞的活化，粒細胞與內皮細胞的黏附，刺激吞噬細胞功能的激活，釋放活性自由基以及蛋白酶和水解酶。大量炎性介質的活化和氧自由基產生以及溶酶體對細胞膜造成損傷；而且活化了的炎性細胞黏附在腎臟血管內皮，腎毛細血管壁嚴重受損。同時機體還伴有血小板活化因子（PAF）、血栓素A2（TXA2）的促凝物質的釋放，血液黏度明顯增加，促進微循環血栓的形成，加之機體的低血容量造成腎血容量灌注不足，進一步加重腎損傷[22]。隨著腎損傷的不斷加重，抗炎性因子IL-10在刺激因素的不斷作用下表達不斷增強。抗炎性因子IL-10不但可以抑制炎性因子的表達，而且還可以誘導合成促炎性因子拮抗劑來發揮對炎性因子的抵抗作用[23]。本研究的姜黃素治療組中，促炎性細胞因子IL-1β及IL-6水平明顯下降，而抑炎癥因子IL-10水平則明顯升高（P < 0.01）, 表明姜黃素能抑制炎性介質的釋放[24]，具有很好的抗炎能力[25]。
綜上，本研究觀察到姜黃素治療SAP腎損傷的大鼠模型取得了較好的實驗效果，其可能的治療機理是：姜黃素可能通過抑制促炎性因子IL-1β及IL-6的表達，促進抗炎性因子IL-10表達，下調iNOS mRNA的表達來抑制大量NO的產生，從而減少氧自由基的生成以及溶酶體對細胞膜的損害，保護完整的腎臟細胞功能，維持正常的腎臟功能，對腎臟起到很好的保護作用。但姜黃素治療SAP腎損傷有無其他治療機理的參與，還需要我們做進一步的研究來證實。
