引用本文： 付海峰, 丁佑銘, 周文波, 魏英, 吳紅偉, 汪斌, 徐軍輝, 徐彥哲. iAPA-DC/CTL對SMMC-7721細胞移植瘤的抑制作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(4): 399-403. doi: 10.7507/1007-9424.20150108 復制
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝臟最常見的原發性惡性腫瘤[1]，其發病隱匿，病程較短，病死率較高。目前，免疫治療已成為治療肝癌的新手段[2]。研究表明，以樹突狀細胞（DC）為基礎的免疫療法是當今腫瘤治療中最有價值也是最有前途的方法之一[3]。沉默免疫負調控基因（inhibition of antigen-presentation attenuators, iAPA）技術，是一種新型的腫瘤免疫細胞治療技術，目前臨床報道很少，人肝癌-裸鼠模型是目前實驗中最能反映人類肝癌生物學特性的“活試管”。本研究旨在觀察經iAPA技術處理的DC聯合細胞毒性T淋巴細胞（CTL）即iAPA-DC/CTL對SMMC-7721細胞裸鼠皮下移植瘤抑制作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
人肝癌細胞系SMMC-7721由湖北醫藥學院附屬東風醫院肝臟外科研究所凍存、饋贈，20%人血白蛋白（瑞士杰特貝林生物制品有限公司），淋巴細胞分離液（天津生物制品研究所），人DC細胞完全培養液、無血清培養基、含T細胞因子培養基、CD3包被的150 cm2培養瓶及iAPA因子均由北京英默生物科技有限公司協助提供，SPF級4～6周齡健康BALB/c-nu小鼠14只，均為雄性，購自北京阜康生物科技股份有限公司，鼠抗人Glypican-3及Hepatocyte單克隆抗體、兔抗人Survivin多克隆抗體、兔抗人CD8單克隆抗體、即用型快捷免疫組化MaxVision?TM試劑盒和DAB染色液購自邁新公司。
1.2 主要器材
CS-3000型血細胞分離機，Thermo 5%及7.5% CO2培養箱，湘儀L-530離心機，阿爾泰BHC-1300-ⅡA2生物安全柜，三豐573-191-20低測力數顯卡尺，Sartorius BS210S電子天平，Olympus CKX41顯微鏡，以及SPF級動物實驗室均由湖北醫藥學院實驗動物中心提供。
1.3 實驗方法
本研究經醫院倫理委員會批準，提供血細胞的健康志愿者在實施前已簽定知情同意書。
1.3.1 人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立
復蘇凍存的人肝癌細胞系SMMC-7721，進行傳代培養。取對數生長期的SMMC-7721肝癌細胞2×107個，用0.02％EDTA-0.125％胰酶消化，PBS洗滌細胞2次，1 500 r/min離心5 min（離心半徑160 mm）后收集細胞，用0.9％生理鹽水重懸細胞、定容。以1×106個細胞/0.2 mL局部注射接種于每只裸小鼠右腹股溝皮下，以后每3天觀察成瘤情況，以皮下結節直徑超過0.5 cm為成瘤標準。
1.3.2 iAPA-DC/CTL的制備
血細胞分離機采集健康志愿者的血細胞懸液20 mL，生理鹽水稀釋后2 000 r/min離心15 min（離心半徑178 mm），棄血漿層，生理鹽水重懸至35 mL，緩慢加至15 mL的淋巴細胞分離液上層，Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，對白膜層細胞進行無血清培養。末次離心(1 400 r/min離心8 min，離心半徑178 mm)后，用無血清培養液重懸細胞沉淀至30 mL，鋪于75 cm2的培養瓶，置37℃、5%CO2培養箱中貼壁培養30 min；后晃下貼壁不牢的細胞，吸出細胞懸液，培養瓶中加人DC細胞完全培養液（15 mL/瓶），置于37℃、5%CO2培養箱中，作為DC培養（共7 d）。未貼壁的細胞懸液，加入CD3包被的150 cm2培養瓶中，補加含T細胞因子的培養基70 mL，置于37℃、7.5%CO2培養箱中，作為CTL培養（共28 d，分4批次收獲）。于第2及第4天分別給DC培養瓶補加人DC細胞完全培養液，第6天對未成熟DC細胞進行iAPA因子的轉染（按操作說明書進行）：將DC細胞刮起后收集懸液，用15 mL DC細胞培養液溶解iAPA因子（細胞因子用量為10 000 vp/cell后與細胞懸液混勻并鋪回培養瓶中，置回孵箱中過夜培養孵育12 h后收獲。第7天，將培養瓶中全部細胞刮起，收集懸液，離心(1 400 r/min離心8 min，離心半徑178 mm)、生理鹽水重懸，進行計數，調整細胞密度為5×105個/0.2 mL備用[4]。于第4及第6天分別給CTL培養瓶補加含T細胞因子的培養基，視情況分瓶，第7天收獲。用20%人血白蛋白5 mL加入100 mL生理鹽水中制成洗液，CTL懸液離心(1 800 r/min離心8 min，離心半徑178 mm)棄上清，加入上述洗液洗滌1次，再加入洗液吹勻后計數，調整細胞密度為3×107個/0.2 mL備用[4]。
1.3.3 實驗分組與治療
待裸鼠皮下接種人肝癌細胞系SMMC-7721后2～3周，裸鼠的皮下移植瘤生長到直徑大于0.5 cm時，將實驗裸鼠隨機(對12只造模成功的裸鼠依次編號，從隨機數字表中任選一組隨機數字與之對應，后將隨機數字從小到大排序，序號1～6為第1組，序號7～12為第2組)均分為2組：生理鹽水對照組（簡稱對照組）和iAPA-DC/CTL細胞治療組（iAPA-DC/CTL組），每組6只。于肝癌細胞接種后第3周開始進行治療，每周治療1次，首次治療前分別測量每只裸鼠瘤塊的長短徑，后每3天觀察腫瘤生長情況，治療共進行4次：第1次治療對照組行生理鹽水瘤塊內注射0.2 mL/鼠、尾靜脈注射0.4 mL/鼠；iAPA-DC/CTL組行瘤塊內注射iAPA-DC 0.2 mL/鼠、尾靜脈注射iAPA-DC及CTL各0.2 mL/鼠。2組裸鼠在第1次治療后的第1、2、3周分別再次治療：對照組每次行尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL/鼠，iAPA-DC/CTL組每次行尾靜脈注射CTL 0.2 mL/鼠。
1.4 觀察指標
1.4.1 抑瘤率
觀察2組裸鼠的腫瘤生長情況，數顯卡尺測量瘤塊最長徑(L)、寬徑(W)及高徑(H)，按照下列公式計算腫瘤的近似體積（V）[5]并描繪腫瘤生長曲線：
| $ V=\frac{4}{3}\pi \times \frac{L}{2} \times \frac{W}{2} \times \frac{H}{2} $ |
在最后1次注射治療1周后，頸椎脫臼法處死2組裸鼠，剝離裸鼠皮下的移植瘤塊，照相并用電子天平稱重，按下列公式計算抑瘤率[6]：
| $抑瘤率=\frac{{對照組平均瘤重-細胞治療組平均瘤重}}{{對照組平均瘤重}} \times 100\% $ |
1.4.2 病理學檢測
用4%的多聚甲醛固定裸鼠皮下移植瘤，常規石蠟包埋后制作切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹脂封片，普通光學顯微鏡下行病理形態學觀察。
1.4.3 免疫組化檢測
采用MaxVisionTM即用型快捷免疫組化法檢測裸鼠皮下移植瘤中Glypican-3、Hepatocyte、Survivin及T淋巴細胞的表達；另行T淋巴細胞計數：采用盲法進行，低倍鏡（×100，Olympus雙目顯微鏡）下選取染色最密集的視野，高倍鏡（×400）下進行計數，每例計數3個視野，并求平均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS 20.0統計軟件行統計分析。計量資料以均數±標準差(
2 結果
2.1 移植瘤模型的構建和使用
14只裸鼠右腹股溝區皮下分別接種SMMC-7721肝癌細胞1×106個/0.2 mL，10 d后接種部位陸續觀察到新生物長出，接種后10～14 d有1只裸鼠接種區始終未見明顯新生物生長，接種后15～21 d有1只裸鼠皮下結節自行消退，故剔除該2只，余12只裸鼠均達到成瘤標準，后期未見腫瘤自行消退，造模成功率為85.71%；分組實驗過程中，無裸鼠死亡。在第4次免疫治療后1周，處死2組裸鼠，并完整剝取皮下移植瘤。
2.2 移植瘤HE染色鏡檢及免疫組化染色檢測結果
石蠟切片經HE染色后可見細胞呈圓梭形，細胞核大小不一，核漿比例較大，雙核和多核瘤巨細胞多見，核分裂多見，具有典型的腫瘤細胞特征（圖 1）。免疫組化染色檢測出腫瘤細胞Glypican-3、Hepatocyte及Survivin均呈陽性表達，即細胞漿呈黃色或棕黃色，細胞核為藍色（圖 2）。
圖1
示裸鼠皮下移植瘤組織病理形態學改變(HE×200)??圖 2示裸鼠皮下移植瘤組織細胞Glypican-3、Hepatocyte和Survivin呈陽性表達(免疫組織化學染色×200)。2A:Glypican-3;2B:Hepatocyte; 2C:Survivin??圖 3示2組裸鼠皮下移植瘤生長曲線??圖 4示實驗結束后剝取的2組裸鼠皮下移植瘤。4A:對照組; 4B:iAPA-DC/CTL組??圖 5示iAPA-DC/CTL組裸鼠皮下移植瘤T淋巴細胞呈陽性表達(免疫組織化學染色×400)
2.3 2組裸鼠腫瘤生長情況
2組裸鼠分別行生理鹽水和iAPA-DC/CTL注射治療后，隨著飼養時間的延長，從皮下瘤外觀上觀察，對照組裸鼠右側腹股溝皮下腫瘤呈進行性生長，而iAPA-DC/CTL組裸鼠腫瘤的生長明顯受到抑制（圖 3）。實驗結束時，對照組和iAPA-DC/CTL組的腫瘤體積分別為（3 661.48±322.59）和（2 725.36±252.65）mm3，iAPA-DC/CTL組的腫瘤體積小于對照組，差異有統計學意義（t=5.62，P < 0.05）。
2.4 2組腫瘤重量及抑瘤率檢測結果
剝取腫瘤見有纖維包膜、紫紅色、呈大結節狀生長（圖 4），質地較軟，切面呈魚肉狀，未見明顯壞死。棄去脂肪和結締組織后稱重，對照組和iAPA-DC/CTL組的平均瘤重分別為：(1.97±0.21)和(1.38±0.14) g，iAPA-DC/CTL組的腫瘤重量輕于對照組，差異有統計學意義(t=5.73，P < 0.05)。行iAPA-DC/CTL治療后的抑瘤率為29.95%。
2.5 移植瘤淋巴細胞計數
石蠟切片經免疫組化染色后于腫瘤間質中可見CD8免疫陽性表達的T淋巴細胞：細胞膜和細胞漿呈黃色或棕黃色，細胞核為藍色（圖 5）。對照組未檢測到T淋巴細胞，iAPA-DC/CTL組的T淋巴細胞數為（54.24±5.31）個/高倍視野，2組間的差異有統計學意義(t=25.02，P < 0.05)。
3 討論
裸鼠是一種先天性胸腺缺陷動物，選其作為異種腫瘤移植實驗鼠，具有方法簡單、無需作特殊前處理、成瘤周期短、成瘤率高、移植傳代后的腫瘤組織仍保留其原有的生物學特性等優點，因而目前廣泛應用于人類腫瘤的基礎理論和臨床治療的實驗性研究。本研究選用4～6周齡雄性BALB/c-nu小鼠皮下接種SMMC-7721肝癌細胞1×106個/鼠建立人肝癌皮下移植瘤模型，成瘤率為85.71%，筆者認為，若增大肝癌細胞的接種劑量，此成瘤率可以進一步提高，但有發生移植瘤生長過快、失控的可能。本研究中，移植瘤切片HE染色鏡檢具有典型的腫瘤細胞特征，免疫組化染色檢測發現腫瘤細胞Glypican-3、Hepatocyte及Survivin[7]均呈陽性表達。以上實驗結果證實裸鼠皮下移植瘤為來源于肝癌組織的肝細胞癌，保留了肝癌原有的生物學特性，造模成功。
DC是體內功能最強的抗原提呈細胞（APC）[8-10]，在腫瘤免疫中具有重要的作用[11-14]。其具有強大的激活CD8+ CTL及CD4+輔助T淋巴細胞(Th)的能力[15]。肝癌的發生、發展與細胞免疫功能變化密切相關[16]。宿主免疫功能低下或免疫耐受，或APC提呈功能降低等因素，使腫瘤細胞逃避宿主免疫系統的攻擊，是腫瘤形成的重要機理。已有研究[17-18]證明了同源DC疫苗的安全性和有效性。本研究使用了以DC為基礎的細胞免疫療法，也證實經過一個治療周期后，iAPA-DC/CTL組的腫瘤生長速度、腫瘤體積和腫瘤重量均明顯低于對照組，提示iAPA-DC/CTL能夠有效抑制人肝癌皮下移植瘤的生長。
iAPA技術可通過靶向性抑制機體內免疫細胞信號傳導通路中關鍵性抑制因子來提高腫瘤細胞治療的效率，其核心是采用小干擾核糖核酸（siRNA）特異性阻斷抗原提呈細胞（如DC）和淋巴細胞中關鍵的負調節因子（如SOCS1基因），使其基因表達沉默，誘導機體突破自身對腫瘤的免疫耐受，增強抗原特異性免疫反應[19-27]。本研究中，經包含有抑制SOCS1的siRNA、腫瘤抗原Survivin及muc1、鞭毛蛋白基因的iAPA因子轉染DC后，可阻斷DC的免疫負調節通路，強力激活并顯著促進DC成熟，增強腫瘤特異性抗原呈遞能力并致敏抗原特異性CTL，從而有效發揮抗腫瘤免疫治療的效果。經iAPA技術處理的同源DC和CTL回輸體內后，一方面回輸抗原特異性CTL可直接殺傷腫瘤細胞，體現近期療效；另一方面，iAPA-DC可有效激活機體的自身免疫系統，打破機體對自身腫瘤的免疫耐受，對抑制腫瘤生長與轉移的長期療效起到重要作用。本研究發現，iAPA-DC/CTL組瘤體內可見CD8免疫陽性的T淋巴細胞分布，而對照組中未見，也證實了iAPA-DC經瘤體局部和靜脈注射后，可有效提呈腫瘤抗原，并趨向引導經靜脈注射的CTL向瘤體組織遷移，從而產生殺滅腫瘤細胞和抑制腫瘤生長的作用。本研究結果為肝癌iAPA-DC/CTL治療的進一步深入研究及今后的臨床廣泛應用奠定了良好的基礎。
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝臟最常見的原發性惡性腫瘤[1]，其發病隱匿，病程較短，病死率較高。目前，免疫治療已成為治療肝癌的新手段[2]。研究表明，以樹突狀細胞（DC）為基礎的免疫療法是當今腫瘤治療中最有價值也是最有前途的方法之一[3]。沉默免疫負調控基因（inhibition of antigen-presentation attenuators, iAPA）技術，是一種新型的腫瘤免疫細胞治療技術，目前臨床報道很少，人肝癌-裸鼠模型是目前實驗中最能反映人類肝癌生物學特性的“活試管”。本研究旨在觀察經iAPA技術處理的DC聯合細胞毒性T淋巴細胞（CTL）即iAPA-DC/CTL對SMMC-7721細胞裸鼠皮下移植瘤抑制作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
人肝癌細胞系SMMC-7721由湖北醫藥學院附屬東風醫院肝臟外科研究所凍存、饋贈，20%人血白蛋白（瑞士杰特貝林生物制品有限公司），淋巴細胞分離液（天津生物制品研究所），人DC細胞完全培養液、無血清培養基、含T細胞因子培養基、CD3包被的150 cm2培養瓶及iAPA因子均由北京英默生物科技有限公司協助提供，SPF級4～6周齡健康BALB/c-nu小鼠14只，均為雄性，購自北京阜康生物科技股份有限公司，鼠抗人Glypican-3及Hepatocyte單克隆抗體、兔抗人Survivin多克隆抗體、兔抗人CD8單克隆抗體、即用型快捷免疫組化MaxVision?TM試劑盒和DAB染色液購自邁新公司。
1.2 主要器材
CS-3000型血細胞分離機，Thermo 5%及7.5% CO2培養箱，湘儀L-530離心機，阿爾泰BHC-1300-ⅡA2生物安全柜，三豐573-191-20低測力數顯卡尺，Sartorius BS210S電子天平，Olympus CKX41顯微鏡，以及SPF級動物實驗室均由湖北醫藥學院實驗動物中心提供。
1.3 實驗方法
本研究經醫院倫理委員會批準，提供血細胞的健康志愿者在實施前已簽定知情同意書。
1.3.1 人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立
復蘇凍存的人肝癌細胞系SMMC-7721，進行傳代培養。取對數生長期的SMMC-7721肝癌細胞2×107個，用0.02％EDTA-0.125％胰酶消化，PBS洗滌細胞2次，1 500 r/min離心5 min（離心半徑160 mm）后收集細胞，用0.9％生理鹽水重懸細胞、定容。以1×106個細胞/0.2 mL局部注射接種于每只裸小鼠右腹股溝皮下，以后每3天觀察成瘤情況，以皮下結節直徑超過0.5 cm為成瘤標準。
1.3.2 iAPA-DC/CTL的制備
血細胞分離機采集健康志愿者的血細胞懸液20 mL，生理鹽水稀釋后2 000 r/min離心15 min（離心半徑178 mm），棄血漿層，生理鹽水重懸至35 mL，緩慢加至15 mL的淋巴細胞分離液上層，Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，對白膜層細胞進行無血清培養。末次離心(1 400 r/min離心8 min，離心半徑178 mm)后，用無血清培養液重懸細胞沉淀至30 mL，鋪于75 cm2的培養瓶，置37℃、5%CO2培養箱中貼壁培養30 min；后晃下貼壁不牢的細胞，吸出細胞懸液，培養瓶中加人DC細胞完全培養液（15 mL/瓶），置于37℃、5%CO2培養箱中，作為DC培養（共7 d）。未貼壁的細胞懸液，加入CD3包被的150 cm2培養瓶中，補加含T細胞因子的培養基70 mL，置于37℃、7.5%CO2培養箱中，作為CTL培養（共28 d，分4批次收獲）。于第2及第4天分別給DC培養瓶補加人DC細胞完全培養液，第6天對未成熟DC細胞進行iAPA因子的轉染（按操作說明書進行）：將DC細胞刮起后收集懸液，用15 mL DC細胞培養液溶解iAPA因子（細胞因子用量為10 000 vp/cell后與細胞懸液混勻并鋪回培養瓶中，置回孵箱中過夜培養孵育12 h后收獲。第7天，將培養瓶中全部細胞刮起，收集懸液，離心(1 400 r/min離心8 min，離心半徑178 mm)、生理鹽水重懸，進行計數，調整細胞密度為5×105個/0.2 mL備用[4]。于第4及第6天分別給CTL培養瓶補加含T細胞因子的培養基，視情況分瓶，第7天收獲。用20%人血白蛋白5 mL加入100 mL生理鹽水中制成洗液，CTL懸液離心(1 800 r/min離心8 min，離心半徑178 mm)棄上清，加入上述洗液洗滌1次，再加入洗液吹勻后計數，調整細胞密度為3×107個/0.2 mL備用[4]。
1.3.3 實驗分組與治療
待裸鼠皮下接種人肝癌細胞系SMMC-7721后2～3周，裸鼠的皮下移植瘤生長到直徑大于0.5 cm時，將實驗裸鼠隨機(對12只造模成功的裸鼠依次編號，從隨機數字表中任選一組隨機數字與之對應，后將隨機數字從小到大排序，序號1～6為第1組，序號7～12為第2組)均分為2組：生理鹽水對照組（簡稱對照組）和iAPA-DC/CTL細胞治療組（iAPA-DC/CTL組），每組6只。于肝癌細胞接種后第3周開始進行治療，每周治療1次，首次治療前分別測量每只裸鼠瘤塊的長短徑，后每3天觀察腫瘤生長情況，治療共進行4次：第1次治療對照組行生理鹽水瘤塊內注射0.2 mL/鼠、尾靜脈注射0.4 mL/鼠；iAPA-DC/CTL組行瘤塊內注射iAPA-DC 0.2 mL/鼠、尾靜脈注射iAPA-DC及CTL各0.2 mL/鼠。2組裸鼠在第1次治療后的第1、2、3周分別再次治療：對照組每次行尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL/鼠，iAPA-DC/CTL組每次行尾靜脈注射CTL 0.2 mL/鼠。
1.4 觀察指標
1.4.1 抑瘤率
觀察2組裸鼠的腫瘤生長情況，數顯卡尺測量瘤塊最長徑(L)、寬徑(W)及高徑(H)，按照下列公式計算腫瘤的近似體積（V）[5]并描繪腫瘤生長曲線：
| $ V=\frac{4}{3}\pi \times \frac{L}{2} \times \frac{W}{2} \times \frac{H}{2} $ |
在最后1次注射治療1周后，頸椎脫臼法處死2組裸鼠，剝離裸鼠皮下的移植瘤塊，照相并用電子天平稱重，按下列公式計算抑瘤率[6]：
| $抑瘤率=\frac{{對照組平均瘤重-細胞治療組平均瘤重}}{{對照組平均瘤重}} \times 100\% $ |
1.4.2 病理學檢測
用4%的多聚甲醛固定裸鼠皮下移植瘤，常規石蠟包埋后制作切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹脂封片，普通光學顯微鏡下行病理形態學觀察。
1.4.3 免疫組化檢測
采用MaxVisionTM即用型快捷免疫組化法檢測裸鼠皮下移植瘤中Glypican-3、Hepatocyte、Survivin及T淋巴細胞的表達；另行T淋巴細胞計數：采用盲法進行，低倍鏡（×100，Olympus雙目顯微鏡）下選取染色最密集的視野，高倍鏡（×400）下進行計數，每例計數3個視野，并求平均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS 20.0統計軟件行統計分析。計量資料以均數±標準差(
2 結果
2.1 移植瘤模型的構建和使用
14只裸鼠右腹股溝區皮下分別接種SMMC-7721肝癌細胞1×106個/0.2 mL，10 d后接種部位陸續觀察到新生物長出，接種后10～14 d有1只裸鼠接種區始終未見明顯新生物生長，接種后15～21 d有1只裸鼠皮下結節自行消退，故剔除該2只，余12只裸鼠均達到成瘤標準，后期未見腫瘤自行消退，造模成功率為85.71%；分組實驗過程中，無裸鼠死亡。在第4次免疫治療后1周，處死2組裸鼠，并完整剝取皮下移植瘤。
2.2 移植瘤HE染色鏡檢及免疫組化染色檢測結果
石蠟切片經HE染色后可見細胞呈圓梭形，細胞核大小不一，核漿比例較大，雙核和多核瘤巨細胞多見，核分裂多見，具有典型的腫瘤細胞特征（圖 1）。免疫組化染色檢測出腫瘤細胞Glypican-3、Hepatocyte及Survivin均呈陽性表達，即細胞漿呈黃色或棕黃色，細胞核為藍色（圖 2）。
圖1
示裸鼠皮下移植瘤組織病理形態學改變(HE×200)??圖 2示裸鼠皮下移植瘤組織細胞Glypican-3、Hepatocyte和Survivin呈陽性表達(免疫組織化學染色×200)。2A:Glypican-3;2B:Hepatocyte; 2C:Survivin??圖 3示2組裸鼠皮下移植瘤生長曲線??圖 4示實驗結束后剝取的2組裸鼠皮下移植瘤。4A:對照組; 4B:iAPA-DC/CTL組??圖 5示iAPA-DC/CTL組裸鼠皮下移植瘤T淋巴細胞呈陽性表達(免疫組織化學染色×400)
2.3 2組裸鼠腫瘤生長情況
2組裸鼠分別行生理鹽水和iAPA-DC/CTL注射治療后，隨著飼養時間的延長，從皮下瘤外觀上觀察，對照組裸鼠右側腹股溝皮下腫瘤呈進行性生長，而iAPA-DC/CTL組裸鼠腫瘤的生長明顯受到抑制（圖 3）。實驗結束時，對照組和iAPA-DC/CTL組的腫瘤體積分別為（3 661.48±322.59）和（2 725.36±252.65）mm3，iAPA-DC/CTL組的腫瘤體積小于對照組，差異有統計學意義（t=5.62，P < 0.05）。
2.4 2組腫瘤重量及抑瘤率檢測結果
剝取腫瘤見有纖維包膜、紫紅色、呈大結節狀生長（圖 4），質地較軟，切面呈魚肉狀，未見明顯壞死。棄去脂肪和結締組織后稱重，對照組和iAPA-DC/CTL組的平均瘤重分別為：(1.97±0.21)和(1.38±0.14) g，iAPA-DC/CTL組的腫瘤重量輕于對照組，差異有統計學意義(t=5.73，P < 0.05)。行iAPA-DC/CTL治療后的抑瘤率為29.95%。
2.5 移植瘤淋巴細胞計數
石蠟切片經免疫組化染色后于腫瘤間質中可見CD8免疫陽性表達的T淋巴細胞：細胞膜和細胞漿呈黃色或棕黃色，細胞核為藍色（圖 5）。對照組未檢測到T淋巴細胞，iAPA-DC/CTL組的T淋巴細胞數為（54.24±5.31）個/高倍視野，2組間的差異有統計學意義(t=25.02，P < 0.05)。
3 討論
裸鼠是一種先天性胸腺缺陷動物，選其作為異種腫瘤移植實驗鼠，具有方法簡單、無需作特殊前處理、成瘤周期短、成瘤率高、移植傳代后的腫瘤組織仍保留其原有的生物學特性等優點，因而目前廣泛應用于人類腫瘤的基礎理論和臨床治療的實驗性研究。本研究選用4～6周齡雄性BALB/c-nu小鼠皮下接種SMMC-7721肝癌細胞1×106個/鼠建立人肝癌皮下移植瘤模型，成瘤率為85.71%，筆者認為，若增大肝癌細胞的接種劑量，此成瘤率可以進一步提高，但有發生移植瘤生長過快、失控的可能。本研究中，移植瘤切片HE染色鏡檢具有典型的腫瘤細胞特征，免疫組化染色檢測發現腫瘤細胞Glypican-3、Hepatocyte及Survivin[7]均呈陽性表達。以上實驗結果證實裸鼠皮下移植瘤為來源于肝癌組織的肝細胞癌，保留了肝癌原有的生物學特性，造模成功。
DC是體內功能最強的抗原提呈細胞（APC）[8-10]，在腫瘤免疫中具有重要的作用[11-14]。其具有強大的激活CD8+ CTL及CD4+輔助T淋巴細胞(Th)的能力[15]。肝癌的發生、發展與細胞免疫功能變化密切相關[16]。宿主免疫功能低下或免疫耐受，或APC提呈功能降低等因素，使腫瘤細胞逃避宿主免疫系統的攻擊，是腫瘤形成的重要機理。已有研究[17-18]證明了同源DC疫苗的安全性和有效性。本研究使用了以DC為基礎的細胞免疫療法，也證實經過一個治療周期后，iAPA-DC/CTL組的腫瘤生長速度、腫瘤體積和腫瘤重量均明顯低于對照組，提示iAPA-DC/CTL能夠有效抑制人肝癌皮下移植瘤的生長。
iAPA技術可通過靶向性抑制機體內免疫細胞信號傳導通路中關鍵性抑制因子來提高腫瘤細胞治療的效率，其核心是采用小干擾核糖核酸（siRNA）特異性阻斷抗原提呈細胞（如DC）和淋巴細胞中關鍵的負調節因子（如SOCS1基因），使其基因表達沉默，誘導機體突破自身對腫瘤的免疫耐受，增強抗原特異性免疫反應[19-27]。本研究中，經包含有抑制SOCS1的siRNA、腫瘤抗原Survivin及muc1、鞭毛蛋白基因的iAPA因子轉染DC后，可阻斷DC的免疫負調節通路，強力激活并顯著促進DC成熟，增強腫瘤特異性抗原呈遞能力并致敏抗原特異性CTL，從而有效發揮抗腫瘤免疫治療的效果。經iAPA技術處理的同源DC和CTL回輸體內后，一方面回輸抗原特異性CTL可直接殺傷腫瘤細胞，體現近期療效；另一方面，iAPA-DC可有效激活機體的自身免疫系統，打破機體對自身腫瘤的免疫耐受，對抑制腫瘤生長與轉移的長期療效起到重要作用。本研究發現，iAPA-DC/CTL組瘤體內可見CD8免疫陽性的T淋巴細胞分布，而對照組中未見，也證實了iAPA-DC經瘤體局部和靜脈注射后，可有效提呈腫瘤抗原，并趨向引導經靜脈注射的CTL向瘤體組織遷移，從而產生殺滅腫瘤細胞和抑制腫瘤生長的作用。本研究結果為肝癌iAPA-DC/CTL治療的進一步深入研究及今后的臨床廣泛應用奠定了良好的基礎。
