引用本文： 沈宏, 張寧. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T和A1298C位點多態性與胃癌易感性的相關性分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(3): 351-353. doi: 10.7507/1007-9424.20150094 復制
胃癌是一種最常見的消化系統腫瘤，大部分胃癌被發現時已處進展期，其5年生存率為15%～20% [1]。胃癌的病因至今（至2014年）尚未完全清楚，大多數學者[2-4]認為，飲食、感染、慢性炎癥刺激以及遺傳因素均起著重要的作用。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因的主要作用是在葉酸代謝通路中將5,10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸，其包括2個常見的多態性位點：C677T與A1298C位點。有研究[5]發現，MTHFR基因位點的多態性改變可能影響腫瘤的易感性和生物學行為。目前，關于MTHFR基因多態性與胃癌的相關性并未達成共識，故筆者采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術（PCR-RFLP）對MTHFR基因C677T與A1298C位點的基因型進行了檢測分析，旨在探討其與胃癌易感性的關系。
1 臨床資料
1.1 一般資料
回顧性收集2008年1月至2014年1月期間在筆者所在醫院住院的、行MTHFR基因C677T和A1298C位點檢測的160例胃癌患者，所有患者均經活組織病理學檢查證實為胃癌。同時設立對照組（160例），均為同期自愿接受上述基因檢測的健康體檢人員。2組患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史及高脂飲食情況比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性（表 1）。
表1
胃癌組患者和對照組健康人群的一般資料比較
1.2 主要試劑及設備
DNA提取試劑盒、PCR試劑盒、限制性內切酶5 U MspI（MBI）及其他相關試劑均購自天津賽爾生物技術公司。設備：Bio-Rad熱循環儀（T100型，美國Bio-rad伯樂公司）、紫外分光光度計（UV-1750型，廣西德爾菲儀器設備有限公司）及凝膠成像系統（Gene Genius，Syngene公司）。
1.3 方法
1.3.1 外周血基因組DNA的提取
采用酚/氯仿法[6]提取2組患者的外周血基因組DNA。提取的基因組DNA經紫外線分光光度計檢測吸光度值（A值），以A260/A280值鑒定基因組DNA的純度和濃度。2組患者的外周血基因組DNA的A260/A280值均在1.8左右，表明基因組DNA純度高，無蛋白質、RNA等污染。符合要求后，將基因組DNA用無菌EP管分裝，在-80 ℃條件下保存。
1.3.2 多態性位點引物設計
根據MTHFR基因C677T位點和A1298C位點對應的基因序列分別設計PCR擴增引物。C677T位點的上游引物為5′-CGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTG-3′，下游引物為5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，擴增長度為198 bp。A1298C位點的上游引物為5′-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3′，下游引物為：5′-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3′，擴增長度為163 bp。所有的引物均由上海捷瑞公司合成。
1.3.3 PCR反應體系及反應條件
PCR反應體系為25.0 μL體系：取2.0 μL基因組DNA，0.4 μmol/mL的上下游引物各1.0 μL，10×PCR緩沖液2.7 μL，1.5 mmol/mL的MgCl2 2.0 μL，1.5 U Tag酶12.5 μL，100 μmol/mL的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP） 0.6 μL，再以雙蒸水（ddH2O）補足至25.0 μL。采用Bio-Rad熱循環儀進行PCR擴增。反應條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性40 s，63 ℃復性55 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環；最后再72 ℃延伸7 min。
1.3.4 限制性酶切
酶切反應體系為25.0 μL體系：PCR產物5.0 μL，10×PCR緩沖液3.5 μL，MBI 5.0 μL，以ddH2O補足至25.0 μL。在37 ℃條件下水浴過夜。將酶切產物行2%瓊脂糖凝膠電泳（120 V、30 min），根據電泳條帶數判斷基因型。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0統計學軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
1.5 結果
MTHFR基因C677T位點的基因型包括CC、CT及TT型，A1298C位點包括AA、AC及CC型。2組C677T和A1298C位點的基因型分布情況見表 2。由表 2可見，胃癌組C677T和A1298C位點的基因型分布與對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05），提示MTHFR基因C677T和A1298C位點與胃癌的易感性均無明顯關聯。
表2
2組MTHFR基因C677T位點和A1298C位點基因型的分布情況（例）
2 討論
在我國，胃癌的發病率約為29.9/10萬，是僅次于肺癌的第二高發腫瘤，其死亡率約為22.3/10萬[7]。其中早期胃癌患者約占胃癌患者總數的10%左右，這與早期胃癌的診斷水平和高危人群的篩查水平較低均有著密切的關系[8]。有流行病學研究[9]結果表明，基因易感性在胃癌的發生與發展過程中扮演著重要的角色，而疾病的發生和發展受多基因調控。因此，探索基因多態性與胃癌的關系對胃癌的早期診斷具有重要的意義。
MTHFR基因定位于1p36.3，包括11個外顯子和10個內含子，cDNA序列全長2.2 kb；現已發現，MTHFR基因有20多種突變位點，其中以C677T和A1298C位點最為常見[10]。然而，在不同國家、不同地區及不同民族中，C677T和A1298C位點的基因型分布有顯著的差異[11]。MTHFR基因的缺陷將導致多種機體基礎生化過程的紊亂，包括DNA復制、細胞周期的調控，以及DNA和蛋白質的甲基化修飾，從而引起心血管疾病、神經管缺陷、癌癥等多種疾病[12]。Meta分析[13]結果表明，MTHFR基因C677T位點的CT變異與乳腺癌的易感性相關，A1298C位點的AC變異與乳腺癌的易感性無關。然而，其與胃癌的相關性仍處于探索階段。本研究結果表明，胃癌組患者MTHFR基因C677T位點和A1298C位點的基因型分布與對照組患者比較差異均無統計學意義（P>0.05）。然而，因納入樣本量有限，這一結果并不能說明整個天津地區、中國甚至亞洲人群的整體情況，需進一步研究。
此外，疾病的發生和發展受多基因位點的調控，機理復雜。目前，已有眾多學者[14-19]報道了不同基因位點多態性與胃癌發生的潛在聯系，主要包括腫瘤壞死因子-α-308 （TNF-α-308）基因、TNF-β基因、端粒酶逆轉錄酶（hTERT）基因、胰島素樣生長因子2受體（IGF2R）基因、p53基因、著色性干皮病基因組（xpc）基因等。其中，hTERT基因rs2853676位點多態性與胃癌的遺傳易感性有關，其可增加胃癌發生的風險[16]。IGF2R基因codon2020位點多態性可能對中國人群罹患胃癌具有保護作用[17]。p53基因Arg72Pro單核苷酸多態性與青海地區人群胃癌的易感性存在相關性，攜帶p53基因Arg72Pro野生型純合子（Arg/Arg）可能是青海地區人群罹患胃癌的危險因素[18]。目前多認為，TNF-α-308基因、TNF-β基因及xpc基因多態性與胃癌的發生均無顯著相關性[14-15, 19]。本研究結果發現，MTHFR基因C677T和A1298C位點的基因型分布與胃癌的易感性亦無顯著相關性。在基因水平，胃癌的發生可能受多基因調控，不同的基因位點可能起到協同或拮抗的作用。目前的研究結果仍不能說明某一個基因位點多態性即能導致胃癌的發生，其必然是多基因調控的結果，且其真實的作用機理仍需大量研究證實。
總之，MTHFR基因位點的多態性與多種腫瘤的發生存在關聯[20-22]，MTHFR基因不同位點多態性與胃癌易感性的關系仍在探索階段。本研究結果表明，MTHFR基因C677T和A1298C位點多態性與胃癌易感性不存在相關性。然而，非隨機抽樣、有限的樣本量及腫瘤誘發因素的多樣性均會影響結果的準確性與代表性，因此該結論仍需大樣本、高質量研究來進一步驗證。
胃癌是一種最常見的消化系統腫瘤，大部分胃癌被發現時已處進展期，其5年生存率為15%～20% [1]。胃癌的病因至今（至2014年）尚未完全清楚，大多數學者[2-4]認為，飲食、感染、慢性炎癥刺激以及遺傳因素均起著重要的作用。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因的主要作用是在葉酸代謝通路中將5,10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸，其包括2個常見的多態性位點：C677T與A1298C位點。有研究[5]發現，MTHFR基因位點的多態性改變可能影響腫瘤的易感性和生物學行為。目前，關于MTHFR基因多態性與胃癌的相關性并未達成共識，故筆者采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術（PCR-RFLP）對MTHFR基因C677T與A1298C位點的基因型進行了檢測分析，旨在探討其與胃癌易感性的關系。
1 臨床資料
1.1 一般資料
回顧性收集2008年1月至2014年1月期間在筆者所在醫院住院的、行MTHFR基因C677T和A1298C位點檢測的160例胃癌患者，所有患者均經活組織病理學檢查證實為胃癌。同時設立對照組（160例），均為同期自愿接受上述基因檢測的健康體檢人員。2組患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史及高脂飲食情況比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性（表 1）。
表1
胃癌組患者和對照組健康人群的一般資料比較
1.2 主要試劑及設備
DNA提取試劑盒、PCR試劑盒、限制性內切酶5 U MspI（MBI）及其他相關試劑均購自天津賽爾生物技術公司。設備：Bio-Rad熱循環儀（T100型，美國Bio-rad伯樂公司）、紫外分光光度計（UV-1750型，廣西德爾菲儀器設備有限公司）及凝膠成像系統（Gene Genius，Syngene公司）。
1.3 方法
1.3.1 外周血基因組DNA的提取
采用酚/氯仿法[6]提取2組患者的外周血基因組DNA。提取的基因組DNA經紫外線分光光度計檢測吸光度值（A值），以A260/A280值鑒定基因組DNA的純度和濃度。2組患者的外周血基因組DNA的A260/A280值均在1.8左右，表明基因組DNA純度高，無蛋白質、RNA等污染。符合要求后，將基因組DNA用無菌EP管分裝，在-80 ℃條件下保存。
1.3.2 多態性位點引物設計
根據MTHFR基因C677T位點和A1298C位點對應的基因序列分別設計PCR擴增引物。C677T位點的上游引物為5′-CGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTG-3′，下游引物為5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，擴增長度為198 bp。A1298C位點的上游引物為5′-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3′，下游引物為：5′-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3′，擴增長度為163 bp。所有的引物均由上海捷瑞公司合成。
1.3.3 PCR反應體系及反應條件
PCR反應體系為25.0 μL體系：取2.0 μL基因組DNA，0.4 μmol/mL的上下游引物各1.0 μL，10×PCR緩沖液2.7 μL，1.5 mmol/mL的MgCl2 2.0 μL，1.5 U Tag酶12.5 μL，100 μmol/mL的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP） 0.6 μL，再以雙蒸水（ddH2O）補足至25.0 μL。采用Bio-Rad熱循環儀進行PCR擴增。反應條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性40 s，63 ℃復性55 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環；最后再72 ℃延伸7 min。
1.3.4 限制性酶切
酶切反應體系為25.0 μL體系：PCR產物5.0 μL，10×PCR緩沖液3.5 μL，MBI 5.0 μL，以ddH2O補足至25.0 μL。在37 ℃條件下水浴過夜。將酶切產物行2%瓊脂糖凝膠電泳（120 V、30 min），根據電泳條帶數判斷基因型。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0統計學軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
1.5 結果
MTHFR基因C677T位點的基因型包括CC、CT及TT型，A1298C位點包括AA、AC及CC型。2組C677T和A1298C位點的基因型分布情況見表 2。由表 2可見，胃癌組C677T和A1298C位點的基因型分布與對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05），提示MTHFR基因C677T和A1298C位點與胃癌的易感性均無明顯關聯。
表2
2組MTHFR基因C677T位點和A1298C位點基因型的分布情況（例）
2 討論
在我國，胃癌的發病率約為29.9/10萬，是僅次于肺癌的第二高發腫瘤，其死亡率約為22.3/10萬[7]。其中早期胃癌患者約占胃癌患者總數的10%左右，這與早期胃癌的診斷水平和高危人群的篩查水平較低均有著密切的關系[8]。有流行病學研究[9]結果表明，基因易感性在胃癌的發生與發展過程中扮演著重要的角色，而疾病的發生和發展受多基因調控。因此，探索基因多態性與胃癌的關系對胃癌的早期診斷具有重要的意義。
MTHFR基因定位于1p36.3，包括11個外顯子和10個內含子，cDNA序列全長2.2 kb；現已發現，MTHFR基因有20多種突變位點，其中以C677T和A1298C位點最為常見[10]。然而，在不同國家、不同地區及不同民族中，C677T和A1298C位點的基因型分布有顯著的差異[11]。MTHFR基因的缺陷將導致多種機體基礎生化過程的紊亂，包括DNA復制、細胞周期的調控，以及DNA和蛋白質的甲基化修飾，從而引起心血管疾病、神經管缺陷、癌癥等多種疾病[12]。Meta分析[13]結果表明，MTHFR基因C677T位點的CT變異與乳腺癌的易感性相關，A1298C位點的AC變異與乳腺癌的易感性無關。然而，其與胃癌的相關性仍處于探索階段。本研究結果表明，胃癌組患者MTHFR基因C677T位點和A1298C位點的基因型分布與對照組患者比較差異均無統計學意義（P>0.05）。然而，因納入樣本量有限，這一結果并不能說明整個天津地區、中國甚至亞洲人群的整體情況，需進一步研究。
此外，疾病的發生和發展受多基因位點的調控，機理復雜。目前，已有眾多學者[14-19]報道了不同基因位點多態性與胃癌發生的潛在聯系，主要包括腫瘤壞死因子-α-308 （TNF-α-308）基因、TNF-β基因、端粒酶逆轉錄酶（hTERT）基因、胰島素樣生長因子2受體（IGF2R）基因、p53基因、著色性干皮病基因組（xpc）基因等。其中，hTERT基因rs2853676位點多態性與胃癌的遺傳易感性有關，其可增加胃癌發生的風險[16]。IGF2R基因codon2020位點多態性可能對中國人群罹患胃癌具有保護作用[17]。p53基因Arg72Pro單核苷酸多態性與青海地區人群胃癌的易感性存在相關性，攜帶p53基因Arg72Pro野生型純合子（Arg/Arg）可能是青海地區人群罹患胃癌的危險因素[18]。目前多認為，TNF-α-308基因、TNF-β基因及xpc基因多態性與胃癌的發生均無顯著相關性[14-15, 19]。本研究結果發現，MTHFR基因C677T和A1298C位點的基因型分布與胃癌的易感性亦無顯著相關性。在基因水平，胃癌的發生可能受多基因調控，不同的基因位點可能起到協同或拮抗的作用。目前的研究結果仍不能說明某一個基因位點多態性即能導致胃癌的發生，其必然是多基因調控的結果，且其真實的作用機理仍需大量研究證實。
總之，MTHFR基因位點的多態性與多種腫瘤的發生存在關聯[20-22]，MTHFR基因不同位點多態性與胃癌易感性的關系仍在探索階段。本研究結果表明，MTHFR基因C677T和A1298C位點多態性與胃癌易感性不存在相關性。然而，非隨機抽樣、有限的樣本量及腫瘤誘發因素的多樣性均會影響結果的準確性與代表性，因此該結論仍需大樣本、高質量研究來進一步驗證。
