引用本文： 楊劍, 娜日蘇, 郭春良. X射線損傷修復交叉互補基因1Arg399Gln、Arg280His和Arg194Trp位點多態性與胃癌易感性的相關性分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(2): 208-211. doi: 10.7507/1007-9424.20150056 復制
胃癌是一種最常見的消化系統腫瘤，大部分胃癌被發現于進展期，其5年生存率僅約為15%～20%[1]。對胃癌的病因至今尚未完全清楚，多認為飲食因素、感染因素、慢性炎癥刺激以及遺傳因素起著重要作用[2]。X射線損傷修復交叉互補基因1（XRCC1）是一種重要的DNA損傷修復基因，其包括Arg339Gln、Arg280His和Arg194Trp 3個常見的多態性位點，其多態性改變可能影響XRCC1蛋白的正常功能，從而降低DNA的修復能力，影響腫瘤的易感性和生物學行為[3]。目前，針對XRCC1基因多態性與胃癌的相關性研究并未達成共識[4-5]。本研究擬采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法檢測Arg399Gln、Arg280His和Arg194Trp基因多態性與胃癌易感性的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選擇2009年1月至2014年1月期間在我院住院的胃癌患者（胃癌組）120例，均經手術活組織病理檢查證實為胃癌。選取120例健康體檢人員且無消化系統疾病病史及腫瘤家族史的自愿者作為對照組，2組資料采用流行病學病例對照研究方法。
1.2 PCR-RFLP方法檢測Arg399Gln、Arg280His和Arg194Trp基因多態性
1.2.1 外周血基因組DNA提取
采用酚/氯仿法提取外周血DNA。提取出的DNA在紫外線分光光度計下讀取吸光度（A）260和A280值以鑒定其純度和濃度。用無菌EP管分裝，-80℃保存。
1.2.2 多態性位點引物設計
根據Arg399Gln位點對應的基因序列，設計PCR擴增引物，上游引物為5’-TTGTGCTTTCTCTGTGTCCA-3’, 下游引物為5’-TC-CTCCAGCCTTTTCTGATA-3’，擴增片段長度為595 bp；根據Arg280His位點對應的基因序列，設計PCR擴增引物，上游引物為5’-CCAGTGGTGCTAACCTAA-TC-3’，下游引物為5’-CACTCAGCACCACTACCAC-A-3’，擴增片段長度為181 bp；Arg194Trp位點對應的基因序列，設計PCR擴增引物，上游引物為5’-GCCAGGGCCCCTCCTFCAA-3’，下游引物為5’-TACCCTCAGACCCACGAGT-3’，擴增片段長度為396 bp。
1.2.3 PCR反應體系及反應條件程序
PCR反應體系為25μL，取2～10 ng基因組DNA，每種引物0.4μmol/mL，10×PCR緩沖液2.7μL，1.5 mmol/mL MgCl2，1.5 U Tag酶，100μmol/mL dNTP，采用Bio-Rad熱循環儀。反應條件為94℃預變性4 min，94℃變性40 s，63℃復性55 s，72℃延伸40 s，35個循環，最后再72℃延伸7 min。
1.2.4 限制性酶切
酶切反應體系為20μL，其中PCR產物5μL，10×PCR緩沖液3.5μL，限制性內切酶MspⅠ(MBI) 5 U，37℃水浴過夜，酶切產物于2%瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V，30 min），根據電泳條帶數判斷基因型。
1.3 統計學方法
使用SPSS 16.0軟件處理數據。采用Mann-Whitney檢驗比較2組之間年齡分布差異，采用卡方檢驗比較性別、吸煙、飲酒以及各基因型分布的差異，計量資料用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 胃癌組與對照組的基本特征
2組在性別、年齡、有無吸煙史、飲酒史、飲食特點等常見暴露因素比較，差異均無統計學意義（P > 0.05），見表 1。
表1
胃癌組與對照組的一般資料比較
2.2 胃癌組與對照組XRCC1基因194、280及399位點基因型分布
①胃癌組患者的XRCC1基因194位點Arg/Arg多態基因型出現頻率低于對照組（P < 0.05），Arg/Trp、Trp/Trp多態基因型出現頻率均明顯高于對照組（P < 0.05），Arg/Trp+Trp/Trp變異型基因出現頻率也明顯高于對照組（P < 0.05）。②胃癌組患者的XRCC1基因280位點Arg/Arg、Arg/His、His/His多態基因型及Arg/His+His/His變異基因型與對照組比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。③胃癌組患者的XRCC1基因399位點Arg/Arg、Arg/Gln、Gln/Gln多態基因型及Arg/Gln+Gln/Gln變異基因型出現頻率與對照組比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2
表2
各位點基因多態型在2組中的分布情況〔例（%）〕
3 討論
在我國，胃癌的發病率約為29.9/10萬，是僅次于肺癌的第二高發腫瘤，其死亡率約為22.3/10萬[6-7]，其中早期胃癌患者約僅占總胃癌患者的10%左右，這與早期胃癌的診斷水平和高危人群的篩查水平較低有著密切關系[8]。流行病學研究[9-12]表明，基因易感性在胃癌的發生、發展過程中扮演著重要的角色。因此，探索基因多態性與胃癌的相關性對胃癌的早期診斷具有重要的意義。
XRCC1是一種參與DNA損傷修復的重要基因。目前研究發現，XRCC1基因主要存在3個常見的多態性位點，它們分別是第10外顯子G28152A（Arg399Gln）、第9外顯子C27466A（Arg280His）及第6外顯子C26304T（Arg194Trp）。堿基損傷、無堿基位點和單鏈斷裂可以由內源性活性物質和DNA錯配復制持續產生[3]。XRCC1改變可能改變基因組的穩定性，進而導致疾病或癌癥[13-14]。目前已有研究[15-17]發現，XRCC1與乳腺癌、食管癌、結直腸癌等多種癌癥的發生存在著相關性。然而，循證醫學及流行病學證據至今仍沒有確定XRCC1變異與癌癥發生的確切關系，這與研究中人群的基因差異有關[4, 18-19]，如觀察到亞洲人群突變純合子Arg280His與乳腺癌有關，但在高加索人群中卻沒有被發現[20]。突變純合子Arg194Trp在亞洲人群中能增加罹患肺癌的風險，但在高加索人群中能降低這種風險[21]。本研究中在胃癌組中Arg399Gln與Arg280His基因位點的變異基因型出現頻率與對照組相比差異均無統計學意義（P > 0.05），結果提示，Arg399Gln與Arg280His位點多態性與胃癌的易感性無關；而Arg194Trp變異基因型在胃癌組出現的頻率顯著高于對照組，Arg194Trp純合基因型在胃癌組出現的頻率顯著低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），結果提示，Arg194Trp位點變異基因型能增加胃癌的易感性，而Arg194Trp位點純合基因型可能對胃癌的發生具有潛在的保護作用。然而，因納入樣本量有限，這一結果并不能說明整個地區、中國及亞洲人群的整體情況，因為不同人種的基因多態性也存在著一定差異[22]。
總之，XRCC1作為一種DNA損傷修復基因，其多態性與多種腫瘤的發生有關。XRCC1三種不同位點基因多態性與胃癌易感性的關系仍存在很大爭議。從本研究的初步研究結果提示，XRCC1 Arg194Trp位點基因多態性與胃癌易感性有關，這可能為基因診斷胃癌提供了一定的理論依據。然而非隨機抽樣、有限的樣本量及腫瘤誘發因素的多樣性均會影響結果的準確性與代表性，因此仍需大樣本高質量研究來驗證這一結果。
胃癌是一種最常見的消化系統腫瘤，大部分胃癌被發現于進展期，其5年生存率僅約為15%～20%[1]。對胃癌的病因至今尚未完全清楚，多認為飲食因素、感染因素、慢性炎癥刺激以及遺傳因素起著重要作用[2]。X射線損傷修復交叉互補基因1（XRCC1）是一種重要的DNA損傷修復基因，其包括Arg339Gln、Arg280His和Arg194Trp 3個常見的多態性位點，其多態性改變可能影響XRCC1蛋白的正常功能，從而降低DNA的修復能力，影響腫瘤的易感性和生物學行為[3]。目前，針對XRCC1基因多態性與胃癌的相關性研究并未達成共識[4-5]。本研究擬采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法檢測Arg399Gln、Arg280His和Arg194Trp基因多態性與胃癌易感性的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選擇2009年1月至2014年1月期間在我院住院的胃癌患者（胃癌組）120例，均經手術活組織病理檢查證實為胃癌。選取120例健康體檢人員且無消化系統疾病病史及腫瘤家族史的自愿者作為對照組，2組資料采用流行病學病例對照研究方法。
1.2 PCR-RFLP方法檢測Arg399Gln、Arg280His和Arg194Trp基因多態性
1.2.1 外周血基因組DNA提取
采用酚/氯仿法提取外周血DNA。提取出的DNA在紫外線分光光度計下讀取吸光度（A）260和A280值以鑒定其純度和濃度。用無菌EP管分裝，-80℃保存。
1.2.2 多態性位點引物設計
根據Arg399Gln位點對應的基因序列，設計PCR擴增引物，上游引物為5’-TTGTGCTTTCTCTGTGTCCA-3’, 下游引物為5’-TC-CTCCAGCCTTTTCTGATA-3’，擴增片段長度為595 bp；根據Arg280His位點對應的基因序列，設計PCR擴增引物，上游引物為5’-CCAGTGGTGCTAACCTAA-TC-3’，下游引物為5’-CACTCAGCACCACTACCAC-A-3’，擴增片段長度為181 bp；Arg194Trp位點對應的基因序列，設計PCR擴增引物，上游引物為5’-GCCAGGGCCCCTCCTFCAA-3’，下游引物為5’-TACCCTCAGACCCACGAGT-3’，擴增片段長度為396 bp。
1.2.3 PCR反應體系及反應條件程序
PCR反應體系為25μL，取2～10 ng基因組DNA，每種引物0.4μmol/mL，10×PCR緩沖液2.7μL，1.5 mmol/mL MgCl2，1.5 U Tag酶，100μmol/mL dNTP，采用Bio-Rad熱循環儀。反應條件為94℃預變性4 min，94℃變性40 s，63℃復性55 s，72℃延伸40 s，35個循環，最后再72℃延伸7 min。
1.2.4 限制性酶切
酶切反應體系為20μL，其中PCR產物5μL，10×PCR緩沖液3.5μL，限制性內切酶MspⅠ(MBI) 5 U，37℃水浴過夜，酶切產物于2%瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V，30 min），根據電泳條帶數判斷基因型。
1.3 統計學方法
使用SPSS 16.0軟件處理數據。采用Mann-Whitney檢驗比較2組之間年齡分布差異，采用卡方檢驗比較性別、吸煙、飲酒以及各基因型分布的差異，計量資料用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 胃癌組與對照組的基本特征
2組在性別、年齡、有無吸煙史、飲酒史、飲食特點等常見暴露因素比較，差異均無統計學意義（P > 0.05），見表 1。
表1
胃癌組與對照組的一般資料比較
2.2 胃癌組與對照組XRCC1基因194、280及399位點基因型分布
①胃癌組患者的XRCC1基因194位點Arg/Arg多態基因型出現頻率低于對照組（P < 0.05），Arg/Trp、Trp/Trp多態基因型出現頻率均明顯高于對照組（P < 0.05），Arg/Trp+Trp/Trp變異型基因出現頻率也明顯高于對照組（P < 0.05）。②胃癌組患者的XRCC1基因280位點Arg/Arg、Arg/His、His/His多態基因型及Arg/His+His/His變異基因型與對照組比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。③胃癌組患者的XRCC1基因399位點Arg/Arg、Arg/Gln、Gln/Gln多態基因型及Arg/Gln+Gln/Gln變異基因型出現頻率與對照組比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2
表2
各位點基因多態型在2組中的分布情況〔例（%）〕
3 討論
在我國，胃癌的發病率約為29.9/10萬，是僅次于肺癌的第二高發腫瘤，其死亡率約為22.3/10萬[6-7]，其中早期胃癌患者約僅占總胃癌患者的10%左右，這與早期胃癌的診斷水平和高危人群的篩查水平較低有著密切關系[8]。流行病學研究[9-12]表明，基因易感性在胃癌的發生、發展過程中扮演著重要的角色。因此，探索基因多態性與胃癌的相關性對胃癌的早期診斷具有重要的意義。
XRCC1是一種參與DNA損傷修復的重要基因。目前研究發現，XRCC1基因主要存在3個常見的多態性位點，它們分別是第10外顯子G28152A（Arg399Gln）、第9外顯子C27466A（Arg280His）及第6外顯子C26304T（Arg194Trp）。堿基損傷、無堿基位點和單鏈斷裂可以由內源性活性物質和DNA錯配復制持續產生[3]。XRCC1改變可能改變基因組的穩定性，進而導致疾病或癌癥[13-14]。目前已有研究[15-17]發現，XRCC1與乳腺癌、食管癌、結直腸癌等多種癌癥的發生存在著相關性。然而，循證醫學及流行病學證據至今仍沒有確定XRCC1變異與癌癥發生的確切關系，這與研究中人群的基因差異有關[4, 18-19]，如觀察到亞洲人群突變純合子Arg280His與乳腺癌有關，但在高加索人群中卻沒有被發現[20]。突變純合子Arg194Trp在亞洲人群中能增加罹患肺癌的風險，但在高加索人群中能降低這種風險[21]。本研究中在胃癌組中Arg399Gln與Arg280His基因位點的變異基因型出現頻率與對照組相比差異均無統計學意義（P > 0.05），結果提示，Arg399Gln與Arg280His位點多態性與胃癌的易感性無關；而Arg194Trp變異基因型在胃癌組出現的頻率顯著高于對照組，Arg194Trp純合基因型在胃癌組出現的頻率顯著低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），結果提示，Arg194Trp位點變異基因型能增加胃癌的易感性，而Arg194Trp位點純合基因型可能對胃癌的發生具有潛在的保護作用。然而，因納入樣本量有限，這一結果并不能說明整個地區、中國及亞洲人群的整體情況，因為不同人種的基因多態性也存在著一定差異[22]。
總之，XRCC1作為一種DNA損傷修復基因，其多態性與多種腫瘤的發生有關。XRCC1三種不同位點基因多態性與胃癌易感性的關系仍存在很大爭議。從本研究的初步研究結果提示，XRCC1 Arg194Trp位點基因多態性與胃癌易感性有關，這可能為基因診斷胃癌提供了一定的理論依據。然而非隨機抽樣、有限的樣本量及腫瘤誘發因素的多樣性均會影響結果的準確性與代表性，因此仍需大樣本高質量研究來驗證這一結果。
