引用本文： 劉固, 周建平, 楊竹林, 劉棟才, 羅一民, 張建文. 葡萄糖調節蛋白78和94蛋白在直腸腺癌中的表達及其意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(2): 204-207. doi: 10.7507/1007-9424.20150055 復制
葡萄糖調節蛋白（glucose regulated protein，GRP）由內質網合成，是駐留于內質網腔的內質網分子伴侶，能調節蛋白的折疊與裝配，具有保護細胞、裝載轉錄因子、細胞凋亡因子、葡萄糖等作用，是細胞為了適應內質網應激狀態所產生的一類應激蛋白，GRP78和GRP94為GRPs家族中重要成員[1-2]。最近的研究[3-7]證實，在無人工誘導的情況下，GRPs在多種腫瘤組織中呈高表達，并與腫瘤細胞增殖、分化及侵襲性有關，但其在直腸腺癌中的表達極少有研究論及。為研究GRPs在直腸腺癌中的表達與上述研究是否具有一致性，本研究應用免疫組織化學方法探討GRP78和GRP94在直腸腺癌及其對應的癌旁組織中的表達，并分析其與直腸腺癌的分化程度、臨床分期、淋巴結轉移等臨床病理特征的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選擇中南大學湘雅二醫院老年外科2008年9月至2009年4月期間直腸腺癌及距離癌組織5 cm以上手術遠端切緣正常組織石蠟包埋切片標本45對，所有癌組織手術切除前均未接受放化療，且經病理學確診為直腸腺癌。納入研究的45例患者中，男23例，女22例；診斷年齡范圍為32～87歲，（60.1±11.2）歲。高分化腺癌6例，中分化腺癌29例，低分化腺癌10例。腫瘤最大直徑< 3 cm為24例，≥3 cm為21例。Dukes分期為A期者11例，B期15例，C期18例，D期1例。侵犯深度肌層以內為13例，肌層以外為32例。有淋巴結轉移者19例，無淋巴結轉移者26例。
1.2 主要試劑
兔抗人GRP78和GRP94單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，EnVisionTM標記試劑盒購自瑞士基因公司。
1.3 免疫組織化學檢測
經EnVisionTM免疫組織化學方法染色檢測GRP78和GRP94蛋白表達，嚴格按試劑盒說明書操作。陽性判斷標準為細胞質中出現棕黃色顆粒者為陽性細胞，以觀察切片10個高倍視野中陽性細胞率均值≥20%為陽性病例，< 20%為陰性病例。以福州邁新生物技術公司提供的陽性切片作為陽性對照，以0.01 mol/L PBS替代一抗作為陰性對照。
1.4 統計學方法
應用SPSS 16.0軟件對數據資料進行整理和統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，應用Spearman法進行兩種蛋白表達的相關性分析。檢驗水準α=0.05，以上統計學檢驗均為雙側檢驗。
2 結果
2.1 GRP78和GRP94蛋白在直腸腺癌及相應癌旁組織中的表達情況
免疫組織化學檢測GRP78和GRP94蛋白陽性染色呈棕黃色顆粒定位于細胞質上，見圖 1、2。在45例直腸腺癌的癌組織中GRP78和GRP94蛋白表達陽性率明顯高于其在對應的癌旁組織中的表達，差異有統計學意義（GRP78：χ2=16.200，P < 0.001；GRP94：χ2=14.221，P < 0.001），見表 1。
圖1
GRP78蛋白陽性表達（EnVisionTM×200）。1A：高分化腺癌；1B：中分化腺癌；1C：低分化腺癌??圖 2??GRP94蛋白陽性表達（EnVisionTM×200）。2A：高分化腺癌；2B：中分化腺癌；2C：低分化腺癌
表1
直腸腺癌組織及其相應癌旁組織中GRP78和GRP94蛋白表達情況
2.2 GRP78和GRP94蛋白表達與直腸腺癌患者臨床病理特征的關系
結果見表 2。從表 2可見，GRP78蛋白在直腸癌腺癌組織中的陽性表達與病理分化類型、Dukes分期、侵犯深度和淋巴結轉移有關（P < 0.05）；GRP94蛋白在直腸癌腺癌組織中的陽性表達與病理分化類型、Dukes分期和淋巴結轉移有關（P < 0.05）。尚未發現GRP78和GRP94蛋白陽性表達與患者性別、年齡及腫瘤大小等臨床特征有關（P > 0.05）。
表2
直腸腺癌組織中GRP78和GRP94蛋白陽性表達與患者臨床病理特征的關系
2.3 GRP78和GRP94蛋白在直腸腺癌的癌組織中表達的相關性分析結果
在24例GRP78蛋白表達陽性病例中，GRP94蛋白表達陽性者為18例，21例GRP78蛋白表達陰性病例中，GRP94蛋白表達陽性者為6例，兩者在直腸腺癌中的表達呈正相關（rs=0.464，P < 0.01）。
3 討論
結直腸癌是世界上主要的惡性腫瘤之一。國際癌癥中心2008年腫瘤登記數據顯示，結直腸癌居男性惡性腫瘤發病譜第3位和女性惡性腫瘤發病譜第2位，近年來發病率顯著上升[8]。因結直腸腺癌在結直腸癌中所占比例較大，所以臨床中對其研究較多[9-10]。
GRPs分子對腫瘤細胞快速增殖具有保護作用，并且能夠改變腫瘤的化療敏感性，針對GRPs分子這些作用，可以通過抑制GRPs的基因表達或抑制其功能，從而成為結直腸腺癌化療的治療靶點[9, 11-15]。抑制應激產生的GRPs，可以增加腫瘤細胞凋亡，減慢腫瘤生長[16-19]。有研究[12, 20]發現，選擇性內質網應激誘導抑制劑VST對于葡萄糖缺乏的腫瘤細胞具有選擇性細胞毒性，可以抑制UPR靶基因GRP78、GRP94的表達，同時抑制UPR轉錄激活因子XBP1和ATF4。因此，抑制GRP78、GRP94的表達在清除耐藥性和低血糖性腫瘤細胞中可能有一定作用。
本研究從分子生物學角度出發，探討GRP78和GRP94蛋白表達在直腸腺癌發生、發展中的作用。結果發現，GRP78和GRP94蛋白在直腸腺癌手術標本中的表達顯著高于相應癌旁組織中的表達，結果提示，GRP78和GRP94蛋白表達可能作為結直腸腺癌的早期診斷和檢測手術邊緣切除程度的參考指標[9]。本研究結果還顯示，GRP78和GRP94蛋白表達陽性率隨著細胞分化程度的降低、臨床分期的增加及腫瘤轉移而增高，且二者表達具有顯著一致性。分析其原因可能是腫瘤細胞惡性生長導致的組織內缺氧、低糖環境引起內質網腔非折疊蛋白或錯誤折疊蛋白聚集，引起內質網應激，內質網為減少應激的損害，即啟動非折疊蛋白反應，從而誘導內質網應激蛋白GRP78和GRP94蛋白的產生[21-24]。此結果也說明GRP78和GRP94蛋白表達在直腸腺癌的發展中具有一定的作用，并提示可通過檢測組織GRP78和GRP94蛋白表達來判斷其預后。我們可推測利用GRP78和GRP94為靶點或介質等基因治療抑制腫瘤細胞中GRP78和GRP94表達，進而抑制腫瘤細胞生長及轉移，有望為直腸癌的治療提供新思路。
綜上所述，抑制直腸癌腺癌細胞中GRP78和GRP94蛋白表達，有可能為直腸癌腺癌的診斷及預后的判斷提供了參考。隨著對GRP研究的不斷深入，直腸癌腺癌的化學治療、基因治療、免疫治療有可能有新的突破。
葡萄糖調節蛋白（glucose regulated protein，GRP）由內質網合成，是駐留于內質網腔的內質網分子伴侶，能調節蛋白的折疊與裝配，具有保護細胞、裝載轉錄因子、細胞凋亡因子、葡萄糖等作用，是細胞為了適應內質網應激狀態所產生的一類應激蛋白，GRP78和GRP94為GRPs家族中重要成員[1-2]。最近的研究[3-7]證實，在無人工誘導的情況下，GRPs在多種腫瘤組織中呈高表達，并與腫瘤細胞增殖、分化及侵襲性有關，但其在直腸腺癌中的表達極少有研究論及。為研究GRPs在直腸腺癌中的表達與上述研究是否具有一致性，本研究應用免疫組織化學方法探討GRP78和GRP94在直腸腺癌及其對應的癌旁組織中的表達，并分析其與直腸腺癌的分化程度、臨床分期、淋巴結轉移等臨床病理特征的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選擇中南大學湘雅二醫院老年外科2008年9月至2009年4月期間直腸腺癌及距離癌組織5 cm以上手術遠端切緣正常組織石蠟包埋切片標本45對，所有癌組織手術切除前均未接受放化療，且經病理學確診為直腸腺癌。納入研究的45例患者中，男23例，女22例；診斷年齡范圍為32～87歲，（60.1±11.2）歲。高分化腺癌6例，中分化腺癌29例，低分化腺癌10例。腫瘤最大直徑< 3 cm為24例，≥3 cm為21例。Dukes分期為A期者11例，B期15例，C期18例，D期1例。侵犯深度肌層以內為13例，肌層以外為32例。有淋巴結轉移者19例，無淋巴結轉移者26例。
1.2 主要試劑
兔抗人GRP78和GRP94單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，EnVisionTM標記試劑盒購自瑞士基因公司。
1.3 免疫組織化學檢測
經EnVisionTM免疫組織化學方法染色檢測GRP78和GRP94蛋白表達，嚴格按試劑盒說明書操作。陽性判斷標準為細胞質中出現棕黃色顆粒者為陽性細胞，以觀察切片10個高倍視野中陽性細胞率均值≥20%為陽性病例，< 20%為陰性病例。以福州邁新生物技術公司提供的陽性切片作為陽性對照，以0.01 mol/L PBS替代一抗作為陰性對照。
1.4 統計學方法
應用SPSS 16.0軟件對數據資料進行整理和統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，應用Spearman法進行兩種蛋白表達的相關性分析。檢驗水準α=0.05，以上統計學檢驗均為雙側檢驗。
2 結果
2.1 GRP78和GRP94蛋白在直腸腺癌及相應癌旁組織中的表達情況
免疫組織化學檢測GRP78和GRP94蛋白陽性染色呈棕黃色顆粒定位于細胞質上，見圖 1、2。在45例直腸腺癌的癌組織中GRP78和GRP94蛋白表達陽性率明顯高于其在對應的癌旁組織中的表達，差異有統計學意義（GRP78：χ2=16.200，P < 0.001；GRP94：χ2=14.221，P < 0.001），見表 1。
圖1
GRP78蛋白陽性表達（EnVisionTM×200）。1A：高分化腺癌；1B：中分化腺癌；1C：低分化腺癌??圖 2??GRP94蛋白陽性表達（EnVisionTM×200）。2A：高分化腺癌；2B：中分化腺癌；2C：低分化腺癌
表1
直腸腺癌組織及其相應癌旁組織中GRP78和GRP94蛋白表達情況
2.2 GRP78和GRP94蛋白表達與直腸腺癌患者臨床病理特征的關系
結果見表 2。從表 2可見，GRP78蛋白在直腸癌腺癌組織中的陽性表達與病理分化類型、Dukes分期、侵犯深度和淋巴結轉移有關（P < 0.05）；GRP94蛋白在直腸癌腺癌組織中的陽性表達與病理分化類型、Dukes分期和淋巴結轉移有關（P < 0.05）。尚未發現GRP78和GRP94蛋白陽性表達與患者性別、年齡及腫瘤大小等臨床特征有關（P > 0.05）。
表2
直腸腺癌組織中GRP78和GRP94蛋白陽性表達與患者臨床病理特征的關系
2.3 GRP78和GRP94蛋白在直腸腺癌的癌組織中表達的相關性分析結果
在24例GRP78蛋白表達陽性病例中，GRP94蛋白表達陽性者為18例，21例GRP78蛋白表達陰性病例中，GRP94蛋白表達陽性者為6例，兩者在直腸腺癌中的表達呈正相關（rs=0.464，P < 0.01）。
3 討論
結直腸癌是世界上主要的惡性腫瘤之一。國際癌癥中心2008年腫瘤登記數據顯示，結直腸癌居男性惡性腫瘤發病譜第3位和女性惡性腫瘤發病譜第2位，近年來發病率顯著上升[8]。因結直腸腺癌在結直腸癌中所占比例較大，所以臨床中對其研究較多[9-10]。
GRPs分子對腫瘤細胞快速增殖具有保護作用，并且能夠改變腫瘤的化療敏感性，針對GRPs分子這些作用，可以通過抑制GRPs的基因表達或抑制其功能，從而成為結直腸腺癌化療的治療靶點[9, 11-15]。抑制應激產生的GRPs，可以增加腫瘤細胞凋亡，減慢腫瘤生長[16-19]。有研究[12, 20]發現，選擇性內質網應激誘導抑制劑VST對于葡萄糖缺乏的腫瘤細胞具有選擇性細胞毒性，可以抑制UPR靶基因GRP78、GRP94的表達，同時抑制UPR轉錄激活因子XBP1和ATF4。因此，抑制GRP78、GRP94的表達在清除耐藥性和低血糖性腫瘤細胞中可能有一定作用。
本研究從分子生物學角度出發，探討GRP78和GRP94蛋白表達在直腸腺癌發生、發展中的作用。結果發現，GRP78和GRP94蛋白在直腸腺癌手術標本中的表達顯著高于相應癌旁組織中的表達，結果提示，GRP78和GRP94蛋白表達可能作為結直腸腺癌的早期診斷和檢測手術邊緣切除程度的參考指標[9]。本研究結果還顯示，GRP78和GRP94蛋白表達陽性率隨著細胞分化程度的降低、臨床分期的增加及腫瘤轉移而增高，且二者表達具有顯著一致性。分析其原因可能是腫瘤細胞惡性生長導致的組織內缺氧、低糖環境引起內質網腔非折疊蛋白或錯誤折疊蛋白聚集，引起內質網應激，內質網為減少應激的損害，即啟動非折疊蛋白反應，從而誘導內質網應激蛋白GRP78和GRP94蛋白的產生[21-24]。此結果也說明GRP78和GRP94蛋白表達在直腸腺癌的發展中具有一定的作用，并提示可通過檢測組織GRP78和GRP94蛋白表達來判斷其預后。我們可推測利用GRP78和GRP94為靶點或介質等基因治療抑制腫瘤細胞中GRP78和GRP94表達，進而抑制腫瘤細胞生長及轉移，有望為直腸癌的治療提供新思路。
綜上所述，抑制直腸癌腺癌細胞中GRP78和GRP94蛋白表達，有可能為直腸癌腺癌的診斷及預后的判斷提供了參考。隨著對GRP研究的不斷深入，直腸癌腺癌的化學治療、基因治療、免疫治療有可能有新的突破。
