引用本文： 張偉, 王南鵬, 高慶軍, 周彥, 段海松, 張微, 趙代偉. 甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E突變與臨床病理特征和甲狀腺球蛋白的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(2): 200-203. doi: 10.7507/1007-9424.20150054 復制
甲狀腺乳頭狀癌（PTC）約占所有甲狀腺癌的80%～90%，是甲狀腺癌生物學特性中惡性程度最低的一類腫瘤[1]。對于PTC的治療，目前國內外公認的最佳治療方案是行甲狀腺全切除或近全切除+頸部淋巴結清掃或甲狀腺腺葉切除+峽部切除術，術后131碘（131I）治療以及甲狀腺激素的終身抑制及替代治療[2]。本研究應用巢式PCR方法對我院55例PTC患者的石蠟包埋組織行BRAFV600E基因位點突變的檢測，并結合患者臨床病理特征及規范化治療后檢測的Tg值進行研究，試圖了解基因突變與臨床病理特征及規范化治療后Tg值變化的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取我院甲狀腺外科及頭頸外科2012年1～3月期間行根治性手術切除且經病理組織學檢測證實為PTC的55例石蠟包埋組織標本。所有選擇標本的患者均行甲狀腺全切除+頸部淋巴結清掃，其中行中央區淋巴結清掃48例，中央并頸側區淋巴結清掃7例。術后1個月均在我院核醫學科行規范的131I治療，具體劑量參照2012年甲狀腺結節和甲狀腺癌的診療指南[2]并統計該55例患者行規范化治療后檢測的Tg值，并且Tg值均在促甲狀腺激素刺激激素抑制狀態下測定，同時復查抗甲狀腺球蛋白抗體（TgAb），每3個月復查1次Tg及TgAb。隨訪時間為2年，患者隨訪率100%，無一例有確切頸部復發或轉移證據和再次手術指征，包括Tg值持續大于10μg/L、頸部超聲和RX-WBS均有明顯異常，無死亡患者。
1.2 巢式PCR方法檢測
1.2.1 試劑和引物
DNA FFPE Tissue Kit（No.56404）購于QIAamp公司，PCR Master Mix購于BioTeke公司。BRAF上游引物為5’-GGCCAAAAATTTAATCA-GTGGA-3’，BRAF下游引物為5’-TCATAATGCTTG-CTCTGATAGGA-3’，擴增片段長度為16 bp，由上海生工合成。Cycle-Pure kit 100購于Omega公司。測序部分檢測試劑盒購于上海源奇生物醫藥公司。
1.2.2 組織DNA提取
按DNA FFPE Tissue Kit（No.56404）試劑盒操作，其中二甲苯脫蠟2次，56℃水浴消化約12 h，并對提取的DNA使用BioTeke公司的DNA濃度測定儀行濃度測定，然后將DNA置于-20℃冰箱保存。
1.2.3 巢式PCR
配制25μL體系：PCR Master Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA 1μL，ddH2O 9.5μL放入PCR儀中。設置94℃5 min，94℃45 s，56℃45 s，72℃45 s，35個循環，72℃延伸10 min，得到產物。
1.2.4 PCR的純化
取PCR產物按照Omega公司的Cycle-Pure kit 100試劑盒操作，即為PCR純化產物。
1.2.5 部分檢測及測序
對PCR純化產物，按照上海源奇生物醫藥公司的測序部分檢測試劑盒上說明進行操作，得到產物后按照ABI的3500測序儀進行測序，得到測序圖像。
1.3 統計學方法
采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行分析。采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BRAFV600E基因位點突變檢測結果
55例PTC患者中，26例無BRAFV600E基因位點突變即為野生型（圖 1）；29例出現BRAFV600E基因位點突變（圖 2），突變率為52.7%。
圖1
野生型測序結果圖。黑色箭頭指的檢測1 799位點的基因，只有紅色T峰，即為野生型??圖 2??突變型測序結果圖。黑色箭頭指的檢測1 799位點的基因，綠色的A峰是突變峰，紅色的T峰，即為突變型
2.2 BRAFV600E突變與PTC患者的臨床病理特征及規范化治療后Tg的關系
結果見表 1。從表 1可見，患者年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期與BRAFV600E基因突變無關（P > 0.05）；腫瘤有包膜外浸潤、多灶性、有淋巴結轉移、規范化治療后Tg均值> 1.0μg/L時與BRAFV600E基因突變有關（P < 0.05）。
表1
BRAFV600E突變與PTC患者臨床病理特征及規范化治療后Tg的關系（例）
3 討論
3.1 BRAF基因突變
BRAF基因在1988年由Ikawa等[3]首先在人類尤文氏肉瘤中發現并將其克隆出來，BRAF基因突變是指BRAF基因的第15外顯子的第600密碼子1 799號上的核苷酸由胸腺嘧啶（T）突變為腺嘌呤（A）即T1799A，導致編碼產物由纈氨酸（V）替換為谷氨酸（E）的突變點（V600E）。該基因屬于RAF家族成員，位于染色體7q34，與鳥類的c-Rmail原癌基因同源。該基因至少含有7個轉錄區，能編碼多種蛋白質，其中包括全長約94 kD、有783個氨基酸殘基的B型有絲分裂原激活的蛋白激酶依賴性激酶，屬絲氨酸∕蘇氨酸蛋白激酶類，該突變可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路[4]，參與細胞周期調控，對細胞的生長、增殖、分化和凋亡發揮重要作用[3]。當BRAF基因突變異常激活MAPK通路時則可能導致細胞增殖分化的失控，最終導致腫瘤的發生[5-6]。有研究[7-8]發現，RET/PTC-RAS-RAF-MEK/ERK-MAPK信號傳導通路在甲狀腺癌的發生和轉移中起到重要的作用。Davies等[9]研究表明，BRAF基因突變是導致MAPK信號通路異常激活的主要原因之一。本研究對手術切除的55例PTC患者的腫瘤組織的BRAFV600E基因進行檢測，結果發現，29例出現BRAFV600E基因15外顯子的1 799號上的核苷酸由T突變為A的位點突變，突變率為52.7%，與文獻[9]報道該基因突變率為29%～82%符合。
3.2 BRAFV600E基因突變與PTC患者臨床病理特征的關系
目前國內外對BRAFV600E基因突變與PTC患者臨床病理特征的關系報道較少且結果不一[10-11]。Xing等[10]的研究結果表明，BRAFV600E突變與甲狀腺外侵犯、甲狀腺包膜浸潤和淋巴結轉移密切相關。牛衛等[12]的研究結果發現，BRAFV600E基因突變率與PTC患者的性別、年齡、TNM腫瘤分期無關。Puxeddu等[13]關于BRAFV600E突變研究表明，它誘導或促進基因組不穩定性和更具侵襲性，結果造成腫瘤去分化和顯著抑制細胞凋亡。Elisei等[14]有一項與PTC病死率關系的15年的研究發現，BRAFV600E突變作為單獨影響因素與患者病死率有關，突變患者的病死率顯著高于無突變患者。本研究發現，BRAFV600E基因突變與PTC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期無關（P > 0.05），與包膜浸潤、多灶性、有頸部淋巴結轉移有關（P < 0.05）。結果提示，BRAFV600E基因突變可引起腫瘤侵犯到包膜外，并出現頸部淋巴結轉移，腫瘤的多灶性可能是腫瘤早期出現腺體內轉移表現。
3.3 BRAFV600E基因突變與Tg的關系
盡管進行甲狀腺全切除術，但術后放射性碘成像往往發現甲狀腺床有殘留甲狀腺組織的存在，再行131I清除術后殘留甲狀腺組織治療后，放射性碘成像會發現甲狀腺床上無殘余甲狀腺組織，考慮全部去除體內甲狀腺，此時Tg的作用才得到真正的體現，Tg是一個監測甲狀腺癌復發轉移有臨床意義的指標[15]。Tg對PTC復發或轉移灶診斷的靈敏度、特異度和準確性分別為76.9%、66.7%和75%[16]。檢測Tg及TgAb時，如果TgAb在正常范圍(0～60 U/mL)，可以排除TgAb對患者Tg值的影響[17]。本研究所有患者術后均檢測Tg和TgAb，Tg值均為在促甲狀腺激素刺激激素抑制狀態下測定，隨訪的所有患者中無一例有確切頸部復發或轉移證據和再次手術指征，包括頸部超聲和RX-WBS均有明顯異常，無死亡患者。
目前公認的TSH抑制下Tg的切點值為1.0μg/L，核醫學科清除術后殘留甲狀腺組織治療的劑量在30～100 mCi（具體劑量參照指南[2]實施），術后在促甲狀腺激素刺激激素抑制狀態下，Tg值越大，提示有殘余或復發灶存在可能性越大。本研究中發現，BRAFV600E基因突變患者在規范化治療后Tg值> 1.0μg/L的例數與未突變患者的Tg值> 1.0μg/L的例數進行比較，差異有統計學意義（χ2=5.03，P=0.03），突變患者規范化治療后Tg值大于未突變者，這可能與突變可以誘導轉化生長因子-B的分泌和能抑制Na+/I-同向轉運體基因的功能有關[18]，導致對放射性碘攝取差，殘余的腫瘤可以繼續分泌Tg。因此我們認為，如果術前通過檢測腫瘤組織的BRAFV600E基因突變，對突變患者建議術中甲狀腺全切除及頸部淋巴結清掃術，術后的131I清除術后殘留甲狀腺組織及積極促甲狀腺激素刺激激素抑制治療，便于隨訪Tg。
甲狀腺乳頭狀癌（PTC）約占所有甲狀腺癌的80%～90%，是甲狀腺癌生物學特性中惡性程度最低的一類腫瘤[1]。對于PTC的治療，目前國內外公認的最佳治療方案是行甲狀腺全切除或近全切除+頸部淋巴結清掃或甲狀腺腺葉切除+峽部切除術，術后131碘（131I）治療以及甲狀腺激素的終身抑制及替代治療[2]。本研究應用巢式PCR方法對我院55例PTC患者的石蠟包埋組織行BRAFV600E基因位點突變的檢測，并結合患者臨床病理特征及規范化治療后檢測的Tg值進行研究，試圖了解基因突變與臨床病理特征及規范化治療后Tg值變化的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取我院甲狀腺外科及頭頸外科2012年1～3月期間行根治性手術切除且經病理組織學檢測證實為PTC的55例石蠟包埋組織標本。所有選擇標本的患者均行甲狀腺全切除+頸部淋巴結清掃，其中行中央區淋巴結清掃48例，中央并頸側區淋巴結清掃7例。術后1個月均在我院核醫學科行規范的131I治療，具體劑量參照2012年甲狀腺結節和甲狀腺癌的診療指南[2]并統計該55例患者行規范化治療后檢測的Tg值，并且Tg值均在促甲狀腺激素刺激激素抑制狀態下測定，同時復查抗甲狀腺球蛋白抗體（TgAb），每3個月復查1次Tg及TgAb。隨訪時間為2年，患者隨訪率100%，無一例有確切頸部復發或轉移證據和再次手術指征，包括Tg值持續大于10μg/L、頸部超聲和RX-WBS均有明顯異常，無死亡患者。
1.2 巢式PCR方法檢測
1.2.1 試劑和引物
DNA FFPE Tissue Kit（No.56404）購于QIAamp公司，PCR Master Mix購于BioTeke公司。BRAF上游引物為5’-GGCCAAAAATTTAATCA-GTGGA-3’，BRAF下游引物為5’-TCATAATGCTTG-CTCTGATAGGA-3’，擴增片段長度為16 bp，由上海生工合成。Cycle-Pure kit 100購于Omega公司。測序部分檢測試劑盒購于上海源奇生物醫藥公司。
1.2.2 組織DNA提取
按DNA FFPE Tissue Kit（No.56404）試劑盒操作，其中二甲苯脫蠟2次，56℃水浴消化約12 h，并對提取的DNA使用BioTeke公司的DNA濃度測定儀行濃度測定，然后將DNA置于-20℃冰箱保存。
1.2.3 巢式PCR
配制25μL體系：PCR Master Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA 1μL，ddH2O 9.5μL放入PCR儀中。設置94℃5 min，94℃45 s，56℃45 s，72℃45 s，35個循環，72℃延伸10 min，得到產物。
1.2.4 PCR的純化
取PCR產物按照Omega公司的Cycle-Pure kit 100試劑盒操作，即為PCR純化產物。
1.2.5 部分檢測及測序
對PCR純化產物，按照上海源奇生物醫藥公司的測序部分檢測試劑盒上說明進行操作，得到產物后按照ABI的3500測序儀進行測序，得到測序圖像。
1.3 統計學方法
采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行分析。采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BRAFV600E基因位點突變檢測結果
55例PTC患者中，26例無BRAFV600E基因位點突變即為野生型（圖 1）；29例出現BRAFV600E基因位點突變（圖 2），突變率為52.7%。
圖1
野生型測序結果圖。黑色箭頭指的檢測1 799位點的基因，只有紅色T峰，即為野生型??圖 2??突變型測序結果圖。黑色箭頭指的檢測1 799位點的基因，綠色的A峰是突變峰，紅色的T峰，即為突變型
2.2 BRAFV600E突變與PTC患者的臨床病理特征及規范化治療后Tg的關系
結果見表 1。從表 1可見，患者年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期與BRAFV600E基因突變無關（P > 0.05）；腫瘤有包膜外浸潤、多灶性、有淋巴結轉移、規范化治療后Tg均值> 1.0μg/L時與BRAFV600E基因突變有關（P < 0.05）。
表1
BRAFV600E突變與PTC患者臨床病理特征及規范化治療后Tg的關系（例）
3 討論
3.1 BRAF基因突變
BRAF基因在1988年由Ikawa等[3]首先在人類尤文氏肉瘤中發現并將其克隆出來，BRAF基因突變是指BRAF基因的第15外顯子的第600密碼子1 799號上的核苷酸由胸腺嘧啶（T）突變為腺嘌呤（A）即T1799A，導致編碼產物由纈氨酸（V）替換為谷氨酸（E）的突變點（V600E）。該基因屬于RAF家族成員，位于染色體7q34，與鳥類的c-Rmail原癌基因同源。該基因至少含有7個轉錄區，能編碼多種蛋白質，其中包括全長約94 kD、有783個氨基酸殘基的B型有絲分裂原激活的蛋白激酶依賴性激酶，屬絲氨酸∕蘇氨酸蛋白激酶類，該突變可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路[4]，參與細胞周期調控，對細胞的生長、增殖、分化和凋亡發揮重要作用[3]。當BRAF基因突變異常激活MAPK通路時則可能導致細胞增殖分化的失控，最終導致腫瘤的發生[5-6]。有研究[7-8]發現，RET/PTC-RAS-RAF-MEK/ERK-MAPK信號傳導通路在甲狀腺癌的發生和轉移中起到重要的作用。Davies等[9]研究表明，BRAF基因突變是導致MAPK信號通路異常激活的主要原因之一。本研究對手術切除的55例PTC患者的腫瘤組織的BRAFV600E基因進行檢測，結果發現，29例出現BRAFV600E基因15外顯子的1 799號上的核苷酸由T突變為A的位點突變，突變率為52.7%，與文獻[9]報道該基因突變率為29%～82%符合。
3.2 BRAFV600E基因突變與PTC患者臨床病理特征的關系
目前國內外對BRAFV600E基因突變與PTC患者臨床病理特征的關系報道較少且結果不一[10-11]。Xing等[10]的研究結果表明，BRAFV600E突變與甲狀腺外侵犯、甲狀腺包膜浸潤和淋巴結轉移密切相關。牛衛等[12]的研究結果發現，BRAFV600E基因突變率與PTC患者的性別、年齡、TNM腫瘤分期無關。Puxeddu等[13]關于BRAFV600E突變研究表明，它誘導或促進基因組不穩定性和更具侵襲性，結果造成腫瘤去分化和顯著抑制細胞凋亡。Elisei等[14]有一項與PTC病死率關系的15年的研究發現，BRAFV600E突變作為單獨影響因素與患者病死率有關，突變患者的病死率顯著高于無突變患者。本研究發現，BRAFV600E基因突變與PTC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期無關（P > 0.05），與包膜浸潤、多灶性、有頸部淋巴結轉移有關（P < 0.05）。結果提示，BRAFV600E基因突變可引起腫瘤侵犯到包膜外，并出現頸部淋巴結轉移，腫瘤的多灶性可能是腫瘤早期出現腺體內轉移表現。
3.3 BRAFV600E基因突變與Tg的關系
盡管進行甲狀腺全切除術，但術后放射性碘成像往往發現甲狀腺床有殘留甲狀腺組織的存在，再行131I清除術后殘留甲狀腺組織治療后，放射性碘成像會發現甲狀腺床上無殘余甲狀腺組織，考慮全部去除體內甲狀腺，此時Tg的作用才得到真正的體現，Tg是一個監測甲狀腺癌復發轉移有臨床意義的指標[15]。Tg對PTC復發或轉移灶診斷的靈敏度、特異度和準確性分別為76.9%、66.7%和75%[16]。檢測Tg及TgAb時，如果TgAb在正常范圍(0～60 U/mL)，可以排除TgAb對患者Tg值的影響[17]。本研究所有患者術后均檢測Tg和TgAb，Tg值均為在促甲狀腺激素刺激激素抑制狀態下測定，隨訪的所有患者中無一例有確切頸部復發或轉移證據和再次手術指征，包括頸部超聲和RX-WBS均有明顯異常，無死亡患者。
目前公認的TSH抑制下Tg的切點值為1.0μg/L，核醫學科清除術后殘留甲狀腺組織治療的劑量在30～100 mCi（具體劑量參照指南[2]實施），術后在促甲狀腺激素刺激激素抑制狀態下，Tg值越大，提示有殘余或復發灶存在可能性越大。本研究中發現，BRAFV600E基因突變患者在規范化治療后Tg值> 1.0μg/L的例數與未突變患者的Tg值> 1.0μg/L的例數進行比較，差異有統計學意義（χ2=5.03，P=0.03），突變患者規范化治療后Tg值大于未突變者，這可能與突變可以誘導轉化生長因子-B的分泌和能抑制Na+/I-同向轉運體基因的功能有關[18]，導致對放射性碘攝取差，殘余的腫瘤可以繼續分泌Tg。因此我們認為，如果術前通過檢測腫瘤組織的BRAFV600E基因突變，對突變患者建議術中甲狀腺全切除及頸部淋巴結清掃術，術后的131I清除術后殘留甲狀腺組織及積極促甲狀腺激素刺激激素抑制治療，便于隨訪Tg。
