引用本文： 楊香山, 程紹梅, 肖瑞雪, 張晶, 夏振, 王雪. Snail、N-cadherin在甲狀腺乳頭狀癌中表達上調及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(2): 181-185. doi: 10.7507/1007-9424.20150050 復制
黏附分子N-鈣黏蛋白（cadherin）參與細胞與細胞間或細胞與基質間結合，在正常組織中含量甚少，異常表達可引起癌變。鋅指轉錄因子Snail可下調E-cadherin表達而上調N-cadherin的表達，進而參與上皮間質化的過程。本研究小組前期研究[1-2]表明，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）和微小癌均可經淋巴結轉移，然而轉移機制目前未完全明了；同時Snail和N-cadherin在PTC中的表達以及誘導情況少見報道。故本研究通過檢測Snail和N-cadherin在PTC組織和細胞株中的表達，進一步探討二者的臨床應用價值及意義。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集山東省醫學科學院附屬醫院2010～2012年期間行PTC根治術的標本60例，其中男14例，女46例；年齡15～70歲，中位年齡40歲。無淋巴結轉移15例，有淋巴結轉移45例。同時取距離癌組織2～5 cm相應癌旁正常組織。全部標本均經病理檢測證實為PTC；術前均無化療、放療及免疫治療史。
1.2 主要試劑
小鼠抗人Snail、N-cadherin單克隆抗體，均購自Santa Cruz公司。SP試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗、多聚物輔助試劑與DAB，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。轉化生長因子（TGF）-β1與DMEM培養基購自Sigma公司。PTC TPC-1細胞株購于中國科學院上海細胞庫。BCA蛋白分析試劑盒及ECL試劑盒購自美國Pierce公司。
1.3 免疫組織化學SP法檢測Snail和N-cadherin蛋白表達情況
采用免疫組織化學染色SP法，嚴格按試劑盒說明書進行操作。結果判斷標準：以細胞膜或細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性表達。以染色強度和陽性細胞百分比的評分作為標準。染色強度評分：無染色計0分，淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分；陽性細胞百分比評分：在低倍（×10）鏡下隨機選擇10個視野，高倍（×40）鏡下計數，每個視野計數100個癌細胞，并計算陽性細胞百分數，結果取10個視野的平均百分數，其中無陽性細胞計0分，陽性細胞< 25%計1分，陽性細胞25%～50%計2分，陽性細胞> 50%計3分。以染色強度與陽性細胞百分比評分的乘積表示Snail、N-cadherin的表達強度：0分為（-），1～3分為（+），4～6分為（++），7～9分為（+++）。總體評價< 4分者為Snail、N-cadherin陰性表達，≥4分者為Snail、N-cadherin陽性表達。
1.4 細胞培養
取TPC-1細胞株，用含15%胎牛血清、105 U/ L青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養基于37℃、95%濕度、5% CO2條件下進行培養，每3 d進行換液，用作實驗。實驗分組：①TGF-β1刺激組，TPC-1細胞（1×106個/mL）用含50 ng/mL TGF-β1的無血清培養基培養24 h后檢測Snail、N-cadherin的表達水平；②無血清對照組，TPC-1細胞（1×106個/mL）用含與①等量的無血清培養基培養24 h后檢測Snail、N-cadherin的表達水平。
1.5 Western blot法檢測Snail和N-cadherin蛋白表達
按常規方法分別提取淋巴結轉移和無淋巴結轉移的PTC癌組織與TPC-1細胞總蛋白，BCA蛋白定量后，每道加入30μg蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉后加入小鼠抗人Snail、N-cadherin單克隆抗體（均為1∶500），4℃過夜。BST溶液洗膜，β-actin作為內參，加入辣根過氧化物酶結合的二抗。ECL化學發光試劑盒檢測。Quantity One分析蛋白條帶灰度值。以目的條帶灰度值與對應的β-actin灰度值之比作為蛋白表達水平的半定量結果。
1.6 統計學方法
應用SPSS 13.0統計軟件分析，分類資料采用卡方檢驗，采用Spearman行相關性分析，檢驗水準α=0.01。
2 結果
2.1 Snail和N-cadherin在PTC組織中的表達情況
60例PTC癌旁正常組織中Snail和N-cadherin表達均為陰性（圖 1）。Snail在51例PTC癌組織中陽性表達，主要表達于細胞核與細胞質中（圖 2A）。其中（++）者21例，（+++）者30例，陽性率為85.0%，明顯高于其在PTC相應癌旁正常組織中的表達（0，P < 0.01）。N-cadherin在47例PTC癌組織中陽性表達，主要表達于細胞質和細胞膜（圖 2B）。其中（++）16例，（+++）31例，陽性率為78.3%，明顯高于其在PTC相應癌旁正常組織中的表達（0，P < 0.01）。
圖1
Snail和N-cadherin在PTC癌旁正常組織中的陰性表達（SP×200）。1A：Snail；1B：N-cadherin??圖 2??Snail和N-cadherin在PTC癌組織中的表達（SP×400）。2A：Snail，呈陽性表達于細胞核與細胞質；2B：N-cadherin，呈陽性表達于細胞質與細胞膜
2.2 Western blot檢測Snail和N-cadherin蛋白在PTC組織與相應癌旁正常組織中的表達
Western blot檢測的定性結果見圖 3A，半定量結果見圖 3B。結果顯示，Snail和N-cadherin蛋白在PTC癌組織中的蛋白表達水平均高于相應癌旁正常組織，差異有統計學意義（P < 0.001，P < 0.001）；Snail和N-cadherin蛋白在PTC有淋巴結轉移癌組織中蛋白表達水平均明顯高于無淋巴結轉移組織中蛋白表達水平，差異亦有統計學意義（P < 0.001，P < 0.001）。
圖3
Western blot法檢測Snail和N-cadherin在PTC癌旁正常組織、無淋巴結轉移癌組織及有淋巴結轉移癌組織中的表達情況。3A：定性結果。3B：半定量結果。與癌旁正常組織比較，* P < 0.001；與無淋巴結轉移癌組織比較，△P < 0.001
2.3 Snail和N-cadherin在PTC細胞株TPC-1中的表達與調節
Western blot結果顯示，PTC細胞株TPC-1在無血清培養基DMEM中可正常組成性表達Snail與N-cadherin蛋白；然而，在TGF-β1（50 ng/mL）誘導后TPC-1中的Snail與N-cadherin蛋白表達量相對于無血清對照組分別升高2.6倍、2.1倍，差異均有統計學意義（P < 0.001，P < 0.001）。見圖 4A、4B。
圖4
Western blot法檢測Snail和N-cadherin在PTC細胞株TPC-1無血清對照組與TGF-β1刺激組中蛋白的表達情況。4A：定性結果。4B：半定量結果。與無血清對照組比較，* P < 0.001
2.4 Snail和N-cadherin蛋白陽性表達與PTC患者臨床病理特征的關系
Snail和N-cadherin在PTC癌組織中的表達與患者的性別、年齡及腫瘤大小均無關（P > 0.01）。Snail和N-cadherin在淋巴結有轉移的PTC癌組織中的表達陽性率均明顯高于無淋巴結轉移者，差異有統計學意義（P < 0.01）。見表 1。
表1
Snail和N-cadherin在PTC癌組織中的表達與PTC患者臨床病理特征的關系（例）
2.5 Snail和N-cadherin在PTC癌組織中表達的相關性分析結果
Spearman相關性分析發現，Snail和N-cadherin在PTC癌組織中的表達呈正相關性（rs=0.721，P < 0.001），見表 2。
表2
Snail和N-cadherin在PTC癌組織中表達的相關性分析結果（例）
3 討論
轉錄因子Snail屬于Snail家族中的一員，其他成員主要包括ZEB1、Slug、SIP1g等[3]。Snail家族成員的分子結構極為相似但結構較為特殊，其-COOH末端表現為高度保守，而-NH2末端則結構多變。有研究[4]發現，Snail基因在胰腺癌組織中的表達與癌細胞的形態學變化有關，提示Snail在上皮間質化轉變中有一定的作用。本研究結果發現，Snail在PTC癌組織中的表達陽性率為85.0%，明顯高于癌周正常組織（0），并且Snail在PTC癌組織中的蛋白表達與PTC的淋巴結轉移有關，結果提示Snail在PTC轉移中起一定作用。
黏附素cadherin家族的主要成分為單鏈跨膜糖蛋白，成員間的結構和功能亦具有共同點。根據組織來源，cadherin被分為3類：上皮（E）、神經（N）及胎盤（P）[5]。已有文獻[6]報道，E-cadherin可與β-catenin相互作用，結合為cadherin/catenin復合物，以此維持上皮細胞的結構與功能；同時，E-cadherin的下調則參與上皮間質轉化、腫瘤細胞浸潤轉移[7]；然而N-cadherin上調可能與腫瘤轉移關系最密切。在病理情況下，N-cadherin的上調可影響纖維生長因子受體的內化進而維持生長因子的信號傳導[8]，導致細胞黏附性減小并易發生淋巴道轉移[9-11]。提示N-cadherin影響了PTC細胞間或與基質間的黏附作用，促使癌細胞組織浸潤和淋巴結轉移。本研究對N-cadherin的研究結果發現，N-cadherin蛋白在PTC癌組織中的表達陽性率為78.3%，明顯高于其在癌周正常組織中的表達（0），并且有淋巴轉移的患者中N-cadherin蛋白表達陽性率明顯高于無淋巴結轉移者（P < 0.01），結果提示，N-cadherin與PTC的淋巴結轉移有密切的關系。也有研究認為，PTC細胞增殖較快而壓迫腺體周圍血管導致乏氧[12-14]，乏氧可增強間質化相關因子（N-cadherin、Snail、TGF）的表達[15]。
在其他腫瘤的研究中證明，Snail可通過直接抑制E-cadherin的轉錄進而減弱癌細胞間黏附特性[16]，從而導致乳腺癌的浸潤轉移[17]。有關機制研究[18-19]表明，Snail分子的鋅指結構域與E-cadherin基因中的CANNTG序列直接結合，繼而阻止E-cadherin的轉錄，同時Snail亦調節了N-cadherin的轉錄。另外，我們進一步從細胞蛋白水平驗證Snail與N-cadherin可在PTC組織與細胞株TPC-1中表達且與淋巴結轉移相關，同時在細胞株TPC-1中，Snail與N-cadherin可被TGF-β1誘導上調。以上研究結果提示，Snail與N-cadherin在上皮間質化中起重要作用以及在腫瘤發生與轉移中的重要意義[20-21]。
綜上所述，在PTC的發生、發展中，Snail和N-cadherin表達上調促進了PTC浸潤和轉移，二者的結合對于診斷PTC的早期轉移及開發更具特異性的治療藥物可能具有重要意義。
黏附分子N-鈣黏蛋白（cadherin）參與細胞與細胞間或細胞與基質間結合，在正常組織中含量甚少，異常表達可引起癌變。鋅指轉錄因子Snail可下調E-cadherin表達而上調N-cadherin的表達，進而參與上皮間質化的過程。本研究小組前期研究[1-2]表明，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）和微小癌均可經淋巴結轉移，然而轉移機制目前未完全明了；同時Snail和N-cadherin在PTC中的表達以及誘導情況少見報道。故本研究通過檢測Snail和N-cadherin在PTC組織和細胞株中的表達，進一步探討二者的臨床應用價值及意義。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集山東省醫學科學院附屬醫院2010～2012年期間行PTC根治術的標本60例，其中男14例，女46例；年齡15～70歲，中位年齡40歲。無淋巴結轉移15例，有淋巴結轉移45例。同時取距離癌組織2～5 cm相應癌旁正常組織。全部標本均經病理檢測證實為PTC；術前均無化療、放療及免疫治療史。
1.2 主要試劑
小鼠抗人Snail、N-cadherin單克隆抗體，均購自Santa Cruz公司。SP試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗、多聚物輔助試劑與DAB，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。轉化生長因子（TGF）-β1與DMEM培養基購自Sigma公司。PTC TPC-1細胞株購于中國科學院上海細胞庫。BCA蛋白分析試劑盒及ECL試劑盒購自美國Pierce公司。
1.3 免疫組織化學SP法檢測Snail和N-cadherin蛋白表達情況
采用免疫組織化學染色SP法，嚴格按試劑盒說明書進行操作。結果判斷標準：以細胞膜或細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性表達。以染色強度和陽性細胞百分比的評分作為標準。染色強度評分：無染色計0分，淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分；陽性細胞百分比評分：在低倍（×10）鏡下隨機選擇10個視野，高倍（×40）鏡下計數，每個視野計數100個癌細胞，并計算陽性細胞百分數，結果取10個視野的平均百分數，其中無陽性細胞計0分，陽性細胞< 25%計1分，陽性細胞25%～50%計2分，陽性細胞> 50%計3分。以染色強度與陽性細胞百分比評分的乘積表示Snail、N-cadherin的表達強度：0分為（-），1～3分為（+），4～6分為（++），7～9分為（+++）。總體評價< 4分者為Snail、N-cadherin陰性表達，≥4分者為Snail、N-cadherin陽性表達。
1.4 細胞培養
取TPC-1細胞株，用含15%胎牛血清、105 U/ L青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養基于37℃、95%濕度、5% CO2條件下進行培養，每3 d進行換液，用作實驗。實驗分組：①TGF-β1刺激組，TPC-1細胞（1×106個/mL）用含50 ng/mL TGF-β1的無血清培養基培養24 h后檢測Snail、N-cadherin的表達水平；②無血清對照組，TPC-1細胞（1×106個/mL）用含與①等量的無血清培養基培養24 h后檢測Snail、N-cadherin的表達水平。
1.5 Western blot法檢測Snail和N-cadherin蛋白表達
按常規方法分別提取淋巴結轉移和無淋巴結轉移的PTC癌組織與TPC-1細胞總蛋白，BCA蛋白定量后，每道加入30μg蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉后加入小鼠抗人Snail、N-cadherin單克隆抗體（均為1∶500），4℃過夜。BST溶液洗膜，β-actin作為內參，加入辣根過氧化物酶結合的二抗。ECL化學發光試劑盒檢測。Quantity One分析蛋白條帶灰度值。以目的條帶灰度值與對應的β-actin灰度值之比作為蛋白表達水平的半定量結果。
1.6 統計學方法
應用SPSS 13.0統計軟件分析，分類資料采用卡方檢驗，采用Spearman行相關性分析，檢驗水準α=0.01。
2 結果
2.1 Snail和N-cadherin在PTC組織中的表達情況
60例PTC癌旁正常組織中Snail和N-cadherin表達均為陰性（圖 1）。Snail在51例PTC癌組織中陽性表達，主要表達于細胞核與細胞質中（圖 2A）。其中（++）者21例，（+++）者30例，陽性率為85.0%，明顯高于其在PTC相應癌旁正常組織中的表達（0，P < 0.01）。N-cadherin在47例PTC癌組織中陽性表達，主要表達于細胞質和細胞膜（圖 2B）。其中（++）16例，（+++）31例，陽性率為78.3%，明顯高于其在PTC相應癌旁正常組織中的表達（0，P < 0.01）。
圖1
Snail和N-cadherin在PTC癌旁正常組織中的陰性表達（SP×200）。1A：Snail；1B：N-cadherin??圖 2??Snail和N-cadherin在PTC癌組織中的表達（SP×400）。2A：Snail，呈陽性表達于細胞核與細胞質；2B：N-cadherin，呈陽性表達于細胞質與細胞膜
2.2 Western blot檢測Snail和N-cadherin蛋白在PTC組織與相應癌旁正常組織中的表達
Western blot檢測的定性結果見圖 3A，半定量結果見圖 3B。結果顯示，Snail和N-cadherin蛋白在PTC癌組織中的蛋白表達水平均高于相應癌旁正常組織，差異有統計學意義（P < 0.001，P < 0.001）；Snail和N-cadherin蛋白在PTC有淋巴結轉移癌組織中蛋白表達水平均明顯高于無淋巴結轉移組織中蛋白表達水平，差異亦有統計學意義（P < 0.001，P < 0.001）。
圖3
Western blot法檢測Snail和N-cadherin在PTC癌旁正常組織、無淋巴結轉移癌組織及有淋巴結轉移癌組織中的表達情況。3A：定性結果。3B：半定量結果。與癌旁正常組織比較，* P < 0.001；與無淋巴結轉移癌組織比較，△P < 0.001
2.3 Snail和N-cadherin在PTC細胞株TPC-1中的表達與調節
Western blot結果顯示，PTC細胞株TPC-1在無血清培養基DMEM中可正常組成性表達Snail與N-cadherin蛋白；然而，在TGF-β1（50 ng/mL）誘導后TPC-1中的Snail與N-cadherin蛋白表達量相對于無血清對照組分別升高2.6倍、2.1倍，差異均有統計學意義（P < 0.001，P < 0.001）。見圖 4A、4B。
圖4
Western blot法檢測Snail和N-cadherin在PTC細胞株TPC-1無血清對照組與TGF-β1刺激組中蛋白的表達情況。4A：定性結果。4B：半定量結果。與無血清對照組比較，* P < 0.001
2.4 Snail和N-cadherin蛋白陽性表達與PTC患者臨床病理特征的關系
Snail和N-cadherin在PTC癌組織中的表達與患者的性別、年齡及腫瘤大小均無關（P > 0.01）。Snail和N-cadherin在淋巴結有轉移的PTC癌組織中的表達陽性率均明顯高于無淋巴結轉移者，差異有統計學意義（P < 0.01）。見表 1。
表1
Snail和N-cadherin在PTC癌組織中的表達與PTC患者臨床病理特征的關系（例）
2.5 Snail和N-cadherin在PTC癌組織中表達的相關性分析結果
Spearman相關性分析發現，Snail和N-cadherin在PTC癌組織中的表達呈正相關性（rs=0.721，P < 0.001），見表 2。
表2
Snail和N-cadherin在PTC癌組織中表達的相關性分析結果（例）
3 討論
轉錄因子Snail屬于Snail家族中的一員，其他成員主要包括ZEB1、Slug、SIP1g等[3]。Snail家族成員的分子結構極為相似但結構較為特殊，其-COOH末端表現為高度保守，而-NH2末端則結構多變。有研究[4]發現，Snail基因在胰腺癌組織中的表達與癌細胞的形態學變化有關，提示Snail在上皮間質化轉變中有一定的作用。本研究結果發現，Snail在PTC癌組織中的表達陽性率為85.0%，明顯高于癌周正常組織（0），并且Snail在PTC癌組織中的蛋白表達與PTC的淋巴結轉移有關，結果提示Snail在PTC轉移中起一定作用。
黏附素cadherin家族的主要成分為單鏈跨膜糖蛋白，成員間的結構和功能亦具有共同點。根據組織來源，cadherin被分為3類：上皮（E）、神經（N）及胎盤（P）[5]。已有文獻[6]報道，E-cadherin可與β-catenin相互作用，結合為cadherin/catenin復合物，以此維持上皮細胞的結構與功能；同時，E-cadherin的下調則參與上皮間質轉化、腫瘤細胞浸潤轉移[7]；然而N-cadherin上調可能與腫瘤轉移關系最密切。在病理情況下，N-cadherin的上調可影響纖維生長因子受體的內化進而維持生長因子的信號傳導[8]，導致細胞黏附性減小并易發生淋巴道轉移[9-11]。提示N-cadherin影響了PTC細胞間或與基質間的黏附作用，促使癌細胞組織浸潤和淋巴結轉移。本研究對N-cadherin的研究結果發現，N-cadherin蛋白在PTC癌組織中的表達陽性率為78.3%，明顯高于其在癌周正常組織中的表達（0），并且有淋巴轉移的患者中N-cadherin蛋白表達陽性率明顯高于無淋巴結轉移者（P < 0.01），結果提示，N-cadherin與PTC的淋巴結轉移有密切的關系。也有研究認為，PTC細胞增殖較快而壓迫腺體周圍血管導致乏氧[12-14]，乏氧可增強間質化相關因子（N-cadherin、Snail、TGF）的表達[15]。
在其他腫瘤的研究中證明，Snail可通過直接抑制E-cadherin的轉錄進而減弱癌細胞間黏附特性[16]，從而導致乳腺癌的浸潤轉移[17]。有關機制研究[18-19]表明，Snail分子的鋅指結構域與E-cadherin基因中的CANNTG序列直接結合，繼而阻止E-cadherin的轉錄，同時Snail亦調節了N-cadherin的轉錄。另外，我們進一步從細胞蛋白水平驗證Snail與N-cadherin可在PTC組織與細胞株TPC-1中表達且與淋巴結轉移相關，同時在細胞株TPC-1中，Snail與N-cadherin可被TGF-β1誘導上調。以上研究結果提示，Snail與N-cadherin在上皮間質化中起重要作用以及在腫瘤發生與轉移中的重要意義[20-21]。
綜上所述，在PTC的發生、發展中，Snail和N-cadherin表達上調促進了PTC浸潤和轉移，二者的結合對于診斷PTC的早期轉移及開發更具特異性的治療藥物可能具有重要意義。
