引用本文： 刁永鵬, 郭李龍, 連利珊, 閆盛, 陳厚早, 李擁軍. 神經生長因子基因轉染對缺血肢體血管生成和骨骼肌纖維重塑的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(2): 166-170. doi: 10.7507/1007-9424.20150045 復制
目前對于外周動脈性疾病患者進行生長因子基因或干細胞促血管生成治療的效果不甚理想。進一步的研究[1-3]發現，神經因素在下肢缺血性疾病治療性血管生成中可能具有重要作用，但這些研究僅從“促血管生成”為單一切入點，忽視了對缺血的效應組織-骨骼肌纖維重塑的研究。本研究從“血管”和“肌肉”兩個方面出發，觀察神經生長因子（nerve growth factor，NGF）對缺血肢體血管生成和骨骼肌纖維重塑的影響，探討NGF與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管生成中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料
1.1.1 實驗動物及分組
雌性ICR小鼠18只（北京維通利華實驗動物技術有限公司），SPF級，6周齡，體質量25～30 g。按隨機數字表法分為正常對照組、空白對照組和NGF基因治療組（簡稱“NGF組”），每組各6只。標準飼料分籠飼養，自由飲食，室溫（22±2）℃，相對濕度50%～70%，12 h光照交替（光照：8:00～20:00；黑暗：20:00～次日8:00）。實驗動物許可證號：SCXK（京）2009-0015。動物實驗經北京協和醫院實驗動物倫理委員會批準。
1.1.2 主要材料
體視顯微鏡，SM27457，Nikon；顯微手術器械，北方三友醫療器械有限公司；切片機，RM2255，Leica；倒置顯微鏡，DFC420，Leica；全自動酶標儀，MULTISKAN MK3，Thermo。主要試劑：質粒大量提取試劑盒，天根公司，北京；兔抗小鼠CD34單克隆抗體，Abcam公司，美國；增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體，Abcam公司，美國；ELISA試劑盒，Cusabio公司，美國；堿性三磷酸腺苷（ATP）酶工作液，中國醫學科學院基礎所。
1.2 實驗方法
1.2.1 質粒的制備
取制備好的感受態大腸桿菌DH5-α溶液200μL置于1.5 mL Eppendorf管中，加入10μL連接反應液，輕輕混勻后，冰浴上靜置5 min，然后涂布于經37℃預熱2 h的含抗生素LB平板，37℃溫箱培養8 h。無菌牙簽挑取單個轉化菌落，接種到5 mL LB培養基中，于37℃劇烈振蕩過夜。取0.1 mL過夜培養物加入含抗菌素的25 mL LB培養基中，37℃振蕩4 h后轉移至含抗菌素的500 mL LB培養基中，37℃振蕩2.5 h后加入2.5 mL氨芐青霉素溶液(50 mg/mL)，37℃振蕩培養過夜。根據質粒大量提取試劑盒說明書進行質粒提取。
1.2.2 后肢缺血模型構建和基因轉染
腹腔注射1%戊巴比妥鈉（35 mg/kg），麻醉完畢，將小鼠仰臥固定于平板上，備皮、消毒，取左后肢腹股溝下縱切口，長約2 cm，分離皮下組織，游離出股動脈，將其主干及主要分支分別以6-0 Prolene縫線結扎、切斷，3-0絲線縫合切口。術后第7 d，在患肢腓腸肌內進行生理鹽水或質粒多點注射，每次注射時間大于15 s。空白對照組：生理鹽水200μL；NGF組：NGF質粒125μg（200μL）。
1.2.3 肢體功能評估和取材
術后第21 d（基因轉染后第14 d）時，首先對3組小鼠左后肢進行功能評估[4]：患肢壞疽脫落為4分；爬行拖拽或肢體出現重度發黑、皮下組織缺損或壞疽為3分；患肢爬行拖拽不明顯，但患側足無跖屈或肢體有中度發黑為2分；牽拉尾部時患側足跖屈抗牽拉或肢體輕度發黑為1分；牽拉尾部時患側足底與對側肢體外觀無明顯區別為0分。然后將小鼠以1%戊巴比妥鈉麻醉后取左后肢腓腸肌，分為3份，1份迅速以冰凍切片包埋劑包埋后液氮冷凍保存、1份直接液氮冷凍保存、1份以4%多聚甲醛固定保存，取材后處死小鼠。
1.2.7 組織學檢查
①取4%多聚甲醛固定的標本進行石蠟包埋、切片，HE染色，觀察骨骼肌萎縮程度。②采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（streptavidin-perosidase，SP法）進行PCNA和CD34免疫組織化學染色，嚴格按試劑盒說明操作。在Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件下，隨機選取5個視野（×200），記錄PCNA陽性內皮細胞數和總細胞數，取其平均值計算血管內皮細胞增殖指數（陽性內皮細胞數/總細胞數），記錄CD34陽性毛細血管數和肌纖維數，取其平均值計算毛細血管密度（毛細血管數/肌纖維數）。③參照ELISA試劑盒使用說明檢測腓腸肌組織中NGF和VEGF蛋白的表達量（pg/ml）。④取冰凍腓腸肌組織進行肌球蛋白ATP酶堿性染色，Ⅱ型肌纖維（快肌纖維）呈深褐色，Ⅰ型肌纖維（慢肌纖維）著色淺而呈明亮色，隨機選取5個視野（×200），記錄Ⅰ型肌纖維和Ⅱ型肌纖維個數，定量分析Ⅰ型肌纖維比例。
1.3 統計學方法
應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 左后肢功能缺血測評結果
術后第21 d時，正常對照組小鼠無左后肢缺血表現，空白對照組和NGF組小鼠患肢均有不同程度缺血表現。NGF組左后肢功能缺血評分（1.00±0.63）明顯低于空白對照組（2.17±0.75，P < 0.05），但高于正常對照組（0，P < 0.05）。
2.2 HE染色結果
術后第21 d時，正常對照組肌肉組織無萎縮（圖 1A），與正常對照組相比，空白對照組（圖 1B）和NGF組（圖 1C）腓腸肌均出現肌肉組織萎縮、肌間隙增寬，部分肌細胞增殖，但空白對照組肌肉萎縮程度較NGF組更明顯。
圖1
各組術后第21 d時肌肉組織的組織學改變（HE×200）。1A：正常對照組；1B：空白對照組；1C：NGF組?圖 2??各組術后第21 d時PCNA免疫組織化學染色結果（SP×200）。2A：正常對照組。2B：空白對照組。2C：NGF組。2D：內皮細胞增殖指數。與正常對照組比較，* P < 0.05；與空白對照組比較，△P < 0.05??圖 3??各組術后第21 d時CD34免疫組織化學染色結果（SP×200）。3A：正常對照組。3B：空白對照組。3C：NGF組。3D：毛細血管密度。與正常對照組比較，* P < 0.05；與空白對照組比較，△P < 0.05
2.3 免疫組織化學染色結果
2.3.1 PCNA
免疫組織化學染色的定性結果見圖 2A～2C。術后第21 d時，與正常對照組相比，空白對照組的內皮細胞增殖指數無明顯升高（P > 0.05），但NGF組的內皮細胞增殖指數明顯升高，明顯高于正常對照組（P < 0.05）和空白對照組（P < 0.05），見圖 2D。
2.3.2 CD34
免疫組織化學染色的定性結果見圖 3A～3C。術后第21 d時，NGF組和空白對照組內皮細胞CD34的表達較正常對照組明顯升高（P < 0.05），NGF組的毛細血管密度明顯高于空白對照組（P < 0.05），見圖 3D。
2.4 NGF和VEGF的表達
結果見圖 4。術后第21 14d時，與正常對照組相比，空白對照組和NGF組的NGF和VEGF表達量均明顯升高（P < 0.05），并且NGF組的NGF和VEGF表達量均明顯高于空白對照組（P < 0.05）。
圖4
各組術后第21 d時NGF和VEGF表達結果。4A：NGF表達；4B：VEGF表達。與正常對照組比較，* P < 0.05；與空白對照組比較，△P < 0.05??圖 5??各組術后第21 d時肌球蛋白ATP酶堿性染色結果（ATP酶堿性染色×200）。白色：Ⅰ型；黑色：Ⅱ型。5A：正常對照組。5B：空白對照組。5C：NGF組。5D：Ⅰ型肌纖維比例。與正常對照組比較，* P < 0.05；與空白對照組比較，△P < 0.05
2.5 骨骼肌肌纖維類型變化
腓腸肌肌球蛋白ATP酶堿性染色的定性結果見圖 5A～5C。術后第21 d時，與正常對照組相比，空白對照組Ⅰ型肌纖維比例明顯降低（P < 0.05）；基因轉染后第14 d時即NGF組，與空白對照組相比，Ⅰ型肌纖維比例明顯升高（P < 0.05），見圖 5D。
3 討論
基礎研究表明，血管和神經在發育、再生中有著密不可分的關系。VEGF是目前研究最多的具有促血管生成作用的細胞因子，且研究[5]發現，VEGF還具有神經保護作用。NGF作為最重要的神經營養因子，在促進周圍神經的再生的同時還具有促進血管生成的作用[1-2]。但目前對于VEGF和NGF在促進下肢缺血性疾病血管生成中的關系仍未完全闡明。
Renault等[6]研究發現，去除小鼠缺血肢體的神經支配后，由缺血誘導的毛細血管生成作用明顯減弱，缺血肌肉組織中VEGF-A、血管生成素-1和神經營養因子-3的表達也顯著降低，這提示我們神經因素在外周動脈性疾病血管生成中具有重要作用。本研究中，我們對小鼠缺血后肢進行NGF基因轉染后發現，其肢體功能恢復明顯優于單純后肢缺血小鼠，組織學研究顯示，NGF基因轉染后，小鼠的肌肉組織萎縮程度明顯降低，血管內皮細胞增殖活躍，毛細血管生成明顯增多，這表明NGF具有促進缺血肢體血管生成的作用。目前認為NGF的促血管生成作用可通過以下幾條信號通路實現：誘導內皮祖細胞增殖、遷移和分化[7-8]；激活Src-PI3K-Akt通路導致蛋白激酶G和絲裂原活化蛋白激酶的激活從而促進內皮細胞增生[9]；激活磷脂酰肌醇3-激酶和ERK兩個通路誘導基質金屬蛋白酶-2和NO合成，促進內皮細胞增殖、遷移；NGF也可直接誘導內皮細胞表達VEGF [1, 10]。本研究結果顯示，NGF基因轉染后腓腸肌組織中NGF和VEGF的表達明顯升高，這表明NGF具有促進VEGF表達的作用，但其具體的信號調控機制目前仍需進一步研究闡明。
外周動脈性疾病患者主要表現為間歇性跛行，且隨著肢體缺血加重，間歇性跛行距離逐漸減少，最終將導致肢體潰瘍、壞死，喪失活動能力，嚴重影響患者的生存質量。以往的研究主要集中于如何恢復或提高缺血肢體的血流灌注上，而對于缺血后的靶器官——肌肉的組織結構方面的研究卻很少涉及。哺乳動物骨骼肌的收縮特性是由肌球蛋白重鏈亞型決定的。肌球蛋白重鏈具有ATP酶活性，通常也稱為肌球蛋白ATP酶[11]。不同的肌球蛋白重鏈亞型具有不同的ATP酶特點，決定骨骼肌纖維不同的生理特性。根據骨骼肌纖維所含肌球蛋白重鏈亞型的不同主要分為慢肌纖維（Ⅰ型）和快肌纖維（Ⅱ型），慢肌纖維主要表達肌球蛋白重鏈-Ⅰ亞型，有氧代謝能力強，收縮速率慢，但持續時間長、不易疲勞；快肌纖維主要表達肌球蛋白重鏈-Ⅱ亞型，無氧代謝能力較強，收縮速度快，收縮時產生的張力大，但收縮不能持久，易疲勞[12-13]。受運動負荷、血流灌注、神經支配和能量代謝等影響肌球蛋白重鏈亞型之間可以相互轉變，從而引起相應肌纖維類型的轉變[14-17]。
外周動脈性疾病患者的肌肉長期處于缺血、缺氧狀態，肌肉組織的氧化還原酶、線粒體酶功能會隨著缺血、缺氧發生適應性轉變。正常的腓腸肌以Ⅱ型肌纖維為主，屬于快速收縮肌。本研究發現，空白對照組小鼠缺血后肢腓腸肌Ⅰ型肌纖維比例較正常對照組明顯降低，相應的Ⅱ型肌纖維比例進一步提高，這說明其肌肉纖維發生了從Ⅰ型向Ⅱ型重塑。McGuigan等[18]在對外周動脈性疾病患者的腓腸肌組織進行ATP酶染色后也發現了類似的肌纖維重塑。這種轉變是機體的一種適應性反應，它可以提供患者短距離行走的能量供應，導致其運動能力明顯下降。本研究發現，在后肢缺血的基礎上進行NGF基因轉染后發現，其Ⅰ型肌纖維比例較空白對照組明顯升高，說明NGF能夠抑制肢體缺血后Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維重塑，提高其Ⅰ型肌纖維的比例，從而提高其有氧代謝的能力。關于骨骼肌纖維重塑的原因，目前認為主要與其能量代謝方式的轉變有關[19-20]。轉錄活化因子PGC-1α、核受體PPARβ/δ和ERRγ是調控細胞能量代謝的重要因子，骨骼肌PGC-1α、PPARβ/δ、ERRγ蛋白表達增加，能夠提高Ⅰ型肌纖維的比例[21-23]。另外，Matsakas等[15]研究發現，ERRγ在誘導肌纖維重塑的同時還能促進缺血肌肉血管生成、恢復其血流灌注。本研究中對缺血肌肉進行NGF基因轉染后其Ⅰ型肌纖維比例增加，分析可能與缺血肌肉內毛細血管生成增多，血流量和氧供增加，線粒體內氧化酶的數量和功能恢復有關，其相關分子機制仍需要進一步深入研究。此外，基因轉染后隨著NGF和VEGF蛋白表達增加、缺血肌肉血流恢復，缺血性神經損傷得到一定程度的緩解，也可以引起肌纖維類型的轉變[24-25]。
綜上所述，NGF基因轉染能夠促進缺血肢體VEGF表達和血管生成，誘導Ⅰ型肌纖維表達增加，涉及的相關分子調控機制仍需進一步研究。
目前對于外周動脈性疾病患者進行生長因子基因或干細胞促血管生成治療的效果不甚理想。進一步的研究[1-3]發現，神經因素在下肢缺血性疾病治療性血管生成中可能具有重要作用，但這些研究僅從“促血管生成”為單一切入點，忽視了對缺血的效應組織-骨骼肌纖維重塑的研究。本研究從“血管”和“肌肉”兩個方面出發，觀察神經生長因子（nerve growth factor，NGF）對缺血肢體血管生成和骨骼肌纖維重塑的影響，探討NGF與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管生成中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料
1.1.1 實驗動物及分組
雌性ICR小鼠18只（北京維通利華實驗動物技術有限公司），SPF級，6周齡，體質量25～30 g。按隨機數字表法分為正常對照組、空白對照組和NGF基因治療組（簡稱“NGF組”），每組各6只。標準飼料分籠飼養，自由飲食，室溫（22±2）℃，相對濕度50%～70%，12 h光照交替（光照：8:00～20:00；黑暗：20:00～次日8:00）。實驗動物許可證號：SCXK（京）2009-0015。動物實驗經北京協和醫院實驗動物倫理委員會批準。
1.1.2 主要材料
體視顯微鏡，SM27457，Nikon；顯微手術器械，北方三友醫療器械有限公司；切片機，RM2255，Leica；倒置顯微鏡，DFC420，Leica；全自動酶標儀，MULTISKAN MK3，Thermo。主要試劑：質粒大量提取試劑盒，天根公司，北京；兔抗小鼠CD34單克隆抗體，Abcam公司，美國；增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體，Abcam公司，美國；ELISA試劑盒，Cusabio公司，美國；堿性三磷酸腺苷（ATP）酶工作液，中國醫學科學院基礎所。
1.2 實驗方法
1.2.1 質粒的制備
取制備好的感受態大腸桿菌DH5-α溶液200μL置于1.5 mL Eppendorf管中，加入10μL連接反應液，輕輕混勻后，冰浴上靜置5 min，然后涂布于經37℃預熱2 h的含抗生素LB平板，37℃溫箱培養8 h。無菌牙簽挑取單個轉化菌落，接種到5 mL LB培養基中，于37℃劇烈振蕩過夜。取0.1 mL過夜培養物加入含抗菌素的25 mL LB培養基中，37℃振蕩4 h后轉移至含抗菌素的500 mL LB培養基中，37℃振蕩2.5 h后加入2.5 mL氨芐青霉素溶液(50 mg/mL)，37℃振蕩培養過夜。根據質粒大量提取試劑盒說明書進行質粒提取。
1.2.2 后肢缺血模型構建和基因轉染
腹腔注射1%戊巴比妥鈉（35 mg/kg），麻醉完畢，將小鼠仰臥固定于平板上，備皮、消毒，取左后肢腹股溝下縱切口，長約2 cm，分離皮下組織，游離出股動脈，將其主干及主要分支分別以6-0 Prolene縫線結扎、切斷，3-0絲線縫合切口。術后第7 d，在患肢腓腸肌內進行生理鹽水或質粒多點注射，每次注射時間大于15 s。空白對照組：生理鹽水200μL；NGF組：NGF質粒125μg（200μL）。
1.2.3 肢體功能評估和取材
術后第21 d（基因轉染后第14 d）時，首先對3組小鼠左后肢進行功能評估[4]：患肢壞疽脫落為4分；爬行拖拽或肢體出現重度發黑、皮下組織缺損或壞疽為3分；患肢爬行拖拽不明顯，但患側足無跖屈或肢體有中度發黑為2分；牽拉尾部時患側足跖屈抗牽拉或肢體輕度發黑為1分；牽拉尾部時患側足底與對側肢體外觀無明顯區別為0分。然后將小鼠以1%戊巴比妥鈉麻醉后取左后肢腓腸肌，分為3份，1份迅速以冰凍切片包埋劑包埋后液氮冷凍保存、1份直接液氮冷凍保存、1份以4%多聚甲醛固定保存，取材后處死小鼠。
1.2.7 組織學檢查
①取4%多聚甲醛固定的標本進行石蠟包埋、切片，HE染色，觀察骨骼肌萎縮程度。②采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（streptavidin-perosidase，SP法）進行PCNA和CD34免疫組織化學染色，嚴格按試劑盒說明操作。在Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件下，隨機選取5個視野（×200），記錄PCNA陽性內皮細胞數和總細胞數，取其平均值計算血管內皮細胞增殖指數（陽性內皮細胞數/總細胞數），記錄CD34陽性毛細血管數和肌纖維數，取其平均值計算毛細血管密度（毛細血管數/肌纖維數）。③參照ELISA試劑盒使用說明檢測腓腸肌組織中NGF和VEGF蛋白的表達量（pg/ml）。④取冰凍腓腸肌組織進行肌球蛋白ATP酶堿性染色，Ⅱ型肌纖維（快肌纖維）呈深褐色，Ⅰ型肌纖維（慢肌纖維）著色淺而呈明亮色，隨機選取5個視野（×200），記錄Ⅰ型肌纖維和Ⅱ型肌纖維個數，定量分析Ⅰ型肌纖維比例。
1.3 統計學方法
應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 左后肢功能缺血測評結果
術后第21 d時，正常對照組小鼠無左后肢缺血表現，空白對照組和NGF組小鼠患肢均有不同程度缺血表現。NGF組左后肢功能缺血評分（1.00±0.63）明顯低于空白對照組（2.17±0.75，P < 0.05），但高于正常對照組（0，P < 0.05）。
2.2 HE染色結果
術后第21 d時，正常對照組肌肉組織無萎縮（圖 1A），與正常對照組相比，空白對照組（圖 1B）和NGF組（圖 1C）腓腸肌均出現肌肉組織萎縮、肌間隙增寬，部分肌細胞增殖，但空白對照組肌肉萎縮程度較NGF組更明顯。
圖1
各組術后第21 d時肌肉組織的組織學改變（HE×200）。1A：正常對照組；1B：空白對照組；1C：NGF組?圖 2??各組術后第21 d時PCNA免疫組織化學染色結果（SP×200）。2A：正常對照組。2B：空白對照組。2C：NGF組。2D：內皮細胞增殖指數。與正常對照組比較，* P < 0.05；與空白對照組比較，△P < 0.05??圖 3??各組術后第21 d時CD34免疫組織化學染色結果（SP×200）。3A：正常對照組。3B：空白對照組。3C：NGF組。3D：毛細血管密度。與正常對照組比較，* P < 0.05；與空白對照組比較，△P < 0.05
2.3 免疫組織化學染色結果
2.3.1 PCNA
免疫組織化學染色的定性結果見圖 2A～2C。術后第21 d時，與正常對照組相比，空白對照組的內皮細胞增殖指數無明顯升高（P > 0.05），但NGF組的內皮細胞增殖指數明顯升高，明顯高于正常對照組（P < 0.05）和空白對照組（P < 0.05），見圖 2D。
2.3.2 CD34
免疫組織化學染色的定性結果見圖 3A～3C。術后第21 d時，NGF組和空白對照組內皮細胞CD34的表達較正常對照組明顯升高（P < 0.05），NGF組的毛細血管密度明顯高于空白對照組（P < 0.05），見圖 3D。
2.4 NGF和VEGF的表達
結果見圖 4。術后第21 14d時，與正常對照組相比，空白對照組和NGF組的NGF和VEGF表達量均明顯升高（P < 0.05），并且NGF組的NGF和VEGF表達量均明顯高于空白對照組（P < 0.05）。
圖4
各組術后第21 d時NGF和VEGF表達結果。4A：NGF表達；4B：VEGF表達。與正常對照組比較，* P < 0.05；與空白對照組比較，△P < 0.05??圖 5??各組術后第21 d時肌球蛋白ATP酶堿性染色結果（ATP酶堿性染色×200）。白色：Ⅰ型；黑色：Ⅱ型。5A：正常對照組。5B：空白對照組。5C：NGF組。5D：Ⅰ型肌纖維比例。與正常對照組比較，* P < 0.05；與空白對照組比較，△P < 0.05
2.5 骨骼肌肌纖維類型變化
腓腸肌肌球蛋白ATP酶堿性染色的定性結果見圖 5A～5C。術后第21 d時，與正常對照組相比，空白對照組Ⅰ型肌纖維比例明顯降低（P < 0.05）；基因轉染后第14 d時即NGF組，與空白對照組相比，Ⅰ型肌纖維比例明顯升高（P < 0.05），見圖 5D。
3 討論
基礎研究表明，血管和神經在發育、再生中有著密不可分的關系。VEGF是目前研究最多的具有促血管生成作用的細胞因子，且研究[5]發現，VEGF還具有神經保護作用。NGF作為最重要的神經營養因子，在促進周圍神經的再生的同時還具有促進血管生成的作用[1-2]。但目前對于VEGF和NGF在促進下肢缺血性疾病血管生成中的關系仍未完全闡明。
Renault等[6]研究發現，去除小鼠缺血肢體的神經支配后，由缺血誘導的毛細血管生成作用明顯減弱，缺血肌肉組織中VEGF-A、血管生成素-1和神經營養因子-3的表達也顯著降低，這提示我們神經因素在外周動脈性疾病血管生成中具有重要作用。本研究中，我們對小鼠缺血后肢進行NGF基因轉染后發現，其肢體功能恢復明顯優于單純后肢缺血小鼠，組織學研究顯示，NGF基因轉染后，小鼠的肌肉組織萎縮程度明顯降低，血管內皮細胞增殖活躍，毛細血管生成明顯增多，這表明NGF具有促進缺血肢體血管生成的作用。目前認為NGF的促血管生成作用可通過以下幾條信號通路實現：誘導內皮祖細胞增殖、遷移和分化[7-8]；激活Src-PI3K-Akt通路導致蛋白激酶G和絲裂原活化蛋白激酶的激活從而促進內皮細胞增生[9]；激活磷脂酰肌醇3-激酶和ERK兩個通路誘導基質金屬蛋白酶-2和NO合成，促進內皮細胞增殖、遷移；NGF也可直接誘導內皮細胞表達VEGF [1, 10]。本研究結果顯示，NGF基因轉染后腓腸肌組織中NGF和VEGF的表達明顯升高，這表明NGF具有促進VEGF表達的作用，但其具體的信號調控機制目前仍需進一步研究闡明。
外周動脈性疾病患者主要表現為間歇性跛行，且隨著肢體缺血加重，間歇性跛行距離逐漸減少，最終將導致肢體潰瘍、壞死，喪失活動能力，嚴重影響患者的生存質量。以往的研究主要集中于如何恢復或提高缺血肢體的血流灌注上，而對于缺血后的靶器官——肌肉的組織結構方面的研究卻很少涉及。哺乳動物骨骼肌的收縮特性是由肌球蛋白重鏈亞型決定的。肌球蛋白重鏈具有ATP酶活性，通常也稱為肌球蛋白ATP酶[11]。不同的肌球蛋白重鏈亞型具有不同的ATP酶特點，決定骨骼肌纖維不同的生理特性。根據骨骼肌纖維所含肌球蛋白重鏈亞型的不同主要分為慢肌纖維（Ⅰ型）和快肌纖維（Ⅱ型），慢肌纖維主要表達肌球蛋白重鏈-Ⅰ亞型，有氧代謝能力強，收縮速率慢，但持續時間長、不易疲勞；快肌纖維主要表達肌球蛋白重鏈-Ⅱ亞型，無氧代謝能力較強，收縮速度快，收縮時產生的張力大，但收縮不能持久，易疲勞[12-13]。受運動負荷、血流灌注、神經支配和能量代謝等影響肌球蛋白重鏈亞型之間可以相互轉變，從而引起相應肌纖維類型的轉變[14-17]。
外周動脈性疾病患者的肌肉長期處于缺血、缺氧狀態，肌肉組織的氧化還原酶、線粒體酶功能會隨著缺血、缺氧發生適應性轉變。正常的腓腸肌以Ⅱ型肌纖維為主，屬于快速收縮肌。本研究發現，空白對照組小鼠缺血后肢腓腸肌Ⅰ型肌纖維比例較正常對照組明顯降低，相應的Ⅱ型肌纖維比例進一步提高，這說明其肌肉纖維發生了從Ⅰ型向Ⅱ型重塑。McGuigan等[18]在對外周動脈性疾病患者的腓腸肌組織進行ATP酶染色后也發現了類似的肌纖維重塑。這種轉變是機體的一種適應性反應，它可以提供患者短距離行走的能量供應，導致其運動能力明顯下降。本研究發現，在后肢缺血的基礎上進行NGF基因轉染后發現，其Ⅰ型肌纖維比例較空白對照組明顯升高，說明NGF能夠抑制肢體缺血后Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維重塑，提高其Ⅰ型肌纖維的比例，從而提高其有氧代謝的能力。關于骨骼肌纖維重塑的原因，目前認為主要與其能量代謝方式的轉變有關[19-20]。轉錄活化因子PGC-1α、核受體PPARβ/δ和ERRγ是調控細胞能量代謝的重要因子，骨骼肌PGC-1α、PPARβ/δ、ERRγ蛋白表達增加，能夠提高Ⅰ型肌纖維的比例[21-23]。另外，Matsakas等[15]研究發現，ERRγ在誘導肌纖維重塑的同時還能促進缺血肌肉血管生成、恢復其血流灌注。本研究中對缺血肌肉進行NGF基因轉染后其Ⅰ型肌纖維比例增加，分析可能與缺血肌肉內毛細血管生成增多，血流量和氧供增加，線粒體內氧化酶的數量和功能恢復有關，其相關分子機制仍需要進一步深入研究。此外，基因轉染后隨著NGF和VEGF蛋白表達增加、缺血肌肉血流恢復，缺血性神經損傷得到一定程度的緩解，也可以引起肌纖維類型的轉變[24-25]。
綜上所述，NGF基因轉染能夠促進缺血肢體VEGF表達和血管生成，誘導Ⅰ型肌纖維表達增加，涉及的相關分子調控機制仍需進一步研究。
