引用本文： 張示杰, 吳何興, 李琪, 吳向未, 張小昭, 王彥超, 連文波. 沙鼠肝泡球蚴組織中微血管密度、血管內皮生長因子的表達及意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(2): 134-138. doi: 10.7507/1007-9424.20150038 復制
泡球蚴病又稱“蟲癌”，是多房棘球絳蟲（echinococcus multilocularis）的幼蟲寄生于人體引起最為嚴重的致死性人畜共患寄生蟲病之一，該病幾乎均原發于肝臟，具有與惡性腫瘤尤其是肝癌類似的浸潤和轉移的生物學行為[1-2]。目前泡球蚴病已被列入國家免費救治項目，但有關其浸潤性生長的機制目前尚不完全明確。CD34是高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，屬于表面分子涎酸蛋白家族成員之一，在腫瘤血管生成的過程中起著重要的作用[3-4]。近年來，CD34被作為檢測微血管密度（MVD）常用的分子生物學指標[5-6]。血管內皮生長因子（VEGF）是目前公認的最強的促血管生成因子之一[7]，它可以促使內皮細胞增殖、遷移，并誘導血管生成[8-9]。本研究擬通過MVD-CD34和VEGF在沙鼠肝泡球蚴組織中的表達情況初步探討血管新生在泡球蚴浸潤性生長中的作用。
1 材料與方法
1.1 主要材料
1.1.1 實驗動物
實驗用種鼠為人工腹腔感染泡球蚴18周的長爪沙鼠，由新疆醫科大學實驗動物中心提供；實驗用6周齡雌性健康長爪沙鼠購于新疆維吾爾自治區疾控中心，體質量（30±5）g。
1.1.2 主要試劑和儀器
CD34鼠抗鼠單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，VEGF兔抗鼠單克隆抗體購于英國Abcam公司，即用型免疫組織化學試劑盒（山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體）購于北京中杉生物有限公司，二氨基聯苯氨（DAB）顯色劑購于丹麥Dako公司。自動組織包埋機（Leica EG1160）及石蠟切片機（Leica 2245）均為德國Leica公司產品。光學顯微鏡（CX31RBSF）為日本Olympus公司產品，圖像采集系統（ExwaveHAD）為日本SONY公司產品。
1.2 原頭節混懸液的制備
采用頸椎脫臼法將人工腹腔感染多房棘球絳蟲18周的種鼠處死，無菌剖腹，選取光滑、成簇的游離于腹腔或附著在腹壁、腸系膜、肝表面的泡球蚴組織，置于無菌盤中，PBS漂洗3次，依次剪碎，勻漿，過篩，PBS漂洗3次，0.5%伊紅染色，倒置顯微鏡下觀察，并計數活頭節數目，配制成20%原頭節混懸夜，4℃冰箱短暫保存供接種使用。
1.3 實驗動物分組及模型的建立
60只長爪沙鼠采用隨機數字表法隨機分為模型組和對照組，每組30只，術前禁食水8 h。實驗動物消毒麻醉后，開腹直視下接種：模型組每只鼠接種0.1 mL原頭節懸混液（約400個活的原頭節），對照組每只鼠接種等量的PBS，關腹，烤燈照射復溫，清潔級動物房常規飼養。分別于感染后的第20、40、60、80及100 d每組隨機（方法同上）取6只沙鼠處死，模型組分別取泡球蚴組織以及泡球蚴組織周圍約0.2～0.5 cm處的肝組織，對照組取正常的肝組織。
1.4 組織病理學觀察
將上述標本置于10%的甲醛固定24 h后，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。4μm厚連續切片。蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下行病理學檢查觀察各標本的病理學改變。
1.5 免疫組織化學方法檢測MVD-CD34及VEGF的表達
1.5.1 免疫組織化學方法采用免疫組織化學
EnVision法檢測MVD-CD34及VEGF在各標本中的表達情況。大致步驟如下：將制備的石蠟切片依次脫蠟，脫水，枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）高壓修復10 min，自然冷卻至室溫，3% H2O2-PBS室溫孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶，PBS浸洗（5 min×3次），每張切片滴加50μL一抗（CD34工作濃度均為1∶200，VEGF工作濃度1∶100）4℃冰箱孵育過夜，PBS浸洗后每張切片滴加50μL EnVision工作液（山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體），37℃溫箱孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，酸酒精分化，依次脫水，透明，中性樹膠封片。每批次切片均PBS代替一抗作為陰性對照。
1.5.2 評判標準
①MVD-CD34評判標準：按照weidner等[10]校正方法，任何被抗體染色的單個內皮細胞或細胞團，不管是否形成管腔，只要與周圍的微血管或其他組織界限清楚，都認為是1個可計數的微血管。硬化區及交界處軟組織內微血管不計數，管腔直徑大于8個紅細胞直徑的血管，也排除在外。肝組織匯管區的微血管不納入研究范圍。每一個標本先低倍鏡（×10）選3個微血管最多的區域，在每一個區域中計數一個高倍（×40）鏡下的微血管數，取其平均值為該標本MVD值。②VEGF評判標準：根據著色強度和陽性細胞百分比進行評分。著色強度：不顯色或顯色不清記0分，黃色記1分，棕黃色記2分，黃褐色記3分；陽性細胞百分比：高倍鏡下隨機抽取5個陽性顯色視野，每個視野計數200個細胞，計算平均陽性百分比，< 5%記0分，6%~25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，> 75%記4分。著色強度和陽性細胞百分比評分的和作為最終評分。參照文獻[11]以均數±標準差（
1.6 統計學方法
應用SPSS 20.0軟件對實驗結果進行分析，所有實驗數據以
2 結果
2.1 組織病理學結果
實驗組各沙鼠肝臟上均可見泡球蚴組織，部分肝臟被泡球蚴組織侵蝕，甚至達匯管區。泡球蚴組織由大小不等的透亮囊泡組成，囊泡內有囊液及原頭節。囊泡之間有囊壁緊密連接，囊泡表面有血管附著，血管分布不均勻。HE染色可見囊壁的生發層和角質層，角質層外側有增殖浸潤區的形成，伴隨炎癥細胞和內皮細胞浸潤。增殖區以外的肝組織可見不同程度的氣球樣變性（圖 1）。對照組肝組織未見明顯的改變。
圖1
示感染后第80 d時沙鼠肝泡球蚴組織及其周圍肝組織染色情況（HE×100）
2.2 MVD-CD34免疫組織化學檢測結果
各沙鼠感染泡球蚴病后各時間點的正常肝組織以及第20 d時泡球蚴周圍肝組織均未見CD34的表達，而感染泡球蚴病后各時間點泡球蚴組織及40 d后泡球蚴周圍肝組織內均有CD34不同程度的表達，定位于內皮細胞的胞漿，成扁圓形、條索狀或者圓形，部分有管腔形成（圖 2），隨著感染時間延長，表達呈上升趨勢，在感染后的第100 d時達最高，與泡球蚴周圍肝組織及正常肝組織相比，各時間點比較差異均有統計學意義（P < 0.05），見表 1。
圖2
示在感染后第80 d時MVD-CD34在各組織中的表達情況（EnVision×200）。2A：正常肝組織；2B：泡球蚴組織；2C：泡球蚴周圍肝組織??圖 3??示在感染后第80 d時各組織中VEGF的表達情況（EnVision×200）。3A：正常肝組織；3B：泡球蚴組織；3C：泡球蚴周圍肝組織
表1
不同組織在不同時間點MVD-CD34的表達情況（個/HP，2.3 VEGF免疫組織化學檢測結果
各沙鼠感染泡球蚴病后的不同時間點泡球蚴組織、泡球蚴周圍肝組織以及正常肝組織中均可見VEGF不同程度的表達，見圖 3。泡球蚴組織中VEGF的表達定位于泡球蚴“外囊”囊壁梭形細胞的胞漿中，隨著感染時間延長，呈先上升后下降的趨勢，感染后第80 d時達最高，與正常肝組織中各時間點比較差異有統計學意義（P < 0.05），見表 2。
表2
不同組織在不同時間點VEGF的表達情況（分，3 討論
惡性腫瘤的浸潤性生長依賴于瘤體血管新生，這種生物學行為不僅可以為腫瘤的生長、侵襲及轉移提供必需的營養物質，亦可以為腫瘤的轉移提供通道[12]。研究[3-4]表明，CD34不僅具有造血作用，還可以通過促進內皮細胞的轉移進而促進血管新生。VEGF在腫瘤的侵襲、轉移過程中主要通過自分泌和旁分泌的形式特異性地作用于血管內皮細胞，通過促進血管內皮細胞增殖，增加血管的通透性，從而誘導血管生成，在惡性腫瘤的生長及轉移過程發揮關鍵作用[13-14]。目前抗血管治療已經成為腫瘤治療的熱點。而素有“蟲癌”之稱的肝泡球蚴病，目前手術仍是主要的根治方式，但大多數患者就診時已發生廣泛的浸潤和轉移，失去最佳手術時機[15]，因此，藥物治療仍是無法手術根治的泡球蚴患者的首選治療方式之一。但傳統藥物療效仍不理想，而且缺乏有效抑制泡球蚴侵襲和轉移的藥物[16]。基于以上理論依據和研究背景，我們開展這項研究，為泡球蚴病患者的保守治療提供新途徑。
本研究結果顯示，在感染泡球蚴病后的不同時間點，沙鼠肝泡球蚴組織中MVD-CD34和VEGF的表達均明顯高于泡球蚴周圍肝組織以及正常肝組織（均P < 0.05），這說明泡球蚴在侵襲性的生長過程中存在血管新生現象，而且VEGF可能在其中發揮了一定的作用。在感染后的第100 d，VEGF表達開始下降，但與感染第80 d比較，差異無統計學意義（t=-1.639，P=0.132），說明VEGF的表達仍持續在較高的水平。但這種表達下降的趨勢一方面可能與寄生蟲與宿主之間的免疫有關，3個月左右相當于泡球蚴自然病程中期，這一階段被認為是Th1免疫向Th2免疫漂移的關鍵時期[17]，宿主與寄生蟲體內的細胞因子表達水平發生劇烈變化。因此我們推測，一方面在這些細胞因子中有可能存在抑制VEGF表達的細胞因子；另一方面可能是泡球蚴的逐級芽生式[18]似癌樣浸潤性生長而不同于腫瘤如肝癌[19]的浸潤性生長。隨著感染時間延長，泡球蚴組織體積增大，而肉眼很難區別病灶生長先后順序，這極有可能導致取材時出現一定的誤差，因此大樣本量的研究是必要的。而在感染后第100 d時，MVD-CD34的表達仍處于較高的水平，這一方面可能是因為VEGF的持續作用，另一方面可能是其他促血管生成因子如骨橋蛋白[20-22]的作用，抑或是Vuitton等[23]提到的“泡球蚴自身分泌的類細胞因子物質”可能促進泡球蚴血管生成。具體尚待進一步研究。
此外，本研究結果還顯示，在泡球蚴周圍肝組織中，MVD-CD34和VEGF的表達也呈現出逐漸增高的趨勢，且在感染后第80 d時和第100 d時，MVD-CD34表達高于正常肝組織（P < 0.05），在感染后第100 d時，泡球蚴周圍肝組織中VEGF的表達高于正常肝組織（P < 0.05），這可能是隨著感染時間的延長，宿主肝組織由炎細胞浸潤向纖維化[24]方向發展而引起宿主肝組織血管新生有一定的關系。
王靜等[25]對27例人肝泡球蚴患者標本行VEGF免疫組織化學染色分析時發現，VEGF的表達并未增高，這與本研究結果存在一定的出入，原因可能是臨床上泡球蚴患者從感染到發病通常有數年甚至10年以上的潛伏期[26]，患者就診的時候肝臟纖維化程度較重，而進行動物實驗時，病程通常是明確的。而且本研究也發現，隨著感染時間的延長，肝纖維化程度加重，泡球蚴周圍的肝組織VEGF的表達逐漸增高。據此我們推測，隨著感染時間的進一步延長，也可能出現泡球蚴周圍肝組織中VEGF的表達進一步增高情況，但具體尚待進一步研究證實。桑澤杰等[27]采用肝動脈灌注貝伐單抗治療大鼠肝泡球蚴，發現其可以通過抑制VEGF的作用進而抑制血管生成，這也表明VEGF可以促進泡球蚴組織血管新生，但遺憾的是該研究未對組織中MVD進行檢測，因此持續采用VEGF抑制劑治療后再度量化血管生成的指標將成為研究的重點。
總之，本研究表明，在早期沙鼠肝泡球蚴組織中存在CD34和VEGF高表達的現象，這說明血管生成可能是泡球蚴浸潤性生長的機制之一，而且VEGF可能促進泡球蚴組織血管新生，但任何組織包括腫瘤在內其血管生成都是多種細胞因子作用的結果，因此，進一步深入的研究是必要的。本研究為泡球蚴病的血管化研究及抗血管治療提供了新途徑。
泡球蚴病又稱“蟲癌”，是多房棘球絳蟲（echinococcus multilocularis）的幼蟲寄生于人體引起最為嚴重的致死性人畜共患寄生蟲病之一，該病幾乎均原發于肝臟，具有與惡性腫瘤尤其是肝癌類似的浸潤和轉移的生物學行為[1-2]。目前泡球蚴病已被列入國家免費救治項目，但有關其浸潤性生長的機制目前尚不完全明確。CD34是高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，屬于表面分子涎酸蛋白家族成員之一，在腫瘤血管生成的過程中起著重要的作用[3-4]。近年來，CD34被作為檢測微血管密度（MVD）常用的分子生物學指標[5-6]。血管內皮生長因子（VEGF）是目前公認的最強的促血管生成因子之一[7]，它可以促使內皮細胞增殖、遷移，并誘導血管生成[8-9]。本研究擬通過MVD-CD34和VEGF在沙鼠肝泡球蚴組織中的表達情況初步探討血管新生在泡球蚴浸潤性生長中的作用。
1 材料與方法
1.1 主要材料
1.1.1 實驗動物
實驗用種鼠為人工腹腔感染泡球蚴18周的長爪沙鼠，由新疆醫科大學實驗動物中心提供；實驗用6周齡雌性健康長爪沙鼠購于新疆維吾爾自治區疾控中心，體質量（30±5）g。
1.1.2 主要試劑和儀器
CD34鼠抗鼠單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，VEGF兔抗鼠單克隆抗體購于英國Abcam公司，即用型免疫組織化學試劑盒（山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體）購于北京中杉生物有限公司，二氨基聯苯氨（DAB）顯色劑購于丹麥Dako公司。自動組織包埋機（Leica EG1160）及石蠟切片機（Leica 2245）均為德國Leica公司產品。光學顯微鏡（CX31RBSF）為日本Olympus公司產品，圖像采集系統（ExwaveHAD）為日本SONY公司產品。
1.2 原頭節混懸液的制備
采用頸椎脫臼法將人工腹腔感染多房棘球絳蟲18周的種鼠處死，無菌剖腹，選取光滑、成簇的游離于腹腔或附著在腹壁、腸系膜、肝表面的泡球蚴組織，置于無菌盤中，PBS漂洗3次，依次剪碎，勻漿，過篩，PBS漂洗3次，0.5%伊紅染色，倒置顯微鏡下觀察，并計數活頭節數目，配制成20%原頭節混懸夜，4℃冰箱短暫保存供接種使用。
1.3 實驗動物分組及模型的建立
60只長爪沙鼠采用隨機數字表法隨機分為模型組和對照組，每組30只，術前禁食水8 h。實驗動物消毒麻醉后，開腹直視下接種：模型組每只鼠接種0.1 mL原頭節懸混液（約400個活的原頭節），對照組每只鼠接種等量的PBS，關腹，烤燈照射復溫，清潔級動物房常規飼養。分別于感染后的第20、40、60、80及100 d每組隨機（方法同上）取6只沙鼠處死，模型組分別取泡球蚴組織以及泡球蚴組織周圍約0.2～0.5 cm處的肝組織，對照組取正常的肝組織。
1.4 組織病理學觀察
將上述標本置于10%的甲醛固定24 h后，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。4μm厚連續切片。蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下行病理學檢查觀察各標本的病理學改變。
1.5 免疫組織化學方法檢測MVD-CD34及VEGF的表達
1.5.1 免疫組織化學方法采用免疫組織化學
EnVision法檢測MVD-CD34及VEGF在各標本中的表達情況。大致步驟如下：將制備的石蠟切片依次脫蠟，脫水，枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）高壓修復10 min，自然冷卻至室溫，3% H2O2-PBS室溫孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶，PBS浸洗（5 min×3次），每張切片滴加50μL一抗（CD34工作濃度均為1∶200，VEGF工作濃度1∶100）4℃冰箱孵育過夜，PBS浸洗后每張切片滴加50μL EnVision工作液（山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體），37℃溫箱孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，酸酒精分化，依次脫水，透明，中性樹膠封片。每批次切片均PBS代替一抗作為陰性對照。
1.5.2 評判標準
①MVD-CD34評判標準：按照weidner等[10]校正方法，任何被抗體染色的單個內皮細胞或細胞團，不管是否形成管腔，只要與周圍的微血管或其他組織界限清楚，都認為是1個可計數的微血管。硬化區及交界處軟組織內微血管不計數，管腔直徑大于8個紅細胞直徑的血管，也排除在外。肝組織匯管區的微血管不納入研究范圍。每一個標本先低倍鏡（×10）選3個微血管最多的區域，在每一個區域中計數一個高倍（×40）鏡下的微血管數，取其平均值為該標本MVD值。②VEGF評判標準：根據著色強度和陽性細胞百分比進行評分。著色強度：不顯色或顯色不清記0分，黃色記1分，棕黃色記2分，黃褐色記3分；陽性細胞百分比：高倍鏡下隨機抽取5個陽性顯色視野，每個視野計數200個細胞，計算平均陽性百分比，< 5%記0分，6%~25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，> 75%記4分。著色強度和陽性細胞百分比評分的和作為最終評分。參照文獻[11]以均數±標準差（
1.6 統計學方法
應用SPSS 20.0軟件對實驗結果進行分析，所有實驗數據以
2 結果
2.1 組織病理學結果
實驗組各沙鼠肝臟上均可見泡球蚴組織，部分肝臟被泡球蚴組織侵蝕，甚至達匯管區。泡球蚴組織由大小不等的透亮囊泡組成，囊泡內有囊液及原頭節。囊泡之間有囊壁緊密連接，囊泡表面有血管附著，血管分布不均勻。HE染色可見囊壁的生發層和角質層，角質層外側有增殖浸潤區的形成，伴隨炎癥細胞和內皮細胞浸潤。增殖區以外的肝組織可見不同程度的氣球樣變性（圖 1）。對照組肝組織未見明顯的改變。
圖1
示感染后第80 d時沙鼠肝泡球蚴組織及其周圍肝組織染色情況（HE×100）
2.2 MVD-CD34免疫組織化學檢測結果
各沙鼠感染泡球蚴病后各時間點的正常肝組織以及第20 d時泡球蚴周圍肝組織均未見CD34的表達，而感染泡球蚴病后各時間點泡球蚴組織及40 d后泡球蚴周圍肝組織內均有CD34不同程度的表達，定位于內皮細胞的胞漿，成扁圓形、條索狀或者圓形，部分有管腔形成（圖 2），隨著感染時間延長，表達呈上升趨勢，在感染后的第100 d時達最高，與泡球蚴周圍肝組織及正常肝組織相比，各時間點比較差異均有統計學意義（P < 0.05），見表 1。
圖2
示在感染后第80 d時MVD-CD34在各組織中的表達情況（EnVision×200）。2A：正常肝組織；2B：泡球蚴組織；2C：泡球蚴周圍肝組織??圖 3??示在感染后第80 d時各組織中VEGF的表達情況（EnVision×200）。3A：正常肝組織；3B：泡球蚴組織；3C：泡球蚴周圍肝組織
表1
不同組織在不同時間點MVD-CD34的表達情況（個/HP，2.3 VEGF免疫組織化學檢測結果
各沙鼠感染泡球蚴病后的不同時間點泡球蚴組織、泡球蚴周圍肝組織以及正常肝組織中均可見VEGF不同程度的表達，見圖 3。泡球蚴組織中VEGF的表達定位于泡球蚴“外囊”囊壁梭形細胞的胞漿中，隨著感染時間延長，呈先上升后下降的趨勢，感染后第80 d時達最高，與正常肝組織中各時間點比較差異有統計學意義（P < 0.05），見表 2。
表2
不同組織在不同時間點VEGF的表達情況（分，3 討論
惡性腫瘤的浸潤性生長依賴于瘤體血管新生，這種生物學行為不僅可以為腫瘤的生長、侵襲及轉移提供必需的營養物質，亦可以為腫瘤的轉移提供通道[12]。研究[3-4]表明，CD34不僅具有造血作用，還可以通過促進內皮細胞的轉移進而促進血管新生。VEGF在腫瘤的侵襲、轉移過程中主要通過自分泌和旁分泌的形式特異性地作用于血管內皮細胞，通過促進血管內皮細胞增殖，增加血管的通透性，從而誘導血管生成，在惡性腫瘤的生長及轉移過程發揮關鍵作用[13-14]。目前抗血管治療已經成為腫瘤治療的熱點。而素有“蟲癌”之稱的肝泡球蚴病，目前手術仍是主要的根治方式，但大多數患者就診時已發生廣泛的浸潤和轉移，失去最佳手術時機[15]，因此，藥物治療仍是無法手術根治的泡球蚴患者的首選治療方式之一。但傳統藥物療效仍不理想，而且缺乏有效抑制泡球蚴侵襲和轉移的藥物[16]。基于以上理論依據和研究背景，我們開展這項研究，為泡球蚴病患者的保守治療提供新途徑。
本研究結果顯示，在感染泡球蚴病后的不同時間點，沙鼠肝泡球蚴組織中MVD-CD34和VEGF的表達均明顯高于泡球蚴周圍肝組織以及正常肝組織（均P < 0.05），這說明泡球蚴在侵襲性的生長過程中存在血管新生現象，而且VEGF可能在其中發揮了一定的作用。在感染后的第100 d，VEGF表達開始下降，但與感染第80 d比較，差異無統計學意義（t=-1.639，P=0.132），說明VEGF的表達仍持續在較高的水平。但這種表達下降的趨勢一方面可能與寄生蟲與宿主之間的免疫有關，3個月左右相當于泡球蚴自然病程中期，這一階段被認為是Th1免疫向Th2免疫漂移的關鍵時期[17]，宿主與寄生蟲體內的細胞因子表達水平發生劇烈變化。因此我們推測，一方面在這些細胞因子中有可能存在抑制VEGF表達的細胞因子；另一方面可能是泡球蚴的逐級芽生式[18]似癌樣浸潤性生長而不同于腫瘤如肝癌[19]的浸潤性生長。隨著感染時間延長，泡球蚴組織體積增大，而肉眼很難區別病灶生長先后順序，這極有可能導致取材時出現一定的誤差，因此大樣本量的研究是必要的。而在感染后第100 d時，MVD-CD34的表達仍處于較高的水平，這一方面可能是因為VEGF的持續作用，另一方面可能是其他促血管生成因子如骨橋蛋白[20-22]的作用，抑或是Vuitton等[23]提到的“泡球蚴自身分泌的類細胞因子物質”可能促進泡球蚴血管生成。具體尚待進一步研究。
此外，本研究結果還顯示，在泡球蚴周圍肝組織中，MVD-CD34和VEGF的表達也呈現出逐漸增高的趨勢，且在感染后第80 d時和第100 d時，MVD-CD34表達高于正常肝組織（P < 0.05），在感染后第100 d時，泡球蚴周圍肝組織中VEGF的表達高于正常肝組織（P < 0.05），這可能是隨著感染時間的延長，宿主肝組織由炎細胞浸潤向纖維化[24]方向發展而引起宿主肝組織血管新生有一定的關系。
王靜等[25]對27例人肝泡球蚴患者標本行VEGF免疫組織化學染色分析時發現，VEGF的表達并未增高，這與本研究結果存在一定的出入，原因可能是臨床上泡球蚴患者從感染到發病通常有數年甚至10年以上的潛伏期[26]，患者就診的時候肝臟纖維化程度較重，而進行動物實驗時，病程通常是明確的。而且本研究也發現，隨著感染時間的延長，肝纖維化程度加重，泡球蚴周圍的肝組織VEGF的表達逐漸增高。據此我們推測，隨著感染時間的進一步延長，也可能出現泡球蚴周圍肝組織中VEGF的表達進一步增高情況，但具體尚待進一步研究證實。桑澤杰等[27]采用肝動脈灌注貝伐單抗治療大鼠肝泡球蚴，發現其可以通過抑制VEGF的作用進而抑制血管生成，這也表明VEGF可以促進泡球蚴組織血管新生，但遺憾的是該研究未對組織中MVD進行檢測，因此持續采用VEGF抑制劑治療后再度量化血管生成的指標將成為研究的重點。
總之，本研究表明，在早期沙鼠肝泡球蚴組織中存在CD34和VEGF高表達的現象，這說明血管生成可能是泡球蚴浸潤性生長的機制之一，而且VEGF可能促進泡球蚴組織血管新生，但任何組織包括腫瘤在內其血管生成都是多種細胞因子作用的結果，因此，進一步深入的研究是必要的。本研究為泡球蚴病的血管化研究及抗血管治療提供了新途徑。
