引用本文： 李紅生, 羅麗瓊, 馬永錄, 田君才, 戴偉平. TOPⅡ聯合Ki-67和p53表達對局部晚期乳腺癌化療敏感性的預測分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(1): 102-105. doi: 10.7507/1007-9424.20150026 復制
隨著分子病理學研究的不斷深入，很多生物學指標已經用于了臨床乳腺癌的診斷、預后以及化療療效的判斷。目前，臨床上常規檢查的指標包括有雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、p53基因、表皮生長因子受體-2（C-erbB-2，又稱Her-2）、增生細胞核抗原（Ki-67）等。本研究對2010年8月至2014年1月期間甘肅省酒泉市人民醫院腫瘤科收治的90例Ⅱb～Ⅲc期（局部進展期）行新輔助化療初治的乳腺癌患者的癌組織以及不同分子分型者的Ki-67、p53基因和拓撲異構酶Ⅱ（TOPⅡ）的表達進行了免疫組化檢測，旨在初步探討局部進展期乳腺癌的分子分型以及上述3種生物學指標的表達狀態與化療療效的關系。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
本研究選取了2010年8月至2014年1月期間甘肅省酒泉市人民醫院腫瘤科收治的Ⅱb～Ⅲc期行新輔助化療的初治乳腺癌女性患者90例作為研究對象，年齡26～69歲，平均年齡47.5歲；卡氏評分> 70，入選前均未給予任何抗腫瘤治療；腹部超聲、胸部X線、胸部+上腹部CT、全身骨掃描等檢查證實無遠處轉移；無嚴重的合并疾病如高血壓、冠心病和精神創傷史，無嚴重的過敏史；簽署知情同意書；在實施化療前全部患者均經空芯針彈式活檢槍穿刺活檢證實為乳腺癌。根據2011年St.Gallen共識劃分的乳腺癌分子亞型標準[1]即腺腔A型〔ER（+）/PR（+）/HER2（-）且Ki-67 < 14%〕、腺腔B型〔ER（+）/PR（+）/HER2（+）或HER2（-）且ki-67≥14%〕、HER2過表達型〔ER（-）/PR（-）/HER2（+）〕和Basal-like型〔ER（-）/PR（-）/HER2(-)〕，本組90例患者中屬腺腔A型12例、腺腔B型15例、HER2過表達型35例以及Basal-like型28例。本組患者的化療均采用TA（紫杉類+蒽環類）傳統3周方案治療：多西他賽75 mg/m2, 吡柔比星50 mg/m2，每21 d為l周期，每2周期化療后15 d評估新輔助化療的效果，經術前4～6個療程治療后評價療效。
1.2 檢測指標及方法
采用免疫組化方法檢測90例乳腺癌患者化療前乳腺癌組織中Ki-67、p53及TOPⅡ的表達情況。TOPⅡ、p53及Ki-67單克隆抗體均購自福州邁新生物技術開發有限公司。采用10%中性甲醛液固定標本，標本常規石蠟包埋、切片，采用SP免疫組織化學染色法，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照，于光學顯微鏡觀察著色反應。
1.3 免疫組化染色結果判定
所取組織標本的病理改變以及免疫組化染色結果的判定由兩名高年資病理科醫師完成。
TOPⅡ、Ki-67和p53蛋白以細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性染色，在高倍鏡下計數陽性細胞數，并計算其占腫瘤細胞的百分比，以陽性細胞數> 10％判為陽性（圖 1）。
1.4 化療效果判定
由兩名高年資臨床醫師完成，以原發灶的變化來衡量。于化療前后測量腫瘤兩大徑，并根據“實體瘤治療療效評價標準（RECIST）”[2]進行評估，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩定（SD）和進展（PD），并以CR+PR者計算總有效率。
1.5 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行統計學分析, 采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 乳腺癌各分子亞型組織中Ki-67、p53和TOPⅡ的表達情況
90例乳腺癌組織中TOPⅡ、p53和Ki-67的表達陽性率分別為63.3%（57/90）、46.7%（42/90）和67.8%（61/90），其中Ki-67及TOPⅡ表達陽性率較高。90例乳腺癌患者的各分子分型瘤體組織中Ki-67、p53和TOPⅡ的表達情況見表 1。由表 1可見，Ki-67表達陽性率在4種分子分型中的差異有統計學意義(χ2=38.877，P=0.000)，其中HER2過表達型和Basal-like型高于腺腔A型和腺腔B型；TOPⅡ及p53的表達表達陽性率在4種分子分型間的差異無統計學意義（χ2=7.105，P=0.069；χ2=7.105，P=0.069)。
表1
乳腺癌各分子分型中Ki-67、p53及TOPⅡ表達情況
2.2 乳腺癌中Ki-67、p53及TOPⅡ的表達與化療敏感性的關系
結果見表 2。由表 2可見，90例乳腺癌患者中，TOPⅡ表達陽性者的化療總有效率高于TOPⅡ表達陰性者（P=0.000）；Ki-67表達陽性者的總有效率高于Ki-67表達陰性者（P=0.009）；但p53表達陽性者和陰性者的總有效率比較差異無統計學意義（P=0.432）。提示TOPⅡ和Ki-67表達陽性可能是化療敏感性指標，而p53對化療敏感性的預測價值不大。
表2
TOPⅡ、p53和Ki-67表達與化療敏感性的關系
2.3 乳腺癌組織中Ki-67及TOPⅡ不同表達情況組合與化療敏感性的關系
根據TOPⅡ及Ki-67的表達情況，將90例乳腺癌患者再分為TOPⅡ陽性+Ki-67陽性組、TOPⅡ陽性+Ki-67陰性組、TOPⅡ陰性+Ki-67陽性組及TOPⅡ陰性組和Ki-67陰性組進行分析，其結果見表 3。由表 3可見，TOPⅡ陽性+Ki-67陽性組的總有效率明顯高于其他組（χ2=18.370，P=0.000），TOPⅡ陰性+Ki-67陽性組的總有效率又高于TOPⅡ陽性+Ki-67陰性組（χ2=3.968 P=0.046），TOPⅡ陰性組和Ki-67陰性組的總有效率最低。
表3
雙標記物聯合檢測與化療敏感性的關系
圖1
示Ki-67（1a）、p53（1b）及TOPⅡ（1c）呈陽性表達（SP×400）
3 討論
新輔助化療是局部進展乳腺癌常用的治療手段，蒽環聯合紫衫類方案常用于臨床一線化療。近年來，隨著對腫瘤分子病理學的研究，人們逐漸認識到分子分型和基因表達水平的差異是患者對化療藥物敏感性不同的主要原因。本組病例中，HER2過表達型及Basal-like型患者的Ki-67及TOPⅡ表達陽性率高于腺腔型，其新輔助化療后的療效亦優于腺腔型，這為乳腺癌有關分子抗體與化療敏感性的研究提供了一定的臨床依據。如Ki-67 [3]、p53 [4]、TOPⅡ[5]等基因研究進展可指導乳腺癌新輔助個體化治療。
TOPⅡ在正常細胞的DNA合成和細胞分裂中起重要作用，是細胞周期中S、G2和M期敏感而特異的一種標志物，其作用的機理為催化DNA鏈的斷裂和結合[6]；其含量的高低與抗癌藥物的作用呈正比，是抗癌藥物的作用靶點。Harris等[7]的研究發現，在轉染了heregulin8-2后，MCF-7細胞株對阿霉素敏感, 且發現TOPⅡa表達增加，推測這可能是腫瘤細胞對阿霉素敏感性增加的機理。體內外實驗[8-9]均證實TOPⅡa基因擴增和（或）蛋白過表達可以使蒽環類藥物療效增加；反之，抑制TOPⅡa可以誘導蒽環類藥物耐藥。因此檢測乳腺癌癌組織中TOPⅡ的表達對指導臨床化療是必要的。劉春萍等[10]采用FISH方法檢測乳腺癌患者新輔助化療前癌組織HER2及TOPⅡa基因的表達情況，采用FEC方案行新輔助化療4周期后按RECIST標準評估其療效，結果TOPⅡa基因擴增38.0%，乳腺癌組織中TOPⅡ的擴增對蒽環類化療藥物的療效有預測作用。本研究選擇90例接受蒽環類新輔助化療的乳腺癌患者，檢測其TOPⅡ基因在乳腺癌組織中的表達陽性率為63.3%，其化療效果明顯優于表達陰性者（P=0.000）。提示TOPⅡ高表達的乳腺癌對蒽環類新輔助化療敏感，可作為指導乳腺癌化療的重要參考指標。
p53基因是公認的抑癌基因, 分為野生和突變兩種亞型，其基因產物位于包括乳腺腫瘤、胃腸道腫瘤、肝細胞腫瘤等多種腫瘤組織中，該基因的突變或缺失是導致許多腫瘤發生的原因。p53同時也是細胞凋亡的調控因子。有文獻[11-12]報道，在乳腺癌組織中其表達陽性率為40%～61%，本組病例p53表達陽性率為46.7%，與之接近。本研究結果顯示，乳腺癌組織中p53的表達狀況與新輔助化療無顯著相關性。
Ki-67抗原是細胞增殖相關蛋白，主要用于判斷細胞增殖活性，表達在所有活動的細胞周期（G1、S、G2及M期）中，而在G0期不表達。同時，2011年St.Gallen共識將Ki-67納入新乳腺癌亞型分類。有研究[13]顯示，Ki-67還可以作為分子靶向治療靶點。Ki-67增殖活性高低和腫瘤的分化程度、浸潤轉移及預后密切相關，是Ⅱ級星形細胞瘤、間膠質瘤、結腸癌、乳腺癌預后很好的標志物。文獻[14-15]報道，乳腺癌患者Ki-67表達率為60%～80%，本組病例為67.8%，結果相近。本研究發現，乳腺癌組織中Ki-67過表達者對新輔助化療較為敏感，其有效率較表達陰性患者明顯提高（P=0.009）。
乳腺癌的分子分型不僅有助于判斷預后, 還有助于預測腫瘤對治療的反應[16]。HER2過表達型和Basal-like型乳腺癌患者對新輔助化療較敏感，其療效好，TOPⅡ表達陽性并Ki-67表達陽性的乳腺癌患者，對新輔助化療的敏感性明顯優于TOPⅡ表達陽性并Ki-67表達陰性者，且好于TOPⅡ陰性并Ki-67表達陽性者或TOPⅡ陰性并Ki-67表達陰性者。因此認為，乳腺癌的分子分型及基因表達組合可作為新輔助化療方案篩選病例的分子標簽。
綜上，HER2過表達型和Basal-like型乳腺癌TOPⅡ和Ki-67蛋白陽性表達可作為乳腺癌預后的評判指標，TOPⅡ在乳腺癌中的表達可作為指導乳腺癌化療的重要參考指標。本研究只是在乳腺癌化療標志物篩選上做了初步探討，而對于三者隨腫瘤惡性程度的高低而影響預后，以及作為分子靶向治療靶點來提高化療敏感性則有待于臨床的進一步研究來證實。
隨著分子病理學研究的不斷深入，很多生物學指標已經用于了臨床乳腺癌的診斷、預后以及化療療效的判斷。目前，臨床上常規檢查的指標包括有雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、p53基因、表皮生長因子受體-2（C-erbB-2，又稱Her-2）、增生細胞核抗原（Ki-67）等。本研究對2010年8月至2014年1月期間甘肅省酒泉市人民醫院腫瘤科收治的90例Ⅱb～Ⅲc期（局部進展期）行新輔助化療初治的乳腺癌患者的癌組織以及不同分子分型者的Ki-67、p53基因和拓撲異構酶Ⅱ（TOPⅡ）的表達進行了免疫組化檢測，旨在初步探討局部進展期乳腺癌的分子分型以及上述3種生物學指標的表達狀態與化療療效的關系。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
本研究選取了2010年8月至2014年1月期間甘肅省酒泉市人民醫院腫瘤科收治的Ⅱb～Ⅲc期行新輔助化療的初治乳腺癌女性患者90例作為研究對象，年齡26～69歲，平均年齡47.5歲；卡氏評分> 70，入選前均未給予任何抗腫瘤治療；腹部超聲、胸部X線、胸部+上腹部CT、全身骨掃描等檢查證實無遠處轉移；無嚴重的合并疾病如高血壓、冠心病和精神創傷史，無嚴重的過敏史；簽署知情同意書；在實施化療前全部患者均經空芯針彈式活檢槍穿刺活檢證實為乳腺癌。根據2011年St.Gallen共識劃分的乳腺癌分子亞型標準[1]即腺腔A型〔ER（+）/PR（+）/HER2（-）且Ki-67 < 14%〕、腺腔B型〔ER（+）/PR（+）/HER2（+）或HER2（-）且ki-67≥14%〕、HER2過表達型〔ER（-）/PR（-）/HER2（+）〕和Basal-like型〔ER（-）/PR（-）/HER2(-)〕，本組90例患者中屬腺腔A型12例、腺腔B型15例、HER2過表達型35例以及Basal-like型28例。本組患者的化療均采用TA（紫杉類+蒽環類）傳統3周方案治療：多西他賽75 mg/m2, 吡柔比星50 mg/m2，每21 d為l周期，每2周期化療后15 d評估新輔助化療的效果，經術前4～6個療程治療后評價療效。
1.2 檢測指標及方法
采用免疫組化方法檢測90例乳腺癌患者化療前乳腺癌組織中Ki-67、p53及TOPⅡ的表達情況。TOPⅡ、p53及Ki-67單克隆抗體均購自福州邁新生物技術開發有限公司。采用10%中性甲醛液固定標本，標本常規石蠟包埋、切片，采用SP免疫組織化學染色法，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照，于光學顯微鏡觀察著色反應。
1.3 免疫組化染色結果判定
所取組織標本的病理改變以及免疫組化染色結果的判定由兩名高年資病理科醫師完成。
TOPⅡ、Ki-67和p53蛋白以細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性染色，在高倍鏡下計數陽性細胞數，并計算其占腫瘤細胞的百分比，以陽性細胞數> 10％判為陽性（圖 1）。
1.4 化療效果判定
由兩名高年資臨床醫師完成，以原發灶的變化來衡量。于化療前后測量腫瘤兩大徑，并根據“實體瘤治療療效評價標準（RECIST）”[2]進行評估，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩定（SD）和進展（PD），并以CR+PR者計算總有效率。
1.5 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行統計學分析, 采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 乳腺癌各分子亞型組織中Ki-67、p53和TOPⅡ的表達情況
90例乳腺癌組織中TOPⅡ、p53和Ki-67的表達陽性率分別為63.3%（57/90）、46.7%（42/90）和67.8%（61/90），其中Ki-67及TOPⅡ表達陽性率較高。90例乳腺癌患者的各分子分型瘤體組織中Ki-67、p53和TOPⅡ的表達情況見表 1。由表 1可見，Ki-67表達陽性率在4種分子分型中的差異有統計學意義(χ2=38.877，P=0.000)，其中HER2過表達型和Basal-like型高于腺腔A型和腺腔B型；TOPⅡ及p53的表達表達陽性率在4種分子分型間的差異無統計學意義（χ2=7.105，P=0.069；χ2=7.105，P=0.069)。
表1
乳腺癌各分子分型中Ki-67、p53及TOPⅡ表達情況
2.2 乳腺癌中Ki-67、p53及TOPⅡ的表達與化療敏感性的關系
結果見表 2。由表 2可見，90例乳腺癌患者中，TOPⅡ表達陽性者的化療總有效率高于TOPⅡ表達陰性者（P=0.000）；Ki-67表達陽性者的總有效率高于Ki-67表達陰性者（P=0.009）；但p53表達陽性者和陰性者的總有效率比較差異無統計學意義（P=0.432）。提示TOPⅡ和Ki-67表達陽性可能是化療敏感性指標，而p53對化療敏感性的預測價值不大。
表2
TOPⅡ、p53和Ki-67表達與化療敏感性的關系
2.3 乳腺癌組織中Ki-67及TOPⅡ不同表達情況組合與化療敏感性的關系
根據TOPⅡ及Ki-67的表達情況，將90例乳腺癌患者再分為TOPⅡ陽性+Ki-67陽性組、TOPⅡ陽性+Ki-67陰性組、TOPⅡ陰性+Ki-67陽性組及TOPⅡ陰性組和Ki-67陰性組進行分析，其結果見表 3。由表 3可見，TOPⅡ陽性+Ki-67陽性組的總有效率明顯高于其他組（χ2=18.370，P=0.000），TOPⅡ陰性+Ki-67陽性組的總有效率又高于TOPⅡ陽性+Ki-67陰性組（χ2=3.968 P=0.046），TOPⅡ陰性組和Ki-67陰性組的總有效率最低。
表3
雙標記物聯合檢測與化療敏感性的關系
圖1
示Ki-67（1a）、p53（1b）及TOPⅡ（1c）呈陽性表達（SP×400）
3 討論
新輔助化療是局部進展乳腺癌常用的治療手段，蒽環聯合紫衫類方案常用于臨床一線化療。近年來，隨著對腫瘤分子病理學的研究，人們逐漸認識到分子分型和基因表達水平的差異是患者對化療藥物敏感性不同的主要原因。本組病例中，HER2過表達型及Basal-like型患者的Ki-67及TOPⅡ表達陽性率高于腺腔型，其新輔助化療后的療效亦優于腺腔型，這為乳腺癌有關分子抗體與化療敏感性的研究提供了一定的臨床依據。如Ki-67 [3]、p53 [4]、TOPⅡ[5]等基因研究進展可指導乳腺癌新輔助個體化治療。
TOPⅡ在正常細胞的DNA合成和細胞分裂中起重要作用，是細胞周期中S、G2和M期敏感而特異的一種標志物，其作用的機理為催化DNA鏈的斷裂和結合[6]；其含量的高低與抗癌藥物的作用呈正比，是抗癌藥物的作用靶點。Harris等[7]的研究發現，在轉染了heregulin8-2后，MCF-7細胞株對阿霉素敏感, 且發現TOPⅡa表達增加，推測這可能是腫瘤細胞對阿霉素敏感性增加的機理。體內外實驗[8-9]均證實TOPⅡa基因擴增和（或）蛋白過表達可以使蒽環類藥物療效增加；反之，抑制TOPⅡa可以誘導蒽環類藥物耐藥。因此檢測乳腺癌癌組織中TOPⅡ的表達對指導臨床化療是必要的。劉春萍等[10]采用FISH方法檢測乳腺癌患者新輔助化療前癌組織HER2及TOPⅡa基因的表達情況，采用FEC方案行新輔助化療4周期后按RECIST標準評估其療效，結果TOPⅡa基因擴增38.0%，乳腺癌組織中TOPⅡ的擴增對蒽環類化療藥物的療效有預測作用。本研究選擇90例接受蒽環類新輔助化療的乳腺癌患者，檢測其TOPⅡ基因在乳腺癌組織中的表達陽性率為63.3%，其化療效果明顯優于表達陰性者（P=0.000）。提示TOPⅡ高表達的乳腺癌對蒽環類新輔助化療敏感，可作為指導乳腺癌化療的重要參考指標。
p53基因是公認的抑癌基因, 分為野生和突變兩種亞型，其基因產物位于包括乳腺腫瘤、胃腸道腫瘤、肝細胞腫瘤等多種腫瘤組織中，該基因的突變或缺失是導致許多腫瘤發生的原因。p53同時也是細胞凋亡的調控因子。有文獻[11-12]報道，在乳腺癌組織中其表達陽性率為40%～61%，本組病例p53表達陽性率為46.7%，與之接近。本研究結果顯示，乳腺癌組織中p53的表達狀況與新輔助化療無顯著相關性。
Ki-67抗原是細胞增殖相關蛋白，主要用于判斷細胞增殖活性，表達在所有活動的細胞周期（G1、S、G2及M期）中，而在G0期不表達。同時，2011年St.Gallen共識將Ki-67納入新乳腺癌亞型分類。有研究[13]顯示，Ki-67還可以作為分子靶向治療靶點。Ki-67增殖活性高低和腫瘤的分化程度、浸潤轉移及預后密切相關，是Ⅱ級星形細胞瘤、間膠質瘤、結腸癌、乳腺癌預后很好的標志物。文獻[14-15]報道，乳腺癌患者Ki-67表達率為60%～80%，本組病例為67.8%，結果相近。本研究發現，乳腺癌組織中Ki-67過表達者對新輔助化療較為敏感，其有效率較表達陰性患者明顯提高（P=0.009）。
乳腺癌的分子分型不僅有助于判斷預后, 還有助于預測腫瘤對治療的反應[16]。HER2過表達型和Basal-like型乳腺癌患者對新輔助化療較敏感，其療效好，TOPⅡ表達陽性并Ki-67表達陽性的乳腺癌患者，對新輔助化療的敏感性明顯優于TOPⅡ表達陽性并Ki-67表達陰性者，且好于TOPⅡ陰性并Ki-67表達陽性者或TOPⅡ陰性并Ki-67表達陰性者。因此認為，乳腺癌的分子分型及基因表達組合可作為新輔助化療方案篩選病例的分子標簽。
綜上，HER2過表達型和Basal-like型乳腺癌TOPⅡ和Ki-67蛋白陽性表達可作為乳腺癌預后的評判指標，TOPⅡ在乳腺癌中的表達可作為指導乳腺癌化療的重要參考指標。本研究只是在乳腺癌化療標志物篩選上做了初步探討，而對于三者隨腫瘤惡性程度的高低而影響預后，以及作為分子靶向治療靶點來提高化療敏感性則有待于臨床的進一步研究來證實。
