引用本文： 朱棟良, 尹小平, 王芳元. 長鏈非編碼RNA-MALAT1對結直腸癌細胞介導的血管形成的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(1): 60-63. doi: 10.7507/1007-9424.20150015 復制
長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度在200～10 000堿基大小的RNA，本身雖然并不能編碼基因，但能以多種形式參與基因表達和功能的調控[1-2]。近年來越來越多的研究[3-5]證實，某些lncRNA在腫瘤的發生發展中發揮了重要的作用，作為這些lncRNA其中之一的肺腺癌轉移相關轉錄因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在肺癌、宮頸癌、消化系統腫瘤等多種惡性腫瘤中呈現異常過表達的狀態，并能夠通過激活某些信號轉導通路如MAPK、Wnt等影響腫瘤的進程及預后。MALAT1在結直腸癌中發揮著重要的作用，如可促進細胞增殖、增強腫瘤侵襲轉移能力等[6-10]，但MALAT1對結直腸癌血管形成的影響尚不清楚。本研究擬觀察MALAT1對結直腸癌細胞SW48介導的內皮細胞血管形成的影響，并通過檢測血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表達，探索其中可能的機理。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
MALAT1過表達質粒由咸寧市中心醫院肝膽胰胃腸外科既往構建并保存，利用lipofectamine 2000并按照其說明書常規轉染質粒。人VEGF酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司（貨號：KGEHC108），無生長因子的Matrigel膠購自美國BD公司，抗HIF-1α及GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。10%胎牛血清購自浙江天杭四季青生物科技有限公司，DMEM培養基購自南京凱基生物科技發展有限公司。
1.2 細胞及培養
人結直腸癌細胞株SW48及人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）由咸寧市中心醫院肝膽胰胃腸外科既往保存，培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃恒溫溫箱內培養48 h后傳代，SW48取第39代，HUVEC取第18代。培養條件：①常氧培養，5%CO2、空氣及飽和濕度；②乏氧培養，1%O2、5%CO2及94%N2。
1.3 VEGF含量檢測
取上述培養傳39代的SW48細胞接種于6孔板，轉染MALAT1過表達質粒及對照質粒后，按上述條件常規培養或乏氧培養48 h，收集培養液上清，取部分上清按照ELISA試劑盒使用說明依次孵育、洗滌，最終酶標儀檢測OD450值，通過標準曲線計算其中的VEGF含量。
1.4 內皮細胞體外成管實驗
在96孔板中預先鋪置50μL基質膠，置于37℃溫箱內30 min凝固，將HUVEC細胞接種在基質膠上，并加入上述實驗中獲得的培養液上清，24 h后光學顯微鏡下觀察成管現象。HUVEC細胞結成管型，并相互交叉形成網絡，通過計數交叉的結點數間接表明細胞的體外成管能力，結點數越多，提示成管能力越強。
1.5 HIF-1α蛋白水平檢測
采用蛋白質免疫印跡（Western blot）法。收集上述轉染后的SW48細胞，計數1×106個細胞，加入100μl放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解獲取細胞總蛋白液，加入25μl的5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液100℃水浴條件下解交聯恢復蛋白一級結構。蛋白樣品行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF膜）轉膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結合，然后依次孵育一抗及二抗后化學發光法顯影，檢測過表達MALAT1后SW48細胞中的HIF-1α蛋白水平的變化，以GAPDH作為內參照。以Image J進行的灰度值分析結果作為HIF-1α蛋白表達水平，實驗重復3次。
1.6 統計學方法
用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 VEGF含量檢測結果
轉染MALAT1質粒及對照質粒后，通過ELISA檢測SW48細胞培養液上清中VEGF的含量。結果顯示：常規培養條件下，MALAT1組其培養液上清中的VEGF含量為（514±32）mg/L，較對照組的（110±14）mg/L明顯增高（P < 0.05）；乏氧培養條件下，MALAT1組VEGF含量為（928±18）mg/L，較對照組的（230±21）mg/L也有明顯增高（P < 0.05）。見圖 1。該結果提示，過表達MALAT1可以促進結直腸癌細胞SW48分泌VEGF。
圖1
示直腸癌細胞SW48分泌的VEGF檢測結果
2.2 內皮細胞體外成管結果
利用上述實驗中所得的培養液上清孵育HUVEC，并檢測HUVEC細胞的體外成管能力。結果顯示：不管是在常規培養抑或是乏氧培養條件下，與對照組相比，MALAT1組的內皮細胞形成血管微管的能力更強（P值分別為0.019及0.026）：計數的結點數常規培養對照組為（14±3）個，常規培養MALAT1組為（44±2）個，乏氧培養對照組為（38±4）個，乏氧培養MALAT1組為（74±3）個（圖 2）。該結果提示，過表達MALAT1可以促進內皮細胞成管。
圖2
示HUVEC細胞體外成管結果。2A：常規培養對照組；2B：常規培養MALAT1組；2C：乏氧培養對照組組；2D：乏氧培養MALAT1組
2.3 HIF-1α蛋白水平檢測結果
收集上述轉染后的SW48細胞采用Western blot法檢測其中HIF-1α蛋白的表達情況，其結果見圖 3。各組HIF-1α條帶灰度值：常規培養對照組為947±34，常規培養MALAT1組2 877±39，乏氧培養對照組為5 292±54，乏氧培養MALAT1組為9 088±41。即乏氧培養條件下HIF-1α蛋白的表達量較常規培養條件下明顯增高（P=0.037），而在常規培養和乏氧培養條件下，MALAT1組的HIF-1α蛋白表達量均高于對照組（P=0.029，P=0.034）。該結果提示，MALAT1可促進結直腸癌細胞SW48中HIF-1α蛋白的表達。
圖3
示結直腸癌細胞SW48中HIF-1α蛋白表達檢測結果
3 討論
結直腸癌作為人類常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率逐年升高，快速進展及遠處轉移是其治療中的主要難題。一般研究[11-15]認為，腫瘤細胞的快速增殖及高代謝能力使得腫瘤細胞處于一種乏氧狀態，從而導致腫瘤細胞內某些相關信號轉導通路的持續激活和促血管細胞因子的分泌增加，進而刺激腫瘤中微血管的形成，為腫瘤的持續生長和進展提供了更多的養分和原料。
MALAT1作為lncRNA家族中的一員，最早在非小細胞肺癌中發現，因在轉移性的肺腺癌細胞株中的表達水平較無轉移傾向的細胞株明顯增高而得名[16]。近年來研究[3-5]發現，其廣泛表達于人體各組織臟器中，且在宮頸癌、膀胱癌、消化系統腫瘤等多種惡性腫瘤中表達異常增高。一系列研究[17-21]證實，過表達MALAT1可加快腫瘤細胞的周期進程，從而促進細胞增殖，可通過調控bcl-2、Bcl-xl等基因的表達抑制腫瘤細胞的凋亡。MALAT1還可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）、Wnt等信號通路促進結直腸癌的侵襲和轉移[22-25]，但MALAT1對結直腸癌中血管形成是否也有一定的影響，尚無文獻報道。
本研究通過在結直腸癌細胞株SW48中轉染質粒過表達MALAT1，觀察MALAT1對血管形成的影響，并初步探索其中可能的機理。結果發現，過表達MALAT1的SW48細胞培養液上清中的VEGF含量明顯增加，而VEGF是促進血管形成最重要的細胞因子之一，腫瘤細胞可以通過旁分泌VEGF，作用于血管內皮細胞上的VEGF受體，促進內皮細胞的增殖和遷移，從而形成更多的微血管。本研究通過內皮細胞的體外成管實驗驗證了過表達MALAT1確實可以促進HUVEC的成管能力。為了進一步明確MALAT1促進腫瘤細胞分泌VEGF的具體機理，本研究采用Western blot法檢測了SW48細胞中HIF-1α蛋白的表達，HIF-1α是腫瘤細胞中影響VEGF表達的關鍵轉錄因子，其可以特異性地結合于VEGF基因的啟動子區域，調控VEGF的轉錄活性。HIF-1α在細胞內的半衰期很短，在充足氧氣條件下會迅速降解，因此本研究采取了常規培養和乏氧培養兩種不同的細胞培養條件。結果發現，不管是在常規培養條件下還是在乏氧培養條件下，過表達MALAT1均可促進SW48細胞中HIF-1α蛋白的表達，從而解釋了MALAT1促進VEGF分泌及內皮細胞成管的原因。
綜上所述，本研究發現，常規培養及乏氧培養條件下，在結直腸癌細胞株SW48中過表達MALAT1可促進其分泌VEGF，進而增強內皮細胞的體外成管能力；同時發現過表達MALAT1可促進結直腸癌SW48細胞中HIF-1α蛋白的表達。提示MALAT1可能通過HIF-1α影響VEGF的分泌和內皮細胞形成血管。但MALAT1調控HIF-1α的具體分子學機理尚待闡明，是我們正在致力研究的內容。本研究結果提示，MALAT1可能通過影響血管形成參與結直腸癌的發生發展，這為結直腸癌的臨床治療提供了可能的新的藥物靶點及監測指標。
長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度在200～10 000堿基大小的RNA，本身雖然并不能編碼基因，但能以多種形式參與基因表達和功能的調控[1-2]。近年來越來越多的研究[3-5]證實，某些lncRNA在腫瘤的發生發展中發揮了重要的作用，作為這些lncRNA其中之一的肺腺癌轉移相關轉錄因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在肺癌、宮頸癌、消化系統腫瘤等多種惡性腫瘤中呈現異常過表達的狀態，并能夠通過激活某些信號轉導通路如MAPK、Wnt等影響腫瘤的進程及預后。MALAT1在結直腸癌中發揮著重要的作用，如可促進細胞增殖、增強腫瘤侵襲轉移能力等[6-10]，但MALAT1對結直腸癌血管形成的影響尚不清楚。本研究擬觀察MALAT1對結直腸癌細胞SW48介導的內皮細胞血管形成的影響，并通過檢測血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表達，探索其中可能的機理。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
MALAT1過表達質粒由咸寧市中心醫院肝膽胰胃腸外科既往構建并保存，利用lipofectamine 2000并按照其說明書常規轉染質粒。人VEGF酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司（貨號：KGEHC108），無生長因子的Matrigel膠購自美國BD公司，抗HIF-1α及GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。10%胎牛血清購自浙江天杭四季青生物科技有限公司，DMEM培養基購自南京凱基生物科技發展有限公司。
1.2 細胞及培養
人結直腸癌細胞株SW48及人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）由咸寧市中心醫院肝膽胰胃腸外科既往保存，培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃恒溫溫箱內培養48 h后傳代，SW48取第39代，HUVEC取第18代。培養條件：①常氧培養，5%CO2、空氣及飽和濕度；②乏氧培養，1%O2、5%CO2及94%N2。
1.3 VEGF含量檢測
取上述培養傳39代的SW48細胞接種于6孔板，轉染MALAT1過表達質粒及對照質粒后，按上述條件常規培養或乏氧培養48 h，收集培養液上清，取部分上清按照ELISA試劑盒使用說明依次孵育、洗滌，最終酶標儀檢測OD450值，通過標準曲線計算其中的VEGF含量。
1.4 內皮細胞體外成管實驗
在96孔板中預先鋪置50μL基質膠，置于37℃溫箱內30 min凝固，將HUVEC細胞接種在基質膠上，并加入上述實驗中獲得的培養液上清，24 h后光學顯微鏡下觀察成管現象。HUVEC細胞結成管型，并相互交叉形成網絡，通過計數交叉的結點數間接表明細胞的體外成管能力，結點數越多，提示成管能力越強。
1.5 HIF-1α蛋白水平檢測
采用蛋白質免疫印跡（Western blot）法。收集上述轉染后的SW48細胞，計數1×106個細胞，加入100μl放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解獲取細胞總蛋白液，加入25μl的5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液100℃水浴條件下解交聯恢復蛋白一級結構。蛋白樣品行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF膜）轉膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結合，然后依次孵育一抗及二抗后化學發光法顯影，檢測過表達MALAT1后SW48細胞中的HIF-1α蛋白水平的變化，以GAPDH作為內參照。以Image J進行的灰度值分析結果作為HIF-1α蛋白表達水平，實驗重復3次。
1.6 統計學方法
用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 VEGF含量檢測結果
轉染MALAT1質粒及對照質粒后，通過ELISA檢測SW48細胞培養液上清中VEGF的含量。結果顯示：常規培養條件下，MALAT1組其培養液上清中的VEGF含量為（514±32）mg/L，較對照組的（110±14）mg/L明顯增高（P < 0.05）；乏氧培養條件下，MALAT1組VEGF含量為（928±18）mg/L，較對照組的（230±21）mg/L也有明顯增高（P < 0.05）。見圖 1。該結果提示，過表達MALAT1可以促進結直腸癌細胞SW48分泌VEGF。
圖1
示直腸癌細胞SW48分泌的VEGF檢測結果
2.2 內皮細胞體外成管結果
利用上述實驗中所得的培養液上清孵育HUVEC，并檢測HUVEC細胞的體外成管能力。結果顯示：不管是在常規培養抑或是乏氧培養條件下，與對照組相比，MALAT1組的內皮細胞形成血管微管的能力更強（P值分別為0.019及0.026）：計數的結點數常規培養對照組為（14±3）個，常規培養MALAT1組為（44±2）個，乏氧培養對照組為（38±4）個，乏氧培養MALAT1組為（74±3）個（圖 2）。該結果提示，過表達MALAT1可以促進內皮細胞成管。
圖2
示HUVEC細胞體外成管結果。2A：常規培養對照組；2B：常規培養MALAT1組；2C：乏氧培養對照組組；2D：乏氧培養MALAT1組
2.3 HIF-1α蛋白水平檢測結果
收集上述轉染后的SW48細胞采用Western blot法檢測其中HIF-1α蛋白的表達情況，其結果見圖 3。各組HIF-1α條帶灰度值：常規培養對照組為947±34，常規培養MALAT1組2 877±39，乏氧培養對照組為5 292±54，乏氧培養MALAT1組為9 088±41。即乏氧培養條件下HIF-1α蛋白的表達量較常規培養條件下明顯增高（P=0.037），而在常規培養和乏氧培養條件下，MALAT1組的HIF-1α蛋白表達量均高于對照組（P=0.029，P=0.034）。該結果提示，MALAT1可促進結直腸癌細胞SW48中HIF-1α蛋白的表達。
圖3
示結直腸癌細胞SW48中HIF-1α蛋白表達檢測結果
3 討論
結直腸癌作為人類常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率逐年升高，快速進展及遠處轉移是其治療中的主要難題。一般研究[11-15]認為，腫瘤細胞的快速增殖及高代謝能力使得腫瘤細胞處于一種乏氧狀態，從而導致腫瘤細胞內某些相關信號轉導通路的持續激活和促血管細胞因子的分泌增加，進而刺激腫瘤中微血管的形成，為腫瘤的持續生長和進展提供了更多的養分和原料。
MALAT1作為lncRNA家族中的一員，最早在非小細胞肺癌中發現，因在轉移性的肺腺癌細胞株中的表達水平較無轉移傾向的細胞株明顯增高而得名[16]。近年來研究[3-5]發現，其廣泛表達于人體各組織臟器中，且在宮頸癌、膀胱癌、消化系統腫瘤等多種惡性腫瘤中表達異常增高。一系列研究[17-21]證實，過表達MALAT1可加快腫瘤細胞的周期進程，從而促進細胞增殖，可通過調控bcl-2、Bcl-xl等基因的表達抑制腫瘤細胞的凋亡。MALAT1還可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）、Wnt等信號通路促進結直腸癌的侵襲和轉移[22-25]，但MALAT1對結直腸癌中血管形成是否也有一定的影響，尚無文獻報道。
本研究通過在結直腸癌細胞株SW48中轉染質粒過表達MALAT1，觀察MALAT1對血管形成的影響，并初步探索其中可能的機理。結果發現，過表達MALAT1的SW48細胞培養液上清中的VEGF含量明顯增加，而VEGF是促進血管形成最重要的細胞因子之一，腫瘤細胞可以通過旁分泌VEGF，作用于血管內皮細胞上的VEGF受體，促進內皮細胞的增殖和遷移，從而形成更多的微血管。本研究通過內皮細胞的體外成管實驗驗證了過表達MALAT1確實可以促進HUVEC的成管能力。為了進一步明確MALAT1促進腫瘤細胞分泌VEGF的具體機理，本研究采用Western blot法檢測了SW48細胞中HIF-1α蛋白的表達，HIF-1α是腫瘤細胞中影響VEGF表達的關鍵轉錄因子，其可以特異性地結合于VEGF基因的啟動子區域，調控VEGF的轉錄活性。HIF-1α在細胞內的半衰期很短，在充足氧氣條件下會迅速降解，因此本研究采取了常規培養和乏氧培養兩種不同的細胞培養條件。結果發現，不管是在常規培養條件下還是在乏氧培養條件下，過表達MALAT1均可促進SW48細胞中HIF-1α蛋白的表達，從而解釋了MALAT1促進VEGF分泌及內皮細胞成管的原因。
綜上所述，本研究發現，常規培養及乏氧培養條件下，在結直腸癌細胞株SW48中過表達MALAT1可促進其分泌VEGF，進而增強內皮細胞的體外成管能力；同時發現過表達MALAT1可促進結直腸癌SW48細胞中HIF-1α蛋白的表達。提示MALAT1可能通過HIF-1α影響VEGF的分泌和內皮細胞形成血管。但MALAT1調控HIF-1α的具體分子學機理尚待闡明，是我們正在致力研究的內容。本研究結果提示，MALAT1可能通過影響血管形成參與結直腸癌的發生發展，這為結直腸癌的臨床治療提供了可能的新的藥物靶點及監測指標。
