引用本文： 王曉龍, 陳新濤, 曲戈, 馬海波, 馬軍, 李印, 秦建軍. miR-155在食管鱗癌中的表達及臨床意義. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(1): 61-65. doi: 10.7507/1007-4848.20150018 復制
食管癌是目前全世界八大常見的腫瘤之一，同樣也是六大導致死亡的癌癥之一[1]。盡管食管癌的治療已取得巨大進展，預后仍然較差，總生存率小于10%，術后5年生存率為20%～40%[2]。食管鱗癌的發病機制尚不清楚，因此尋找有效的分子生物治療靶點、制定個體化的治療方案是目前臨床的迫切需求。腫瘤被認為是一種復雜的基因病，幾乎在所有腫瘤的發生、發展過程中都有癌基因的過表達和/或抑癌基因的表達缺失。微小RNA （miRNA）是近年來發現于真核細胞中的一類長21～22個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA。miRNA基因定位于腫瘤關聯基因的脆性位點或相關遺傳區域，并對這些基因行轉錄后調控，起到類似于癌基因或抑癌基因的作用[3]。Has-miR-155位于染色體21q21.3，定位于GRCh37。微小RNA-155（MicroRNA 155，miR-155）由一個非編碼基因BIC（B-cell integration cluster，BIC）轉錄而成，位于BIC的第3個外顯子[4]。研究表明miR-155參與腫瘤發生、發展相關的許多重要生物學過程，包括增殖、凋亡和轉移[5-7]，但miR-155在食管鱗癌發生、發展中的作用和詳細分子機制尚不清楚。本研究采用SYBR Green qRT-PCR技術，檢測食管鱗癌組織和對應癌旁正常組織miR-155的表達情況，并結合患者病歷資料，探討miR-155表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系。
1 資料與方法
1.1 組織標本來源
收集2010年1月至2012年11月河南省腫瘤醫院胸外科確診為食管癌并手術治療的54例患者的新鮮食管癌組織及癌旁正常組織。術前均未行放射治療、化學治療、生物治療等任何治療，且無家族史。每例標本均采集腫瘤組織（T，避免取腫瘤壞死區）和癌旁正常黏膜組織（N，距離癌組織>5 cm）。所取標本離體時間均<30 min。將組織塊剪至1 cm3大小，迅速置于液氮中2～3 min速凍，然后轉存于-80 ℃中供提取RNA使用。收集患者性別、年齡、病理號碼、病理資料等。每例標本最終組織病理學診斷均為原發性食管鱗癌。其中男47例、女7例，年齡45～82歲，中位年齡為61歲；Ⅰ+Ⅱ期40例，Ⅲa+b期14例。腫瘤分級、TNM分期分別按照2009年美國癌癥聯合委員會（AJCC）的標準判定。
1.2 主要研究材料和儀器
主要材料：miRNA提取試劑盒（miRNeasy Mini kit，Cat.No.217004）、反轉錄試劑盒（miScript Reverse Transcription Kit，Cat.No.218061）及熒光實時定量試劑盒（miScript SYBR Green PCR Kit，Cat.No.218073）。引物Hs_miR-155*_1 miScript Primer Assay （MS0000-8778），Hs_RNU6-2_1 （MS00033740） 均為購自Qiagen公司的成品。
主要儀器：勻漿儀（Fastprep-24）、普通PCR儀（Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler） 及7500 Real Time PCR System。
1.3 實驗方法
1.3.1 總RNA的提取
參照miRNeasy Mini kit（QIAGEN）說明書提取細胞總RNA。主要步驟：取冰凍標本，加入Qiazol，使用勻漿機反復研磨至勻漿，室溫下靜置5 min，移至1.5 ml離心管中；每管加入氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫下靜置約5 min；4 ℃ 12 000轉/min離心15 min，小心吸取無色上清液至另一1.5 ml EP管（不要碰到中間的白膜），加入無水乙醇，混勻，然后以每次700 μl移至離心柱內，以10 000轉/min離心15 s；然后參照說明書用試劑盒內的Buffer純化RNA，最后以RNase-free water溶解RNA；取1 μl使用RNA核酸定量儀測定OD值，另取5 μl應用1%瓊脂糖電泳檢測是否具有清晰的3 條帶，其余80 ℃保存供反轉錄使用。
1.3.2 逆轉錄
在冰上配制逆轉錄反應液，體系組成見表 1。反應循環參數：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃forever。
表1
反轉錄體系
1.3.3 SYBR Green qRT-PCR擴增在冰上配置20 μl
real-time PCR反應體系，見表 2。反應條件為：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s，40個循環。記錄每個反應管中的熒光信號到達所設立的閾值時經歷的循環數即Ct值。將原始數據取3次重復的平均值后用內參基因U6B進行歸一化，得出ΔCt，ΔCt=CtmiR-155-CtU6B，應用2-ΔCt分別計算癌組織及配對癌旁組織中miR-155的相對表達量。然后應用2-ΔΔCt方法計算食管鱗癌組織相對于其癌旁正常黏膜組織的miR-155表達水平[8]。其中ΔΔCt=ΔCt（癌組織）-ΔCt（癌旁正常組織）。2-ΔΔCt表示腫瘤組織中所檢測目的基因相對于癌旁正常組織的表達倍數。
表2
SYBR Green qRT-PCR擴增體系
1.4 統計學分析
用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。由于結果數據為非正態分布資料，故對配對樣本采用非參數Wilcoxon配對秩和檢驗，兩個獨立樣本采用Mann-Whitney U檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 總RNA質量檢測及qRT-PCR結果
使用miRNA專用提取試劑盒（miRNeasy Mini kit）分別從54例食管鱗癌組織和對應的癌旁正常黏膜組織中提取總RNA后，運用核酸定量儀測定OD值，D260/D280的比值范圍在1.8～2.1；1%瓊脂糖電泳檢測有3條清晰的rRNA帶，分別為28 s、18 s和5 s。以上結果表明總RNA樣品完整性好，其純度、濃度符合熒光qRT-PCR的要求。qRT-PCR結果見圖 1。
圖1
SYBR Green qRT-PCR結果
注：A：miR-155基因PCR產物的熔解曲線峰值約在74.4 ℃；B：U6B基因PCR產物的溶解曲線約在75 ℃，溶解溫度均較為均一，峰的形態明顯，顯示擴增的為特異性序列；C：miR-155擴增曲線良好；D：U6B擴增曲線良好
2.2 miR-155在食管鱗癌組織及癌旁正常黏膜組織中的表達情況
miR-155在食管鱗癌組織中表達量的中位數為0.014 6，相應癌旁正常黏膜組織表達量的中位數為0.051 7；在54例食管鱗癌標本中，有44例（81%）miR-155的相對表達量下降。應用非參數配對秩和檢驗，食管鱗癌與相應癌旁正常黏膜組織中miR-155表達差異有統計學意義（Z=-4.258，P=0.000），提示miR-155在食管鱗癌組織中的表達顯著低于癌旁正常黏膜組織，見圖 2。
圖2
miR-155在食管鱗癌組織及癌癥正常黏膜組織的表達
2.3 miR-155相對于正常黏膜的表達及與臨床病理特征的關系
對54例食管鱗癌組織相對于其癌旁正常黏膜組織的miR-155表達水平與患者臨床病理參數進行相關性分析，發現miR-155的相對表達與淋巴結轉移顯著相關（P<0.05），但與年齡、性別、吸煙、飲酒、浸潤深度、腫瘤pTNM分期及分化程度等均無明顯相關性（P>0.05）。miR-155在有淋巴結轉移的患者中相對表達較低，見表 3。
表3
miR-155的相對表達水平與食管鱗癌臨床病理特征的關系
3 討論
miRNA是近年來發現于真核細胞中的一類長21～22個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA的3′UTRs （untranslated regions，非翻譯區）近乎完全互補結合在轉錄后水平使其降解，或者與之不完全互補結合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達中發揮重要的調節作用[9]。miRNA在細胞核及細胞質中首先被轉錄為長的初始片段（pri-miRNAs），然后經過一系列的過程生成成熟的miRNA，其過程共分3步：首先細胞核中的miRNA基因生成原始轉錄片段（pri-miRNAs）；然后經RNA內切酶ⅢDrosha剪切及一系列復雜的過程，生成70 nt長度的miRNA前體（pre-miRNAs）；隨后pre-miRNAs被轉運到細胞質，在這里被Dicer酶切割成成熟的miRNA[10]。成熟的miRNA能夠通過核酸序列互補識別特定的目標mRNA，使之降解或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質的合成，達到調控基因表達的目的。據推測，miRNA調節著人類1/3的基因，參與機體諸多生理病理過程[11]。根據miRNAs在腫瘤發生發展中作用的不同，有關研究提出了“癌miRNA”與“抑癌miRNA”的觀點。例如，miR-21作為一個致癌miRNA，在多種腫瘤的發生和發展中起著重要作用。近來研究發現，miR-21在食管鱗癌組織和食管癌細胞系中顯著高表達，它能通過抑制細胞凋亡相關分子來調控細胞增殖與侵襲[12]。Mori等[13]研究證實，miR-21可以與抑癌基因PTEN的3′-UTR結合。Ma等[14]研究發現，miR-21可能通過調節PTEN蛋白的表達而影響哈薩克族人食管鱗癌的發生、發展、浸潤和轉移。而let-7通過抑制HMGA2的表達在食管鱗癌中扮演著抑癌基因的角色[15]。
本研究采用熒光實時定量PCR法檢測了54例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中miR-155的表達水平，結果發現在食管鱗癌組織中miR-155表達顯著低于癌旁正常黏膜組織。Roldo等[16]研究發現miR-155在胰腺胰島細胞癌和腺泡細胞癌中均無表達，但是在正常胰腺組織中有表達。同時有關miR-155的腫瘤抑制作用也有報道。Dorsett等[17]證實miR-155是通過減少AID （activation-induced cyt-idinedeaminase）產生的潛在癌基因轉位而起到抑制腫瘤的作用。因此，我們推測miR-155在食管鱗癌的發生中可能起著抑癌基因的作用，有望成為食管鱗癌分子防治的相關靶點。有意思的是，有研究表明miR-155在肺癌、乳腺癌等實體腫瘤中呈高表達，已經確認miR-155的高表達與白血病、乳腺癌、肺癌及胃癌的形成和發展有直接聯系[18-20]。這可能與miRNA在不同組織的腫瘤中表達具有差異性有關。
在炎癥及免疫的病理生理過程中，miR-155同樣發揮著重要的作用。巨噬細胞作為炎癥和免疫關鍵細胞之一，在多種炎癥遞質誘導下miR-155表達增加[21]。Vigorito等[22]證實在淋巴細胞免疫反應及生發中心的形成中miR-155發揮著重要作用。Rodriguez等[23]發現miR-155基因敲除鼠樹突狀細胞的抗原提呈功能受限。另外，miR-155基因敲除鼠生發中心的功能、T細胞依賴的抗體反應及細胞因子產生均降低[24]，而目前研究發現炎癥細胞是腫瘤間質的重要組成部分，在腫瘤發生發展中具有重要的作用。基于以上結果，我們推測miR-155相對表達的降低可能導致機體炎癥、免疫反應及相關抑癌機制的失調，進而促進了食管鱗癌的發生。本實驗結合病理資料分析，miR-155的相對表達與淋巴結轉移顯著相關（P<0.05），但與浸潤深度、腫瘤的pTNM分期及分化程度等均無明顯相關性（P>0.05）；有淋巴結轉移的患者中miR-155的表達較低。食管鱗癌中miR-155的相對表達水平在食管鱗癌進展中的作用有待進一步研究。
綜上所述，本研究結果提示miR-155相對表達量的下降可能導致相關抑癌機制的失調，進而有利于食管鱗癌的發生、發展，其確切機制有待進一步研究。隨著研究的深入，相信miR-155可能成為一個全新的食管鱗癌診斷和治療靶點。
食管癌是目前全世界八大常見的腫瘤之一，同樣也是六大導致死亡的癌癥之一[1]。盡管食管癌的治療已取得巨大進展，預后仍然較差，總生存率小于10%，術后5年生存率為20%～40%[2]。食管鱗癌的發病機制尚不清楚，因此尋找有效的分子生物治療靶點、制定個體化的治療方案是目前臨床的迫切需求。腫瘤被認為是一種復雜的基因病，幾乎在所有腫瘤的發生、發展過程中都有癌基因的過表達和/或抑癌基因的表達缺失。微小RNA （miRNA）是近年來發現于真核細胞中的一類長21～22個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA。miRNA基因定位于腫瘤關聯基因的脆性位點或相關遺傳區域，并對這些基因行轉錄后調控，起到類似于癌基因或抑癌基因的作用[3]。Has-miR-155位于染色體21q21.3，定位于GRCh37。微小RNA-155（MicroRNA 155，miR-155）由一個非編碼基因BIC（B-cell integration cluster，BIC）轉錄而成，位于BIC的第3個外顯子[4]。研究表明miR-155參與腫瘤發生、發展相關的許多重要生物學過程，包括增殖、凋亡和轉移[5-7]，但miR-155在食管鱗癌發生、發展中的作用和詳細分子機制尚不清楚。本研究采用SYBR Green qRT-PCR技術，檢測食管鱗癌組織和對應癌旁正常組織miR-155的表達情況，并結合患者病歷資料，探討miR-155表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系。
1 資料與方法
1.1 組織標本來源
收集2010年1月至2012年11月河南省腫瘤醫院胸外科確診為食管癌并手術治療的54例患者的新鮮食管癌組織及癌旁正常組織。術前均未行放射治療、化學治療、生物治療等任何治療，且無家族史。每例標本均采集腫瘤組織（T，避免取腫瘤壞死區）和癌旁正常黏膜組織（N，距離癌組織>5 cm）。所取標本離體時間均<30 min。將組織塊剪至1 cm3大小，迅速置于液氮中2～3 min速凍，然后轉存于-80 ℃中供提取RNA使用。收集患者性別、年齡、病理號碼、病理資料等。每例標本最終組織病理學診斷均為原發性食管鱗癌。其中男47例、女7例，年齡45～82歲，中位年齡為61歲；Ⅰ+Ⅱ期40例，Ⅲa+b期14例。腫瘤分級、TNM分期分別按照2009年美國癌癥聯合委員會（AJCC）的標準判定。
1.2 主要研究材料和儀器
主要材料：miRNA提取試劑盒（miRNeasy Mini kit，Cat.No.217004）、反轉錄試劑盒（miScript Reverse Transcription Kit，Cat.No.218061）及熒光實時定量試劑盒（miScript SYBR Green PCR Kit，Cat.No.218073）。引物Hs_miR-155*_1 miScript Primer Assay （MS0000-8778），Hs_RNU6-2_1 （MS00033740） 均為購自Qiagen公司的成品。
主要儀器：勻漿儀（Fastprep-24）、普通PCR儀（Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler） 及7500 Real Time PCR System。
1.3 實驗方法
1.3.1 總RNA的提取
參照miRNeasy Mini kit（QIAGEN）說明書提取細胞總RNA。主要步驟：取冰凍標本，加入Qiazol，使用勻漿機反復研磨至勻漿，室溫下靜置5 min，移至1.5 ml離心管中；每管加入氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫下靜置約5 min；4 ℃ 12 000轉/min離心15 min，小心吸取無色上清液至另一1.5 ml EP管（不要碰到中間的白膜），加入無水乙醇，混勻，然后以每次700 μl移至離心柱內，以10 000轉/min離心15 s；然后參照說明書用試劑盒內的Buffer純化RNA，最后以RNase-free water溶解RNA；取1 μl使用RNA核酸定量儀測定OD值，另取5 μl應用1%瓊脂糖電泳檢測是否具有清晰的3 條帶，其余80 ℃保存供反轉錄使用。
1.3.2 逆轉錄
在冰上配制逆轉錄反應液，體系組成見表 1。反應循環參數：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃forever。
表1
反轉錄體系
1.3.3 SYBR Green qRT-PCR擴增在冰上配置20 μl
real-time PCR反應體系，見表 2。反應條件為：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s，40個循環。記錄每個反應管中的熒光信號到達所設立的閾值時經歷的循環數即Ct值。將原始數據取3次重復的平均值后用內參基因U6B進行歸一化，得出ΔCt，ΔCt=CtmiR-155-CtU6B，應用2-ΔCt分別計算癌組織及配對癌旁組織中miR-155的相對表達量。然后應用2-ΔΔCt方法計算食管鱗癌組織相對于其癌旁正常黏膜組織的miR-155表達水平[8]。其中ΔΔCt=ΔCt（癌組織）-ΔCt（癌旁正常組織）。2-ΔΔCt表示腫瘤組織中所檢測目的基因相對于癌旁正常組織的表達倍數。
表2
SYBR Green qRT-PCR擴增體系
1.4 統計學分析
用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。由于結果數據為非正態分布資料，故對配對樣本采用非參數Wilcoxon配對秩和檢驗，兩個獨立樣本采用Mann-Whitney U檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 總RNA質量檢測及qRT-PCR結果
使用miRNA專用提取試劑盒（miRNeasy Mini kit）分別從54例食管鱗癌組織和對應的癌旁正常黏膜組織中提取總RNA后，運用核酸定量儀測定OD值，D260/D280的比值范圍在1.8～2.1；1%瓊脂糖電泳檢測有3條清晰的rRNA帶，分別為28 s、18 s和5 s。以上結果表明總RNA樣品完整性好，其純度、濃度符合熒光qRT-PCR的要求。qRT-PCR結果見圖 1。
圖1
SYBR Green qRT-PCR結果
注：A：miR-155基因PCR產物的熔解曲線峰值約在74.4 ℃；B：U6B基因PCR產物的溶解曲線約在75 ℃，溶解溫度均較為均一，峰的形態明顯，顯示擴增的為特異性序列；C：miR-155擴增曲線良好；D：U6B擴增曲線良好
2.2 miR-155在食管鱗癌組織及癌旁正常黏膜組織中的表達情況
miR-155在食管鱗癌組織中表達量的中位數為0.014 6，相應癌旁正常黏膜組織表達量的中位數為0.051 7；在54例食管鱗癌標本中，有44例（81%）miR-155的相對表達量下降。應用非參數配對秩和檢驗，食管鱗癌與相應癌旁正常黏膜組織中miR-155表達差異有統計學意義（Z=-4.258，P=0.000），提示miR-155在食管鱗癌組織中的表達顯著低于癌旁正常黏膜組織，見圖 2。
圖2
miR-155在食管鱗癌組織及癌癥正常黏膜組織的表達
2.3 miR-155相對于正常黏膜的表達及與臨床病理特征的關系
對54例食管鱗癌組織相對于其癌旁正常黏膜組織的miR-155表達水平與患者臨床病理參數進行相關性分析，發現miR-155的相對表達與淋巴結轉移顯著相關（P<0.05），但與年齡、性別、吸煙、飲酒、浸潤深度、腫瘤pTNM分期及分化程度等均無明顯相關性（P>0.05）。miR-155在有淋巴結轉移的患者中相對表達較低，見表 3。
表3
miR-155的相對表達水平與食管鱗癌臨床病理特征的關系
3 討論
miRNA是近年來發現于真核細胞中的一類長21～22個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA的3′UTRs （untranslated regions，非翻譯區）近乎完全互補結合在轉錄后水平使其降解，或者與之不完全互補結合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達中發揮重要的調節作用[9]。miRNA在細胞核及細胞質中首先被轉錄為長的初始片段（pri-miRNAs），然后經過一系列的過程生成成熟的miRNA，其過程共分3步：首先細胞核中的miRNA基因生成原始轉錄片段（pri-miRNAs）；然后經RNA內切酶ⅢDrosha剪切及一系列復雜的過程，生成70 nt長度的miRNA前體（pre-miRNAs）；隨后pre-miRNAs被轉運到細胞質，在這里被Dicer酶切割成成熟的miRNA[10]。成熟的miRNA能夠通過核酸序列互補識別特定的目標mRNA，使之降解或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質的合成，達到調控基因表達的目的。據推測，miRNA調節著人類1/3的基因，參與機體諸多生理病理過程[11]。根據miRNAs在腫瘤發生發展中作用的不同，有關研究提出了“癌miRNA”與“抑癌miRNA”的觀點。例如，miR-21作為一個致癌miRNA，在多種腫瘤的發生和發展中起著重要作用。近來研究發現，miR-21在食管鱗癌組織和食管癌細胞系中顯著高表達，它能通過抑制細胞凋亡相關分子來調控細胞增殖與侵襲[12]。Mori等[13]研究證實，miR-21可以與抑癌基因PTEN的3′-UTR結合。Ma等[14]研究發現，miR-21可能通過調節PTEN蛋白的表達而影響哈薩克族人食管鱗癌的發生、發展、浸潤和轉移。而let-7通過抑制HMGA2的表達在食管鱗癌中扮演著抑癌基因的角色[15]。
本研究采用熒光實時定量PCR法檢測了54例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中miR-155的表達水平，結果發現在食管鱗癌組織中miR-155表達顯著低于癌旁正常黏膜組織。Roldo等[16]研究發現miR-155在胰腺胰島細胞癌和腺泡細胞癌中均無表達，但是在正常胰腺組織中有表達。同時有關miR-155的腫瘤抑制作用也有報道。Dorsett等[17]證實miR-155是通過減少AID （activation-induced cyt-idinedeaminase）產生的潛在癌基因轉位而起到抑制腫瘤的作用。因此，我們推測miR-155在食管鱗癌的發生中可能起著抑癌基因的作用，有望成為食管鱗癌分子防治的相關靶點。有意思的是，有研究表明miR-155在肺癌、乳腺癌等實體腫瘤中呈高表達，已經確認miR-155的高表達與白血病、乳腺癌、肺癌及胃癌的形成和發展有直接聯系[18-20]。這可能與miRNA在不同組織的腫瘤中表達具有差異性有關。
在炎癥及免疫的病理生理過程中，miR-155同樣發揮著重要的作用。巨噬細胞作為炎癥和免疫關鍵細胞之一，在多種炎癥遞質誘導下miR-155表達增加[21]。Vigorito等[22]證實在淋巴細胞免疫反應及生發中心的形成中miR-155發揮著重要作用。Rodriguez等[23]發現miR-155基因敲除鼠樹突狀細胞的抗原提呈功能受限。另外，miR-155基因敲除鼠生發中心的功能、T細胞依賴的抗體反應及細胞因子產生均降低[24]，而目前研究發現炎癥細胞是腫瘤間質的重要組成部分，在腫瘤發生發展中具有重要的作用。基于以上結果，我們推測miR-155相對表達的降低可能導致機體炎癥、免疫反應及相關抑癌機制的失調，進而促進了食管鱗癌的發生。本實驗結合病理資料分析，miR-155的相對表達與淋巴結轉移顯著相關（P<0.05），但與浸潤深度、腫瘤的pTNM分期及分化程度等均無明顯相關性（P>0.05）；有淋巴結轉移的患者中miR-155的表達較低。食管鱗癌中miR-155的相對表達水平在食管鱗癌進展中的作用有待進一步研究。
綜上所述，本研究結果提示miR-155相對表達量的下降可能導致相關抑癌機制的失調，進而有利于食管鱗癌的發生、發展，其確切機制有待進一步研究。隨著研究的深入，相信miR-155可能成為一個全新的食管鱗癌診斷和治療靶點。
