引用本文： 繆驥, 馬鋒, 劉學民, 向俊西, 董鼎輝, 呂毅. 低滲HEPES緩沖溶液對腹腔內游離肝癌細胞殺傷作用的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(1): 55-59. doi: 10.7507/1007-9424.20150014 復制
腹腔內游離癌細胞（intraperitoneal free cancer cells，IFCCs）是腹腔惡性腫瘤發生腹腔種植轉移的重要影響因素，而腹腔種植轉移的發生嚴重影響患者的預后。目前，主要通過腹腔沖洗液細胞學（peritoneal washing cytology）[1]檢查來檢測IFCCs，采用腫瘤細胞減滅術（cytoreductive surgery，CRS）及腹腔內化療（intraperitoneal chemotherapy）[2]來殺滅IFCCs。原發性肝癌作為最主要的腹腔惡性腫瘤之一，惡性程度極高。一方面因其容易突破包膜生長，早期容易形成肝內轉移和門靜脈癌栓；另一方面，肝癌組織十分脆弱，容易破裂出血，導致大量癌細胞脫落進入腹腔形成IFCCs，從而導致腹腔種植轉移。孫延富等[3]對肝癌術中IFCCs與術后種植轉移的相關性進行分析，認為IFFCs的數量對術后種植轉移的發生率有一定的預測作用，通過采取有效的措施減少IFFCs可以預防肝癌腹腔種植轉移。對于胃癌和結直腸癌術中的IFFCs處理研究較多，包括廣泛的多次腹腔灌洗（extensive intraoperative peritoneal lavage）[4]、持續高溫腹腔灌洗（continuous hyperthermic peritoneal perfusion）[5]、腹腔內溫熱灌注化療（intraperitoneal hyperthermic chemotherapy）等。但對肝癌腹腔種植轉移預防的研究，國內外文獻報道較少。張海斌等[6]報道，臨床應用蒸餾水充分沖洗腹腔對預防和治療肝癌術后腹腔種植有一定的作用，但并沒有充分的理論實驗研究。為了進一步探索肝癌手術中應用蒸餾水沖洗腹腔的條件，本研究通過MTT法以及流式細胞儀對肝癌細胞在低滲溶液中的存活狀態進行觀察，為其在臨床應用提供理論依據。
1 材料和方法
1.1 主要試劑及儀器
RPMI 1640培養基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco BRL公司)；噻唑藍(MTT)和萬古霉素(Sigma公司)；酶標儀(EnSpire PerkinElmer公司)；生物安全柜(SterilGARD The BAKER公司)；二氧化碳培養箱(Thermo Scientific)；低速離心機(SC-3610，安徽中科中佳科學儀器有限公司)；96孔培養板、6孔培養板及90 mm培養皿(JET BIOFIL)；PH計3505型(英格蘭JENWAY)；滲透壓測試儀（Cryobasic）；流式細胞儀（FACS Calibur flow cytometer，Becton Dickinson，USA)；超純水系統(英國ELGA)。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
取人肝癌Hep3B細胞株1×107個，用含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養基常規于37℃、5% CO2培養箱中傳代培養，傳至第6代。
1.2.2 等滲液配制
取去離子水1 L、NaCl 8.209 g、KCl 0.377 g、CaCl2 0.111 g、MgCl2·6H2O 0.21 g、葡萄糖0.91 g及羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）2.384 g配制等滲液，使用NaOH調pH至7.4，滲透壓測定為300 mosmol/kg，高壓滅菌。
1.2.3 MTT法檢測細胞活性
取對數生長期的Hep3B肝癌細胞用胰酶-EDTA消化后，以5×104個/ mL的濃度向96孔板接種50μL/孔，在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養36 h。將等滲液用蒸餾水稀釋制備出不同滲透壓的HEPES緩沖溶液：取250 mL HEPES緩沖溶液分別加250和750 mL去離子水混合，其滲透壓分別為148和90 mosmol/kg，高壓滅菌。按處理液的不同實驗共分為4組：300 mosmol/kg HEPES組、148 mosmol/kg HEPES組、90 mosmol/kg HEPES組和0 mosmol/kg蒸餾水組，其中未經處理的細胞溶液為陰性對照，不含細胞的各處理液為空白對照，每組設3個復孔。分別作用1、5、10和30 min后，取出96孔板，去除培養液，加入對應處理液1 mL再作用1 min，然后將處理液取出，加入到已裝有1 mL培養液的離心管中在低速離心機中以轉速800 r/min的速度離心5 min（r=8 cm），倒去上清液，以200μL培養基吹打沉淀，并接種于各孔。隨后每孔加入5 mg/mg的MTT 20μL，繼續將96孔板放入溫箱孵育4 h后加入二甲基亞砜(DMSO) 100μL /孔，室濕避光放置，作用30 min后震蕩均勻，用酶聯免疫測定儀檢測波長492 nm處每孔的吸光度值(A值)，并計算細胞指數。細胞指數(CI)=1-(實驗孔的平均A值-空白組平均A值)/(陰性對照孔的平均A值-空白組平均A值)。
1.2.4 流式細胞儀檢測細胞狀態
取對數生長期的Hep3B肝癌細胞用胰酶-EDTA消化，以5×104個/mL
的濃度向6孔板接種1 mL/孔。在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養48 h。仍按處理液的不同分為4組：300 mosmol/kg HEPES組、148 mosmol / kg HEPES組、90 mosmol/kg HEPES組和0 mosmol / kg蒸餾水組，其中300 mosmol/kg HEPES組作為對照組。分別使用處理液作用1、5和10 min，收集處理后的細胞，用HEPES溶液吹打均勻，在流式細胞儀中檢測細胞狀態。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 不同滲透壓的HEPES溶液作用不同時間對肝癌細胞株Hep3B活性的影響
結果見表 1。由表 1可見，各時相隨著溶液滲透壓的降低，肝癌細胞株Hep3B的A值均逐漸降低。148 mosmol/kg HEPES組和90 mosmol/kg HEPES組的低滲液對肝癌細胞株Hep3B的殺傷作用不明顯，各時間點肝癌細胞株Hep3B的A值差異均無統計學意義（P > 0.05），且與300 mosmol/kg HEPES組相比差異也無統計學意義（P > 0.05）。0 mosmol/kg蒸餾水組與300 mosmol/kg HEPES組相比，各時間點肝癌細胞株Hep3B的A值均明顯降低（P < 0.05，P < 0.01）；同時作用30 min與作用1 min相比，肝癌細胞株Hep3B的A值也明顯降低P < 0.01）。結果提示，低滲液對肝癌細胞株Hep3B可產生殺傷作用，滲透壓越低，對細胞的殺傷作用越明顯；蒸餾水對肝癌細胞株Hep3B可產生穩定的殺傷作用。
表1
各組不同時間肝癌細胞株Hep3B的A值（n=3，2.2 不同滲透壓的HEPES溶液作用不同時間后肝癌細胞株Hep3B的狀態變化
以300 mosmol/kg HEPES組作為對照組，各時相148 mosmol/kg HEPES組和90 mosmol/kg HEPES組的低滲液對肝癌細胞株Hep3B的影響均較小，細胞活性大多正常，僅造成細胞腫脹即細胞體積增大，曲線右移。而0 mosmol/kg蒸餾水對肝癌細胞株Hep3B的殺傷效應則隨時間延長逐漸增強，作用1 min時小部分細胞破碎，部分細胞腫脹，呈現低雙峰曲線；作用5 min時部分細胞破碎，大部分細胞腫脹，呈現高雙峰曲線；作用10 min時腫脹的細胞基本破碎，曲線表明主要剩細胞碎片，而在小體積處呈現單峰曲線（圖 1和圖 2）。
圖1
示各組作用不同時間后肝癌細胞株Hep3B的狀態??圖 2示各組肝癌細胞株Hep3B的體積-數量關系曲線
3 討論
現代腫瘤根治術包括原發腫瘤的充分切除、淋巴結徹底清除和完全消滅IFCCs。盡管并不是腹腔內存在IFCCs就會形成種植，但腹腔的溫暖環境與其提供的豐富血供為IFCCs提供了最有利的生存條件，當腫瘤細胞散落到網膜組織、胃壁、腸管壁、系膜或腹膜上時，可迅速獲得一定的營養血供并隨后發展成為腫瘤。隨著對IFCCs的重視，其檢測方法也逐漸多樣化，包括腹腔沖洗液的細胞學檢查（正常染色法及特殊染色法）[7]、CEA mRNA的PCR檢測、CK20 mRNA的PCR檢測、CD44 mRNA的PCR檢測等，其中CEA、CK20和CD44主要針對胃腸道腫瘤的IFCCs的檢測[8]。對于肝癌的IFCCs仍主要以細胞學檢查為主，其假陰性率較高。
對于IFCCs的治療，國內外目前通常主要采用高溫、低滲、化學藥物等手段。高溫的治療機理主要包括對腫瘤細胞表面的破壞以及內部的破壞。表面的破壞主要破壞細胞膜表面的酶復合體，進而影響物質運輸、能量轉換、信息傳遞等機能；內部的破壞主要指腫瘤細胞的DNA結構改變，使其雙鏈斷裂[9]。全麻狀態下，容積3 000 mL、溫度45℃的生理鹽水灌入溫度為33℃的腹腔內，不斷攪動1 min后灌注液溫度降至38℃以下，2 min內就已降至36℃以下，因而其療效受到很大程度的限制[10]。所以對于腹腔環境來說，持續的溫熱灌注才能保證腹腔溫度達到實驗條件。而其最高溫度應選擇臨界溫度43℃，以確保對正常組織損害最小[11]。
低滲蒸餾水破壞腫瘤細胞的研究早在20世紀60年代就已經開始，但經過不同中心的臨床應用后發現，單純應用蒸餾水沖洗殺滅腫瘤細胞的效果不確定[12-13]。1985年，Mercill等[14]研究了蒸餾水對8種人類腫瘤細胞的殺傷效應，包括卵巢癌細胞、乳腺癌細胞、黑色素瘤細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、膀胱癌細胞、多發性骨髓瘤細胞和平滑肌肉瘤細胞，其中多發性骨髓瘤細胞和平滑肌肉瘤細胞對低滲蒸餾水十分敏感，4 min以內全部被蒸餾水殺滅；胃癌細胞、黑色素瘤細胞和乳腺癌細胞對低滲蒸餾水中度敏感，大約在10 min左右大部分腫瘤細胞被蒸餾水殺滅；另一種黑色素瘤細胞、膀胱癌細胞和卵巢癌細胞對低滲蒸餾水不敏感，10 min后仍有50%左右的腫瘤細胞未被滅活。由此可見，腫瘤細胞對低滲蒸餾水敏感性差異較大。本實驗中低滲蒸餾水對肝癌細胞作用10 min左右，大部分細胞被殺滅，該肝癌細胞對低滲蒸餾水中度敏感。低滲液可以造成細胞腫脹，開始時造成的損傷為可逆性，細胞可通過自身的調節來代償，一旦失代償其損傷則轉化為不可逆性的。目前認為低滲液對細胞的殺傷主要是啟動了細胞的凋亡程序，與細胞膜上的AQP2、AQP5等各種水通道有關[15-16]。本實驗通過研究不同滲透壓的溶液對Hep3B肝癌細胞的作用，發現148 mosmol/kg及90 mosmol/kg的低滲溶液對該肝癌細胞的殺傷效果較差，通過流式細胞儀的具體測量發現低滲蒸餾水對肝癌細胞產生了明顯的調節性細胞容積減小（regulatory volume decrease，RVD）[17-18]。Kosuga等[19]研究低滲蒸餾水對食管癌細胞的殺傷作用，提出NPPB〔5-硝基-2-（3苯丙氨基）苯甲酸〕一種氯離子通道阻滯劑，能與低滲蒸餾水產生協同作用，可加強低滲蒸餾水對食管癌細胞的殺傷效應。該通道作為容積調節性陰離子外流的主要途徑，在細胞的滲透性腫脹引起RVD過程中起著非常重要的作用[20-22]。Takemoto等[23]研究低滲蒸餾水對結直腸腫瘤細胞的作用，通過體外及體內實驗，進一步說明調節氯離子通道能加強低滲蒸餾水的殺傷效應。在實際臨床應用溫熱蒸餾水灌洗時，至少需作用10 min。而有研究[24-26]表明，在低滲蒸餾水對腹膜腔進行灌洗時，腹膜的大量分泌液會改變灌洗液的滲透壓，影響作用效果，通過持續灌注可以維持低滲透壓狀態。
4 結論
本實驗室結果提示，在肝癌手術中可應用持續溫熱蒸餾水灌洗，作用10 min以上可以起到殺滅IFCCs的作用，進而預防術后腹膜種植轉移的發生。臨床實際應用的效果還需要進一步的臨床實驗來對比研究；實驗的下一步見將通過研究具體通道改變對低滲蒸餾水發揮作用的影響，以進一步探究肝癌細胞在低滲狀態下產生RVD的具體機理。
腹腔內游離癌細胞（intraperitoneal free cancer cells，IFCCs）是腹腔惡性腫瘤發生腹腔種植轉移的重要影響因素，而腹腔種植轉移的發生嚴重影響患者的預后。目前，主要通過腹腔沖洗液細胞學（peritoneal washing cytology）[1]檢查來檢測IFCCs，采用腫瘤細胞減滅術（cytoreductive surgery，CRS）及腹腔內化療（intraperitoneal chemotherapy）[2]來殺滅IFCCs。原發性肝癌作為最主要的腹腔惡性腫瘤之一，惡性程度極高。一方面因其容易突破包膜生長，早期容易形成肝內轉移和門靜脈癌栓；另一方面，肝癌組織十分脆弱，容易破裂出血，導致大量癌細胞脫落進入腹腔形成IFCCs，從而導致腹腔種植轉移。孫延富等[3]對肝癌術中IFCCs與術后種植轉移的相關性進行分析，認為IFFCs的數量對術后種植轉移的發生率有一定的預測作用，通過采取有效的措施減少IFFCs可以預防肝癌腹腔種植轉移。對于胃癌和結直腸癌術中的IFFCs處理研究較多，包括廣泛的多次腹腔灌洗（extensive intraoperative peritoneal lavage）[4]、持續高溫腹腔灌洗（continuous hyperthermic peritoneal perfusion）[5]、腹腔內溫熱灌注化療（intraperitoneal hyperthermic chemotherapy）等。但對肝癌腹腔種植轉移預防的研究，國內外文獻報道較少。張海斌等[6]報道，臨床應用蒸餾水充分沖洗腹腔對預防和治療肝癌術后腹腔種植有一定的作用，但并沒有充分的理論實驗研究。為了進一步探索肝癌手術中應用蒸餾水沖洗腹腔的條件，本研究通過MTT法以及流式細胞儀對肝癌細胞在低滲溶液中的存活狀態進行觀察，為其在臨床應用提供理論依據。
1 材料和方法
1.1 主要試劑及儀器
RPMI 1640培養基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco BRL公司)；噻唑藍(MTT)和萬古霉素(Sigma公司)；酶標儀(EnSpire PerkinElmer公司)；生物安全柜(SterilGARD The BAKER公司)；二氧化碳培養箱(Thermo Scientific)；低速離心機(SC-3610，安徽中科中佳科學儀器有限公司)；96孔培養板、6孔培養板及90 mm培養皿(JET BIOFIL)；PH計3505型(英格蘭JENWAY)；滲透壓測試儀（Cryobasic）；流式細胞儀（FACS Calibur flow cytometer，Becton Dickinson，USA)；超純水系統(英國ELGA)。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
取人肝癌Hep3B細胞株1×107個，用含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養基常規于37℃、5% CO2培養箱中傳代培養，傳至第6代。
1.2.2 等滲液配制
取去離子水1 L、NaCl 8.209 g、KCl 0.377 g、CaCl2 0.111 g、MgCl2·6H2O 0.21 g、葡萄糖0.91 g及羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）2.384 g配制等滲液，使用NaOH調pH至7.4，滲透壓測定為300 mosmol/kg，高壓滅菌。
1.2.3 MTT法檢測細胞活性
取對數生長期的Hep3B肝癌細胞用胰酶-EDTA消化后，以5×104個/ mL的濃度向96孔板接種50μL/孔，在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養36 h。將等滲液用蒸餾水稀釋制備出不同滲透壓的HEPES緩沖溶液：取250 mL HEPES緩沖溶液分別加250和750 mL去離子水混合，其滲透壓分別為148和90 mosmol/kg，高壓滅菌。按處理液的不同實驗共分為4組：300 mosmol/kg HEPES組、148 mosmol/kg HEPES組、90 mosmol/kg HEPES組和0 mosmol/kg蒸餾水組，其中未經處理的細胞溶液為陰性對照，不含細胞的各處理液為空白對照，每組設3個復孔。分別作用1、5、10和30 min后，取出96孔板，去除培養液，加入對應處理液1 mL再作用1 min，然后將處理液取出，加入到已裝有1 mL培養液的離心管中在低速離心機中以轉速800 r/min的速度離心5 min（r=8 cm），倒去上清液，以200μL培養基吹打沉淀，并接種于各孔。隨后每孔加入5 mg/mg的MTT 20μL，繼續將96孔板放入溫箱孵育4 h后加入二甲基亞砜(DMSO) 100μL /孔，室濕避光放置，作用30 min后震蕩均勻，用酶聯免疫測定儀檢測波長492 nm處每孔的吸光度值(A值)，并計算細胞指數。細胞指數(CI)=1-(實驗孔的平均A值-空白組平均A值)/(陰性對照孔的平均A值-空白組平均A值)。
1.2.4 流式細胞儀檢測細胞狀態
取對數生長期的Hep3B肝癌細胞用胰酶-EDTA消化，以5×104個/mL
的濃度向6孔板接種1 mL/孔。在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養48 h。仍按處理液的不同分為4組：300 mosmol/kg HEPES組、148 mosmol / kg HEPES組、90 mosmol/kg HEPES組和0 mosmol / kg蒸餾水組，其中300 mosmol/kg HEPES組作為對照組。分別使用處理液作用1、5和10 min，收集處理后的細胞，用HEPES溶液吹打均勻，在流式細胞儀中檢測細胞狀態。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 不同滲透壓的HEPES溶液作用不同時間對肝癌細胞株Hep3B活性的影響
結果見表 1。由表 1可見，各時相隨著溶液滲透壓的降低，肝癌細胞株Hep3B的A值均逐漸降低。148 mosmol/kg HEPES組和90 mosmol/kg HEPES組的低滲液對肝癌細胞株Hep3B的殺傷作用不明顯，各時間點肝癌細胞株Hep3B的A值差異均無統計學意義（P > 0.05），且與300 mosmol/kg HEPES組相比差異也無統計學意義（P > 0.05）。0 mosmol/kg蒸餾水組與300 mosmol/kg HEPES組相比，各時間點肝癌細胞株Hep3B的A值均明顯降低（P < 0.05，P < 0.01）；同時作用30 min與作用1 min相比，肝癌細胞株Hep3B的A值也明顯降低P < 0.01）。結果提示，低滲液對肝癌細胞株Hep3B可產生殺傷作用，滲透壓越低，對細胞的殺傷作用越明顯；蒸餾水對肝癌細胞株Hep3B可產生穩定的殺傷作用。
表1
各組不同時間肝癌細胞株Hep3B的A值（n=3，2.2 不同滲透壓的HEPES溶液作用不同時間后肝癌細胞株Hep3B的狀態變化
以300 mosmol/kg HEPES組作為對照組，各時相148 mosmol/kg HEPES組和90 mosmol/kg HEPES組的低滲液對肝癌細胞株Hep3B的影響均較小，細胞活性大多正常，僅造成細胞腫脹即細胞體積增大，曲線右移。而0 mosmol/kg蒸餾水對肝癌細胞株Hep3B的殺傷效應則隨時間延長逐漸增強，作用1 min時小部分細胞破碎，部分細胞腫脹，呈現低雙峰曲線；作用5 min時部分細胞破碎，大部分細胞腫脹，呈現高雙峰曲線；作用10 min時腫脹的細胞基本破碎，曲線表明主要剩細胞碎片，而在小體積處呈現單峰曲線（圖 1和圖 2）。
圖1
示各組作用不同時間后肝癌細胞株Hep3B的狀態??圖 2示各組肝癌細胞株Hep3B的體積-數量關系曲線
3 討論
現代腫瘤根治術包括原發腫瘤的充分切除、淋巴結徹底清除和完全消滅IFCCs。盡管并不是腹腔內存在IFCCs就會形成種植，但腹腔的溫暖環境與其提供的豐富血供為IFCCs提供了最有利的生存條件，當腫瘤細胞散落到網膜組織、胃壁、腸管壁、系膜或腹膜上時，可迅速獲得一定的營養血供并隨后發展成為腫瘤。隨著對IFCCs的重視，其檢測方法也逐漸多樣化，包括腹腔沖洗液的細胞學檢查（正常染色法及特殊染色法）[7]、CEA mRNA的PCR檢測、CK20 mRNA的PCR檢測、CD44 mRNA的PCR檢測等，其中CEA、CK20和CD44主要針對胃腸道腫瘤的IFCCs的檢測[8]。對于肝癌的IFCCs仍主要以細胞學檢查為主，其假陰性率較高。
對于IFCCs的治療，國內外目前通常主要采用高溫、低滲、化學藥物等手段。高溫的治療機理主要包括對腫瘤細胞表面的破壞以及內部的破壞。表面的破壞主要破壞細胞膜表面的酶復合體，進而影響物質運輸、能量轉換、信息傳遞等機能；內部的破壞主要指腫瘤細胞的DNA結構改變，使其雙鏈斷裂[9]。全麻狀態下，容積3 000 mL、溫度45℃的生理鹽水灌入溫度為33℃的腹腔內，不斷攪動1 min后灌注液溫度降至38℃以下，2 min內就已降至36℃以下，因而其療效受到很大程度的限制[10]。所以對于腹腔環境來說，持續的溫熱灌注才能保證腹腔溫度達到實驗條件。而其最高溫度應選擇臨界溫度43℃，以確保對正常組織損害最小[11]。
低滲蒸餾水破壞腫瘤細胞的研究早在20世紀60年代就已經開始，但經過不同中心的臨床應用后發現，單純應用蒸餾水沖洗殺滅腫瘤細胞的效果不確定[12-13]。1985年，Mercill等[14]研究了蒸餾水對8種人類腫瘤細胞的殺傷效應，包括卵巢癌細胞、乳腺癌細胞、黑色素瘤細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、膀胱癌細胞、多發性骨髓瘤細胞和平滑肌肉瘤細胞，其中多發性骨髓瘤細胞和平滑肌肉瘤細胞對低滲蒸餾水十分敏感，4 min以內全部被蒸餾水殺滅；胃癌細胞、黑色素瘤細胞和乳腺癌細胞對低滲蒸餾水中度敏感，大約在10 min左右大部分腫瘤細胞被蒸餾水殺滅；另一種黑色素瘤細胞、膀胱癌細胞和卵巢癌細胞對低滲蒸餾水不敏感，10 min后仍有50%左右的腫瘤細胞未被滅活。由此可見，腫瘤細胞對低滲蒸餾水敏感性差異較大。本實驗中低滲蒸餾水對肝癌細胞作用10 min左右，大部分細胞被殺滅，該肝癌細胞對低滲蒸餾水中度敏感。低滲液可以造成細胞腫脹，開始時造成的損傷為可逆性，細胞可通過自身的調節來代償，一旦失代償其損傷則轉化為不可逆性的。目前認為低滲液對細胞的殺傷主要是啟動了細胞的凋亡程序，與細胞膜上的AQP2、AQP5等各種水通道有關[15-16]。本實驗通過研究不同滲透壓的溶液對Hep3B肝癌細胞的作用，發現148 mosmol/kg及90 mosmol/kg的低滲溶液對該肝癌細胞的殺傷效果較差，通過流式細胞儀的具體測量發現低滲蒸餾水對肝癌細胞產生了明顯的調節性細胞容積減小（regulatory volume decrease，RVD）[17-18]。Kosuga等[19]研究低滲蒸餾水對食管癌細胞的殺傷作用，提出NPPB〔5-硝基-2-（3苯丙氨基）苯甲酸〕一種氯離子通道阻滯劑，能與低滲蒸餾水產生協同作用，可加強低滲蒸餾水對食管癌細胞的殺傷效應。該通道作為容積調節性陰離子外流的主要途徑，在細胞的滲透性腫脹引起RVD過程中起著非常重要的作用[20-22]。Takemoto等[23]研究低滲蒸餾水對結直腸腫瘤細胞的作用，通過體外及體內實驗，進一步說明調節氯離子通道能加強低滲蒸餾水的殺傷效應。在實際臨床應用溫熱蒸餾水灌洗時，至少需作用10 min。而有研究[24-26]表明，在低滲蒸餾水對腹膜腔進行灌洗時，腹膜的大量分泌液會改變灌洗液的滲透壓，影響作用效果，通過持續灌注可以維持低滲透壓狀態。
4 結論
本實驗室結果提示，在肝癌手術中可應用持續溫熱蒸餾水灌洗，作用10 min以上可以起到殺滅IFCCs的作用，進而預防術后腹膜種植轉移的發生。臨床實際應用的效果還需要進一步的臨床實驗來對比研究；實驗的下一步見將通過研究具體通道改變對低滲蒸餾水發揮作用的影響，以進一步探究肝癌細胞在低滲狀態下產生RVD的具體機理。
