引用本文： 黃瑩, 張建, 陳兵, 楊盛家, 燕超, 李立強, 閆峰. 小鼠后肢缺血肌肉及骨髓氧分壓與HIF-1α蛋白水平的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(1): 50-54. doi: 10.7507/1007-9424.20150013 復制
是細胞或組織在缺氧情況下產生的一種核轉錄因子，由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成的異二聚體，其中HIF-1α亞基受氧濃度調控，β亞基不依賴氧濃度而在細胞核穩定存在[1-3]。HIF-1α在缺氧時通過控制參與相關程序的基因表達來改善氧運輸及適應缺氧情況，對血管新生有很強的調節作用，在許多缺氧性疾病的病理過程中都發揮著重要作用[4-5]。本研究通過檢測正常生理及后肢缺血不同時期小鼠股骨骨髓組織及肌肉組織的氧分壓水平，并通過HIF-1α蛋白變化趨勢探討缺血時間、組織氧分壓與HIF-1α之間的關系。旨在為干細胞/祖細胞體外研究的氧濃度設定提供依據。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要試劑及設備
清潔級成年雄性Balb/c小鼠30只，體質量（20±2）g，鼠齡（8±1）周，由首都醫科大學宣武醫院動物實驗中心提供。試劑：10%水合氯醛（首都醫科大學宣武醫院試劑室），HIF-1α一抗（兔抗小鼠, 美國Bioworld公司），辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（山羊抗兔，美國Abcam公司）。儀器：組織氧分壓測定儀（Unique Medical Japan Co，Ltd），手術顯微鏡（德國Zeiss公司）。
1.2 實驗分組及小鼠后肢缺血模型的制備
30只Balb/c小鼠按隨機抽簽法分為正常對照組以及后肢缺血24 h、1周、2周和3周組，每組6只。后肢缺血模型的制備：Balb/c小鼠以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，將股動脈自起始段至膝上水平電凝離斷，并逐步分離其主要分支，電凝離斷之[6]建立后肢缺血模型；操作過程中避免股靜脈及股神經損傷。正常對照組小鼠不進行手術操作。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 后肢肌肉及骨髓氧分壓的測定
采用組織氧分壓測定儀測量每組小鼠患側及健側腓腸肌和股骨近端骨髓的氧分壓水平。具體測量方法如下：將小鼠腹腔麻醉后仰臥位固定，于腓腸肌體表定位處剪一0.3 cm長小口，針管導引下放入氧分壓電極，待數值穩定3～5 min后讀數。將小鼠待測后肢翻起，使大腿外側朝上，剪開皮膚、分離股骨近端肌肉，用6號針頭在股骨近端外側鉆一小孔，小心將氧分壓電極置入骨髓腔0.5 cm，待數值穩定3～5 min后讀數。
1.3.2 后肢腓腸肌病理學檢查
取各組小鼠腓腸肌組織0.2～0.3g置于10%甲醛液固定，石蠟包埋，平行肌肉纖維走向做4μm厚切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察后肢腓腸肌組織的病理學改變。
1.3.3 Western blot法檢測HIF-1α蛋白表達水平
將不同缺血時間點的小鼠腓腸肌勻漿，骨髓用PBS沖洗后離心（5 000 r/min×5min，r=13.5cm，4℃），按試劑盒說明書進行蛋白提取，然后用Western blot法行HIF-1α蛋白表達水平檢測：變性后以80μg/孔上樣，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳（100 V，100 min），醋酸纖維素膜轉膜（100 V，75 min），脫脂奶粉封閉1 h，TBST沖洗10 min×3次后，HIF-1α一抗4℃孵育過夜，TBST沖洗10 min×3次，孵育HRP標記的二抗2 h，采用BioRad成像系統照相后計算成像灰度值，以Tubulin為內參照。
1.4 統計學方法
對測得的組織氧分壓數據采用SPSS 18.0軟件進行配對t檢驗分析；對腓腸肌組織氧分壓與腓腸肌HIF-1α蛋白表達水平進行Pearson相關性分析，用r值表示，正值代表正相關，負值代表負相關。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 小鼠后肢缺血模型的構建情況
將小鼠股動脈取出后，分別于缺血24 h、1周、2周和3周觀察患肢的缺血情況。缺血24 h可見患肢足部皮膚色澤較對側暗，趾端出現壞疽；缺血1周可見患肢腫脹明顯，趾端壞疽范圍較前擴大；缺血2周可見患肢腫脹消退，趾端壞疽范圍無明顯變化；缺血3周小鼠趾端壞疽部分脫落（圖 1）。
圖1
示不同缺血時間小鼠缺血后肢的大體觀察結果, 黑色箭頭所指為手術側肢體。1A:缺血24 h; 1B:缺血1周; 1C:缺血2周; 1D:缺血3周??圖 2示小鼠不同缺血時間腓腸肌組織的病理學改變(HE×400)。2A:正常對照; 2B:缺血24 h; 2C:缺血1周; 2D:缺血2周; 2E:缺血3周
2.2 小鼠缺血后肢腓腸肌組織的病理學改變
缺血24 h見腓腸肌組織橫紋結構紊亂，細胞腫脹，肌間可見炎性細胞浸潤；缺血1周見肌纖維形態雖存在，但細胞核已碎裂，肌間可見大量炎性細胞浸潤，胞漿伊紅著色加深；缺血2周，見炎性細胞浸潤有所減少；缺血3周，見肌纖維萎縮，纖維間脂肪組織填充（圖 2）。
2.3 小鼠缺血后肢腓腸肌及骨髓組織氧分壓測定結果
缺血后肢腓腸肌組織氧分壓測定結果見圖 3A。由圖 3A可見，各時點小鼠患側腓腸肌組織的氧分壓均較健側下降（P < 0.05），尤以缺血24 h和缺血1周時下降更明顯些（P < 0.01）；患肢腓腸肌組織的氧分壓在缺血1周時達到最低，此后則有所升高，但仍低于正常基礎值。小鼠健側及患側股骨骨髓在不同缺血時間組織氧分壓測定結果見圖 3B。由圖 3B可見，各時點小鼠患側骨髓氧分壓的變化不明顯，其差異均無統計學意義（P > 0.05），但較正常基礎值有所升高。
圖3
示不同缺血時間點健、患側腓腸肌（3A）及骨髓（3B）組織氧分壓檢測結果。黑色為健側肢體，灰色為患側肢體，從左至右依次為正常對照組、缺血24 h組、缺血1周組、缺血2周組和缺血3周組
2.4 腓腸肌HIF-1α蛋白表達水平檢測結果
腓腸肌中HIF-1α蛋白表達情況見圖 4，根據其表達情況計算每組腓腸肌組織中HIF-1α和Tubulin的灰度值，將前者除以后者即為HIF-1α蛋白的相對表達水平（表 1）。由表 1可見，在正常小鼠腓腸肌中，HIF-1α蛋白有表達，但表達水平較低；缺血24 h，HIF-1α蛋白表達較正常水平有所下調；在缺血1周，HIF-1α蛋白表達水平明顯上調（P=0.000），但隨著缺血進入慢性期，HIF-1α蛋白表達水平則逐漸下調，至缺血3周，與正常對照組的表達水平接近。小鼠股骨骨髓細胞的HIF-1α蛋白在各缺血時間點均未見相應條帶表達。
圖4
示不同缺血時間點腓腸肌組織中HIF-1α蛋白表達的電泳結果。1：正常對照組；2：缺血24 h；3：缺血1周；4：缺血2周；5：缺血3周；Tubulin為內參照
表1
不同缺血時間腓腸肌HIF-1α蛋白表達水平與組織氧分壓的關系
2.5 腓腸肌組織中HIF-1α蛋白表達與其氧分壓的關系
將腓腸肌中HIF-1α蛋白表達的灰度值與相應的組織氧分壓進行Pearson相關分析，結果提示二者的相關性無統計學意義（r=-0.86，P=0.175）。
3 討論
骨髓源間充質干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）具有強大的自我更新及多系分化潛能，體內移植后可遷移至損傷部位，修復相應組織，是治療性血管新生（therapeutic angiogenesis）的重要研究內容[7-9]。BMSCs來源于骨髓，骨髓環境被認為是典型的低氧環境[10]。然而干細胞/祖細胞的體外研究通常是在常氧（氧體積分數21%）下進行，雖然能夠使干細胞擴增上億倍，但同時卻喪失了其原始特性和自我更新能力[11-12]。體外培養對體內低氧環境的模擬，首先要了解干細胞體內所處環境的氧分壓范圍。
近年研究[13-15]發現，氧是一個潛在的信號分子，能夠影響多種前體細胞的基本特性，低氧在血管生成中起了重要的調節作用。HIF-1是組織在缺氧應激下水平上調，而在常氧條件下迅速水解的一個重要轉錄因子。眾多研究[10, 12-13]顯示，其在干細胞生物學特性的維持、缺血組織血管再生等方面均起到十分重要的調控作用。于是研究者們[16-19]將細胞在不同氧濃度下進行培養，但得出的結論卻存在爭議，這可能與其選擇的氧濃度范圍差異較大和干細胞來源不同有關。
本研究通過極譜法測量正常以及不同缺血時期小鼠后肢腓腸肌和股骨骨髓的氧分壓值，發現在缺血1周時，腓腸肌組織氧分壓值達到最低，此時細胞壞死最為嚴重，HIF-1α蛋白表達水平也最高。隨著缺血進入慢性期，腓腸肌組織氧分壓值有所回升，HIF-1α蛋白表達水平也隨之下調。而缺血狀態下雙側股骨骨髓的氧分壓的變化不明顯，但均較正常股骨骨髓有所升高。
一般認為，在體外細胞培養的氧體積分數低于20%即為低氧，然而在體內，大氣中的氧氣經肺臟氣體交換、進入血液循環再到達組織間隙為細胞所利用，氧濃度已遠遠低于大氣氧濃度[20]。有學者[21]認為，氧體積分數在1%～10%（PO2為7.6～76 mm Hg）為生理性低氧，在< 1%時為病理性低氧。然而不同組織生理狀態下所需氧分壓差異巨大，Dyson等[20]總結了不同物種（人、大鼠、小鼠、狗、豬）不同組織（肌肉、肝臟、腎臟、膀胱）氧分壓的基礎值在12.75～68.25 mm Hg之間，骨髓氧分壓卻少有報道。Harrison等[22]曾于2002年報道正常人髂骨骨髓氧分壓為（54.9±0.98）mm Hg，其數值較本研究高的原因可能是由于采用血氣分析儀測定，在將骨髓抽出過程中可能接觸或混入空氣，而使數值較真實水平高。而本研究直接將測量電極置于活體骨髓，更能夠反映體內氧分壓的真實水平。
本研究采用經典的極譜法，將直徑為0.4 mm的Clark電極置入小鼠股骨骨髓腔內，測量其骨髓氧分壓值，其正常值范圍為（21.55±3.40）mm Hg，相當于（2.84±0.45）%氧體積分數。與后肢不同缺血時間骨髓組織氧分壓進行比較，發現患側和健側骨髓氧分壓較正常血運小鼠均有所升高，但同一缺血時間患側和健側骨髓氧分壓的差異不大。提示小鼠缺血后的修復過程可能由全身骨髓干細胞參與，但仍需進一步研究證實。
本研究測定了不同缺血時間段小鼠患側腓腸肌氧分壓的變化，發現其在缺血1周時達到最低，為（25.54±8.57）mm Hg，相當于（3.36±1.12）%氧體積分數，此時肌肉細胞已經發生了缺血壞死的表現；而肌肉組織的生理組織（正常對照組）氧分壓為（47.78±4.37）mm Hg，相當于（6.29±0.58）%氧體積分數。提示對于骨髓細胞而言是正常的氧分壓水平，但對肌肉而言卻是缺血性的。因此，對于特定物種的特定組織細胞，“生理性”的氧濃度范圍都是不同的。
研究者們[23-25]發現，后肢急性缺血動物模型中HIF-1αmRNA和蛋白表達均上調；但對于慢性缺血患者而言，HIF-1介導的血管生成和組織保護作用卻并不明顯[26]。本研究檢測了不同缺血時期肌肉組織中HIF-1α蛋白的表達，發現在缺血早期（24 h）HIF-1α蛋白表達下調，但缺血1周HIF-1α水平明顯上調，此時肌肉組織的炎癥性改變最為嚴重，肌肉組織氧分壓值亦達到最低。隨著缺血改變進入慢性期，肌肉組織氧分壓有所上升，HIF-1α蛋白表達同時下降，雖然兩者的相關性無統計學意義，缺血組織HIF-1α蛋白的表達水平仍然在一定程度上能夠反映肢體的缺血程度。
綜上，本研究揭示了小鼠后肢肌肉不同缺血時期氧分壓和HIF-1α蛋白表達演變的規律；確定了小鼠股骨骨髓的生理性氧分壓水平，強調不同組織細胞生理狀態的氧分壓的差異。而在體外培養中，相應低氧水平對骨髓源間充質干細胞是否有助于維持其未分化狀態及增殖能力，對間充質干細胞生物學特性有何影響，仍需進一步研究。
是細胞或組織在缺氧情況下產生的一種核轉錄因子，由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成的異二聚體，其中HIF-1α亞基受氧濃度調控，β亞基不依賴氧濃度而在細胞核穩定存在[1-3]。HIF-1α在缺氧時通過控制參與相關程序的基因表達來改善氧運輸及適應缺氧情況，對血管新生有很強的調節作用，在許多缺氧性疾病的病理過程中都發揮著重要作用[4-5]。本研究通過檢測正常生理及后肢缺血不同時期小鼠股骨骨髓組織及肌肉組織的氧分壓水平，并通過HIF-1α蛋白變化趨勢探討缺血時間、組織氧分壓與HIF-1α之間的關系。旨在為干細胞/祖細胞體外研究的氧濃度設定提供依據。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要試劑及設備
清潔級成年雄性Balb/c小鼠30只，體質量（20±2）g，鼠齡（8±1）周，由首都醫科大學宣武醫院動物實驗中心提供。試劑：10%水合氯醛（首都醫科大學宣武醫院試劑室），HIF-1α一抗（兔抗小鼠, 美國Bioworld公司），辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（山羊抗兔，美國Abcam公司）。儀器：組織氧分壓測定儀（Unique Medical Japan Co，Ltd），手術顯微鏡（德國Zeiss公司）。
1.2 實驗分組及小鼠后肢缺血模型的制備
30只Balb/c小鼠按隨機抽簽法分為正常對照組以及后肢缺血24 h、1周、2周和3周組，每組6只。后肢缺血模型的制備：Balb/c小鼠以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，將股動脈自起始段至膝上水平電凝離斷，并逐步分離其主要分支，電凝離斷之[6]建立后肢缺血模型；操作過程中避免股靜脈及股神經損傷。正常對照組小鼠不進行手術操作。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 后肢肌肉及骨髓氧分壓的測定
采用組織氧分壓測定儀測量每組小鼠患側及健側腓腸肌和股骨近端骨髓的氧分壓水平。具體測量方法如下：將小鼠腹腔麻醉后仰臥位固定，于腓腸肌體表定位處剪一0.3 cm長小口，針管導引下放入氧分壓電極，待數值穩定3～5 min后讀數。將小鼠待測后肢翻起，使大腿外側朝上，剪開皮膚、分離股骨近端肌肉，用6號針頭在股骨近端外側鉆一小孔，小心將氧分壓電極置入骨髓腔0.5 cm，待數值穩定3～5 min后讀數。
1.3.2 后肢腓腸肌病理學檢查
取各組小鼠腓腸肌組織0.2～0.3g置于10%甲醛液固定，石蠟包埋，平行肌肉纖維走向做4μm厚切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察后肢腓腸肌組織的病理學改變。
1.3.3 Western blot法檢測HIF-1α蛋白表達水平
將不同缺血時間點的小鼠腓腸肌勻漿，骨髓用PBS沖洗后離心（5 000 r/min×5min，r=13.5cm，4℃），按試劑盒說明書進行蛋白提取，然后用Western blot法行HIF-1α蛋白表達水平檢測：變性后以80μg/孔上樣，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳（100 V，100 min），醋酸纖維素膜轉膜（100 V，75 min），脫脂奶粉封閉1 h，TBST沖洗10 min×3次后，HIF-1α一抗4℃孵育過夜，TBST沖洗10 min×3次，孵育HRP標記的二抗2 h，采用BioRad成像系統照相后計算成像灰度值，以Tubulin為內參照。
1.4 統計學方法
對測得的組織氧分壓數據采用SPSS 18.0軟件進行配對t檢驗分析；對腓腸肌組織氧分壓與腓腸肌HIF-1α蛋白表達水平進行Pearson相關性分析，用r值表示，正值代表正相關，負值代表負相關。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 小鼠后肢缺血模型的構建情況
將小鼠股動脈取出后，分別于缺血24 h、1周、2周和3周觀察患肢的缺血情況。缺血24 h可見患肢足部皮膚色澤較對側暗，趾端出現壞疽；缺血1周可見患肢腫脹明顯，趾端壞疽范圍較前擴大；缺血2周可見患肢腫脹消退，趾端壞疽范圍無明顯變化；缺血3周小鼠趾端壞疽部分脫落（圖 1）。
圖1
示不同缺血時間小鼠缺血后肢的大體觀察結果, 黑色箭頭所指為手術側肢體。1A:缺血24 h; 1B:缺血1周; 1C:缺血2周; 1D:缺血3周??圖 2示小鼠不同缺血時間腓腸肌組織的病理學改變(HE×400)。2A:正常對照; 2B:缺血24 h; 2C:缺血1周; 2D:缺血2周; 2E:缺血3周
2.2 小鼠缺血后肢腓腸肌組織的病理學改變
缺血24 h見腓腸肌組織橫紋結構紊亂，細胞腫脹，肌間可見炎性細胞浸潤；缺血1周見肌纖維形態雖存在，但細胞核已碎裂，肌間可見大量炎性細胞浸潤，胞漿伊紅著色加深；缺血2周，見炎性細胞浸潤有所減少；缺血3周，見肌纖維萎縮，纖維間脂肪組織填充（圖 2）。
2.3 小鼠缺血后肢腓腸肌及骨髓組織氧分壓測定結果
缺血后肢腓腸肌組織氧分壓測定結果見圖 3A。由圖 3A可見，各時點小鼠患側腓腸肌組織的氧分壓均較健側下降（P < 0.05），尤以缺血24 h和缺血1周時下降更明顯些（P < 0.01）；患肢腓腸肌組織的氧分壓在缺血1周時達到最低，此后則有所升高，但仍低于正常基礎值。小鼠健側及患側股骨骨髓在不同缺血時間組織氧分壓測定結果見圖 3B。由圖 3B可見，各時點小鼠患側骨髓氧分壓的變化不明顯，其差異均無統計學意義（P > 0.05），但較正常基礎值有所升高。
圖3
示不同缺血時間點健、患側腓腸肌（3A）及骨髓（3B）組織氧分壓檢測結果。黑色為健側肢體，灰色為患側肢體，從左至右依次為正常對照組、缺血24 h組、缺血1周組、缺血2周組和缺血3周組
2.4 腓腸肌HIF-1α蛋白表達水平檢測結果
腓腸肌中HIF-1α蛋白表達情況見圖 4，根據其表達情況計算每組腓腸肌組織中HIF-1α和Tubulin的灰度值，將前者除以后者即為HIF-1α蛋白的相對表達水平（表 1）。由表 1可見，在正常小鼠腓腸肌中，HIF-1α蛋白有表達，但表達水平較低；缺血24 h，HIF-1α蛋白表達較正常水平有所下調；在缺血1周，HIF-1α蛋白表達水平明顯上調（P=0.000），但隨著缺血進入慢性期，HIF-1α蛋白表達水平則逐漸下調，至缺血3周，與正常對照組的表達水平接近。小鼠股骨骨髓細胞的HIF-1α蛋白在各缺血時間點均未見相應條帶表達。
圖4
示不同缺血時間點腓腸肌組織中HIF-1α蛋白表達的電泳結果。1：正常對照組；2：缺血24 h；3：缺血1周；4：缺血2周；5：缺血3周；Tubulin為內參照
表1
不同缺血時間腓腸肌HIF-1α蛋白表達水平與組織氧分壓的關系
2.5 腓腸肌組織中HIF-1α蛋白表達與其氧分壓的關系
將腓腸肌中HIF-1α蛋白表達的灰度值與相應的組織氧分壓進行Pearson相關分析，結果提示二者的相關性無統計學意義（r=-0.86，P=0.175）。
3 討論
骨髓源間充質干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）具有強大的自我更新及多系分化潛能，體內移植后可遷移至損傷部位，修復相應組織，是治療性血管新生（therapeutic angiogenesis）的重要研究內容[7-9]。BMSCs來源于骨髓，骨髓環境被認為是典型的低氧環境[10]。然而干細胞/祖細胞的體外研究通常是在常氧（氧體積分數21%）下進行，雖然能夠使干細胞擴增上億倍，但同時卻喪失了其原始特性和自我更新能力[11-12]。體外培養對體內低氧環境的模擬，首先要了解干細胞體內所處環境的氧分壓范圍。
近年研究[13-15]發現，氧是一個潛在的信號分子，能夠影響多種前體細胞的基本特性，低氧在血管生成中起了重要的調節作用。HIF-1是組織在缺氧應激下水平上調，而在常氧條件下迅速水解的一個重要轉錄因子。眾多研究[10, 12-13]顯示，其在干細胞生物學特性的維持、缺血組織血管再生等方面均起到十分重要的調控作用。于是研究者們[16-19]將細胞在不同氧濃度下進行培養，但得出的結論卻存在爭議，這可能與其選擇的氧濃度范圍差異較大和干細胞來源不同有關。
本研究通過極譜法測量正常以及不同缺血時期小鼠后肢腓腸肌和股骨骨髓的氧分壓值，發現在缺血1周時，腓腸肌組織氧分壓值達到最低，此時細胞壞死最為嚴重，HIF-1α蛋白表達水平也最高。隨著缺血進入慢性期，腓腸肌組織氧分壓值有所回升，HIF-1α蛋白表達水平也隨之下調。而缺血狀態下雙側股骨骨髓的氧分壓的變化不明顯，但均較正常股骨骨髓有所升高。
一般認為，在體外細胞培養的氧體積分數低于20%即為低氧，然而在體內，大氣中的氧氣經肺臟氣體交換、進入血液循環再到達組織間隙為細胞所利用，氧濃度已遠遠低于大氣氧濃度[20]。有學者[21]認為，氧體積分數在1%～10%（PO2為7.6～76 mm Hg）為生理性低氧，在< 1%時為病理性低氧。然而不同組織生理狀態下所需氧分壓差異巨大，Dyson等[20]總結了不同物種（人、大鼠、小鼠、狗、豬）不同組織（肌肉、肝臟、腎臟、膀胱）氧分壓的基礎值在12.75～68.25 mm Hg之間，骨髓氧分壓卻少有報道。Harrison等[22]曾于2002年報道正常人髂骨骨髓氧分壓為（54.9±0.98）mm Hg，其數值較本研究高的原因可能是由于采用血氣分析儀測定，在將骨髓抽出過程中可能接觸或混入空氣，而使數值較真實水平高。而本研究直接將測量電極置于活體骨髓，更能夠反映體內氧分壓的真實水平。
本研究采用經典的極譜法，將直徑為0.4 mm的Clark電極置入小鼠股骨骨髓腔內，測量其骨髓氧分壓值，其正常值范圍為（21.55±3.40）mm Hg，相當于（2.84±0.45）%氧體積分數。與后肢不同缺血時間骨髓組織氧分壓進行比較，發現患側和健側骨髓氧分壓較正常血運小鼠均有所升高，但同一缺血時間患側和健側骨髓氧分壓的差異不大。提示小鼠缺血后的修復過程可能由全身骨髓干細胞參與，但仍需進一步研究證實。
本研究測定了不同缺血時間段小鼠患側腓腸肌氧分壓的變化，發現其在缺血1周時達到最低，為（25.54±8.57）mm Hg，相當于（3.36±1.12）%氧體積分數，此時肌肉細胞已經發生了缺血壞死的表現；而肌肉組織的生理組織（正常對照組）氧分壓為（47.78±4.37）mm Hg，相當于（6.29±0.58）%氧體積分數。提示對于骨髓細胞而言是正常的氧分壓水平，但對肌肉而言卻是缺血性的。因此，對于特定物種的特定組織細胞，“生理性”的氧濃度范圍都是不同的。
研究者們[23-25]發現，后肢急性缺血動物模型中HIF-1αmRNA和蛋白表達均上調；但對于慢性缺血患者而言，HIF-1介導的血管生成和組織保護作用卻并不明顯[26]。本研究檢測了不同缺血時期肌肉組織中HIF-1α蛋白的表達，發現在缺血早期（24 h）HIF-1α蛋白表達下調，但缺血1周HIF-1α水平明顯上調，此時肌肉組織的炎癥性改變最為嚴重，肌肉組織氧分壓值亦達到最低。隨著缺血改變進入慢性期，肌肉組織氧分壓有所上升，HIF-1α蛋白表達同時下降，雖然兩者的相關性無統計學意義，缺血組織HIF-1α蛋白的表達水平仍然在一定程度上能夠反映肢體的缺血程度。
綜上，本研究揭示了小鼠后肢肌肉不同缺血時期氧分壓和HIF-1α蛋白表達演變的規律；確定了小鼠股骨骨髓的生理性氧分壓水平，強調不同組織細胞生理狀態的氧分壓的差異。而在體外培養中，相應低氧水平對骨髓源間充質干細胞是否有助于維持其未分化狀態及增殖能力，對間充質干細胞生物學特性有何影響，仍需進一步研究。
