引用本文： 冉江華, 張熙冰, 劉靜, 張升寧, 李來邦, 陳奕明, 高楊, 李望, 李立. 恒河猴肝移植術后急性排斥反應時肝組織中轉化生長因子-β1的表達. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(11): 1384-1390. doi: 10.7507/1007-9424.20140331 復制
肝移植已經成為治療良性終末期肝病的最有效手段，但是，排斥反應仍然是影響移植物壽命的主要因素[1-2]。器官移植術后急性排斥反應時，機體轉化生長因子-β1（TGF-β1）的改變對于早期發現、診斷急性排斥反應有重要的意義，雖然它在急性排斥反應中的機制現仍不清楚，但被認為在一定程度上指導臨床盡早處理發揮著關鍵作用[3-6]。本實驗旨在探討恒河猴肝移植術后急性排斥反應發生時機體TGF-β1的變化。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
供、受體均為健康的恒河猴，共16只，年齡2～5歲，受體均為雄性，體質量7.2～11.5 kg，供體雌雄不限，體質量5.3～8.1 kg。實驗動物均由昆明醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（滇）2009-0004，飼養于該中心動物房中，自由進食、水。供體術前不禁食、水，但控制其食物量；受體術前禁食12 h，禁水6 h，受體術前給予頭孢唑林鈉0.1 g/kg。實驗過程中對動物的處置參照國家科學技術部2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[7]。
1.2 恒河猴原位肝移植模型的建立及分組
采用二袖套法＋膽道支撐管建立恒河猴原位肝移植模型[8-9]。將建立原位肝移植模型成功的恒河猴用隨機數字表法隨機分為實驗組和對照組2組，每組4只。實驗組在肝移植成功后，不給予任何抗排斥處理。對照組在移植過程中給予甲基潑尼松龍250 mg靜脈注射，并且在移植后給予他克莫司抗免疫排斥藥物，劑量為0.1 mg /（kg?d）[10]，分2次給藥。
1.3 標本采集
實驗組和對照組分別在肝移植術后6 h、12 h、24 h和72 h四個時間點在麻醉下取標本，抽取靜脈血3～5 mL，血樣離心（4℃、3 000 r/min、r=5 cm、10 min），取上清液，入-80℃超低溫冰箱保存待測，待標本齊備后，行肝功能、TGF-β1等檢測。腹壁切開一小切口，取肝臟邊緣約0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小肝組織4份（遇在各時點前后30 min內死亡的受體動物，亦取同樣大小的肝組織及等量下腔靜脈血列入該時點樣本），用10%中性甲醛固定，用于蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組織化學檢測。
1.4 肝功能檢測
取-80℃保存待測血清標本行肝功能檢測。全自動生化分析儀，用直接活力測定法測定血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）及血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）的表達變化情況。
1.5 應用HE染色法檢測肝組織病理學改變
將固定于甲醛中的肝組織制成石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察急性排斥反應，并根據目前國際公認的Banff系統評估標準，將急性排斥反應根據排斥活動指數（RAI）評分（總分為9分）分為4級[11-12]：0級（不明確，RAI2～3分）：匯管區三體（肝動脈、門靜脈和膽管）炎性細胞浸潤程度未達到急性排斥的診斷標準；Ⅰ級（輕度，RAI 3～5分）：排斥性炎性細胞浸潤匯管區少數的膽管和血管，炎性細胞數量較少，僅局限在匯管區間隙中；Ⅱ級（中度，RAI 5～7分）：排斥性炎性細胞浸及多數或全部匯管區的膽管和血管；Ⅲ級（重度，RAI 7～9分）：在中度的基礎上，炎性細胞浸潤匯管區周圍，伴有中至重度靜脈炎并擴展到肝實質，引起靜脈周圍肝細胞壞死。
1.6 應用免疫組織化學方法檢測肝組織中TGF-β1蛋白表達
TGF-β1免疫組織化學檢測試劑盒購于美國R & D公司。采用免疫組織化學SP法[13]檢測肝組織中TGF-β1蛋白表達。切片制備完成后，在光鏡下統一觀察染色情況并進行攝片分析。每張切片隨機選取8個視野（×100），輸入計算機圖像分析系統內分析TGF-β1蛋白表達陽性面積，并與視野測試面積相比求出陽性面積的百分率。
1.7 應用Western blot法檢測肝組織中TGF-β1蛋白表達
TGF-β1多肽抗體購自美國Millipore。采用Western blot方法[14]檢測肝組織TGF-β1蛋白表達。利用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6測定目標顯影條帶灰度值，半定量結果以目標條帶灰度值與相應β-actin條帶灰度值比值表示。
1.8 統計學方法
所有數據分析均采用SPSS 17.0統計軟件進行。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 實驗動物數量分析
實驗組和對照組分別建立恒河猴同種異體原位肝移植模型各4只，其中實驗組術后缺失2只，對照組術后缺失1只，主要原因為移植后腹腔出血和呼吸循環功能衰竭所致，缺失恒河猴均及時予以補齊。
2.2 恒河猴肝移植術后肝功能的變化
2組術后ALT、AST和TBIL水平均隨著時間的延長呈上升趨勢，并且同一組內與前一時相比較差異有統計學意義（P＜0.05）。在移植術后6 h和12 h，2組間ALT、AST和TBIL水平比較接近，差異無統計學意義（P＞0.05）；在移植術后24 h和72 h，實驗組ALT、AST和TBIL水平均較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1、2。
表1
肝移植術后不同時相實驗組和對照組血清ALT和AST的變化（U/L，
表2
肝移植術后實驗組和對照組血清TBIL的變化（μmol/L，2.3 恒河猴肝移植術后肝組織病理學改變結果
實驗組和對照組在移植術后不同時相的病理改變結果見圖 1A～1H。移植術后6 h，2組肝組織基本正常，未見排斥反應，見圖 1A、1E。移植術后12 h，實驗組有輕度急性排斥反應，鏡下可見肝小葉結構基本正常，匯管區有中等量以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，其中可見較多的淋巴細胞浸潤，小葉間靜脈內膜水腫明顯增厚，內膜下可見中等量中性粒細胞浸潤，膽管、血管均存在，但膽管上皮未見明顯損傷，Banff評分Ⅰ～Ⅱ級；而對照組可見肝實質內有中等量的中性粒細胞浸潤，匯管區僅見有少量的中性粒細胞浸潤，排斥反應的分級不明確，Banff評分0～Ⅰ級，見圖 1B、1F。移植術后24 h，實驗組有中度至重度急性排斥反應，鏡下可見匯管區大量單個核細胞浸潤，并累及膽管、血管，肝小葉結構消失，伴有局灶性出血、壞死，Banff評分Ⅱ～Ⅲ級；而對照組有輕度急性排斥反應，鏡下可見匯管區出現少量的單核細胞浸潤，但侵入肝實質、膽管和血管的炎性細胞浸潤程度達到輕型診斷標準，Banff評分0～Ⅰ級，見圖 1C、1G。移植術后72 h，實驗組有重度排斥反應，鏡下可見匯管區大量單個核細胞浸潤，并累及膽管、血管，肝小葉結構消失明顯，且伴有明顯的局灶性出血、壞死，Banff評分Ⅲ級的標本達到3個，見圖 1D；而對照組有輕度急性排斥反應，鏡下可見匯管區出現少量的單核細胞浸潤，Banff評分Ⅰ～Ⅱ級，見圖 1H。且該時點2組Banff評分比較，實驗組排斥反應程度重于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 3。
圖1
原位肝移植后肝組織病理學結果（HE????×100）。1A～1D為實驗組；1E～1H為對照組。1A和1E為移植術后6 h；1B和1F為移植術后12 h；1C和1G為移植術后24 h；1D和1H為移植術后72 h????圖 2????原位肝移植后肝組織中TGF-β1蛋白表達的免疫組織化學染色結果（SP????×100）。2A～2D為實驗組，2E～2H為對照組。2A和2E為移植術后6 h，2B和2F為移植術后12 h，2C和2G為移植術后24 h，2D和2H為移植術后72 h
Figure1.
Histopathology results of liver tissues after orthotopic liver transplantation (HE????×100). 1A-1D: Experimental group; 1E-1H: Control group. 1A and 1E: At 6 h after liver transplantation; 1B and 1F: At 12 h after liver transplantation; 1C and 1G: At 24 h after liver transplantation; 1D and 1H: At 72 h after liver transplantation????Figure 2????Immunohistochemistry results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation (SP????×100). 2A-2D: Experimental group; 2E-2H: Control group. 2A and 2E: At 6 h after liver transplantation; 2B and 2F: At 12 h after liver transplantation; 2C and 2G: At 24 h after liver transplantation; 2D and 2H: At 72 h after liver transplantation
表3
肝移植后72 h 2組移植物病理切片的Banff評分比較（例）
Table3.
Comparison of 72 h graft biopsy score of Banff after liver transplantation between two groups(case)
2.4 恒河猴肝移植術后免疫組織化學方法檢測TGF-β1蛋白表達結果
TGF-β1蛋白表達的免疫組織化學染色陽性呈棕黃色定位于細胞漿，見圖 2A～2H。TGF-β1免疫組織化學染色陽性面積百分率見表 4，從表 4可見，移植術后6 h時2組無明顯變化（圖 2A、2E），2組比較差異無統計學意義（P=0.514）；移植術后12 h時2組均升高，實驗組較對照組升高明顯（圖 2B、2F），2組比較差異有統計學意義（P=0.002）；移植術后24 h時2組繼續有所升高，實驗組升高較明顯（圖 2C、2G），2組比較差異有統計學意義（P=0.021）；移植術后72 h時2組繼續有所升高，實驗組仍然較對照組升高明顯（圖 2D、2H），2組比較差異有統計學意義（P=0.034）。
表4
肝移植術后TGF-β1的免疫組織化學染色陽性面積百分率（%，2.5 恒河猴肝移植術后Western blot法檢測TGF-β1蛋白表達結果
TGF-β1蛋白表達的定性結果見圖 3。半定量結果見圖 4，從圖 4可見整體變化趨勢：實驗組和對照組均在6 h即開始隨著時間的延長呈現上調趨勢，而實驗組上調的幅度較對照組大，在6 h、12 h、24 h和72 h時實驗組均分別明顯高于對照組相應時相（P值分別為0.003、0.001、0.001、0.001）。
圖3
原位肝移植后肝組織中TGF-β1蛋白表達的定性結果
Figure3.
Qualitation results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation
圖4
原位肝移植后肝組織中TGF-β1蛋白表達的半定量結果。與對照組相應時相比較，* P＜0.05
Figure4.
Semi-quantitation results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation. Compared with control group at the same time, * P < 0.05
3 討論
急性排斥反應是肝移植術后常見并發癥，也是導致移植肝無功能的主要原因之一，影響受體的長期生存[15-17]。
TGF-β是一組以多肽形式存在的細胞因子。機體的多種細胞均可分泌非活性狀態的TGF-β，如血小板、T細胞、單核細胞、B細胞和成骨細胞，其中血小板中的TGF-β含量最高，T細胞或B細胞被激活后產生TGF-β的水平比靜止期細胞明顯高。TGF-β參與機體免疫反應的多個環節，并且對機體免疫功能起負向調節的作用，可抑制T、B細胞的活化和增殖，同時還可以抑制自然殺傷細胞和巨噬細胞的功能等，而且TGF-β通過下調白細胞介素-1受體的表達而阻斷白細胞介素-1的作用[18-20]。TGF-β在炎癥過程中也起著重要作用[18-22]。在炎癥早期，富含TGF-β的血小板通過在損傷部位脫顆粒釋放TGF-β進入損傷周圍組織，此時，無活性的TGF-β與局部暴露的細胞外基質層結合后被激活，有活性的TGF-β對白細胞、單核細胞、T細胞等具有很強的化學趨化作用，這樣，炎性細胞聚集導致組織損傷處大量炎癥介質分泌，從而引起局部的一系列炎癥過程。TGF-β屬于一個結構相關的調節蛋白超家族，哺乳動物有3個TGF-β亞型表達，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 [23-24]。其中TGF-β1是一種多效性、多功能的細胞因子，參與免疫排斥反應的重要環節，它與同種異體移植免疫排斥反應密切相關，已成為器官移植及相關領域的一個研究熱點[4, 25]。在本研究中，對實驗組和對照組中不同時點的肝組織中TGF-β1蛋白定量以及免疫組織化學的細胞定位和微觀形態學進行了檢測，肝組織中TGF-β1蛋白定量檢測則反映了局部的免疫變化，而肝組織的TGF-β1免疫組織化學結果則是揭示了TGF-β1的細胞定位和微觀形態學的改變；本實驗結果的整體變化趨勢：實驗組和對照組TGF-β1均在6 h即開始隨著時間的延長呈現上調趨勢，而實驗組上調的幅度相對對照組大，且在24 h和72 h時間點差異有統計學意義（P＜0.05）。其原因可能是，急性排斥反應發生時，肝組織受到炎性細胞的浸潤，引起TGF-β1在局部聚集，從而對組織細胞起到免疫保護作用，但是TGF-β1可能在局部被激活，從而可以趨化炎性細胞的聚集，引起更多的炎性細胞的浸潤。
肝移植術后ALT、AST和TBIL水平是臨床監測早期移植肝功能的常用指標，在臨床用藥和治療中起到非常重要的指導作用。本研究結果顯示，實驗組和對照組移植后24 h、72 h時ALT、AST和TBIL指標均明顯高于對照組（P＜0.05）。
目前，確診急性排斥反應的金標準依然是病理學組織活檢。本研究結果顯示，實驗組在術后72 h時肝組織的急性排斥反應病理學表現明顯重于對照組，其Banff分級明顯高于對照組（P＜0.05）。
從本研究實驗結果初步得出，恒河猴肝移植急性排斥反應早期TGF-β表達明顯上調，并且早于同時點肝功能、病理組織學的改變，可以為預測急性排斥反應發生后的早期診斷提供理論依據。但是，肝移植術后急性排斥反應是一個多因素調控、多環節參與且隨移植術后時間的延長而發生變化的復雜過程，不能從單一指標來判斷術后是否發生了排斥反應及排斥反應的嚴重程度，需要綜合各項指標及臨床表現來判斷，從而為臨床治療提供一定的理論依據。
肝移植已經成為治療良性終末期肝病的最有效手段，但是，排斥反應仍然是影響移植物壽命的主要因素[1-2]。器官移植術后急性排斥反應時，機體轉化生長因子-β1（TGF-β1）的改變對于早期發現、診斷急性排斥反應有重要的意義，雖然它在急性排斥反應中的機制現仍不清楚，但被認為在一定程度上指導臨床盡早處理發揮著關鍵作用[3-6]。本實驗旨在探討恒河猴肝移植術后急性排斥反應發生時機體TGF-β1的變化。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
供、受體均為健康的恒河猴，共16只，年齡2～5歲，受體均為雄性，體質量7.2～11.5 kg，供體雌雄不限，體質量5.3～8.1 kg。實驗動物均由昆明醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（滇）2009-0004，飼養于該中心動物房中，自由進食、水。供體術前不禁食、水，但控制其食物量；受體術前禁食12 h，禁水6 h，受體術前給予頭孢唑林鈉0.1 g/kg。實驗過程中對動物的處置參照國家科學技術部2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[7]。
1.2 恒河猴原位肝移植模型的建立及分組
采用二袖套法＋膽道支撐管建立恒河猴原位肝移植模型[8-9]。將建立原位肝移植模型成功的恒河猴用隨機數字表法隨機分為實驗組和對照組2組，每組4只。實驗組在肝移植成功后，不給予任何抗排斥處理。對照組在移植過程中給予甲基潑尼松龍250 mg靜脈注射，并且在移植后給予他克莫司抗免疫排斥藥物，劑量為0.1 mg /（kg?d）[10]，分2次給藥。
1.3 標本采集
實驗組和對照組分別在肝移植術后6 h、12 h、24 h和72 h四個時間點在麻醉下取標本，抽取靜脈血3～5 mL，血樣離心（4℃、3 000 r/min、r=5 cm、10 min），取上清液，入-80℃超低溫冰箱保存待測，待標本齊備后，行肝功能、TGF-β1等檢測。腹壁切開一小切口，取肝臟邊緣約0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小肝組織4份（遇在各時點前后30 min內死亡的受體動物，亦取同樣大小的肝組織及等量下腔靜脈血列入該時點樣本），用10%中性甲醛固定，用于蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組織化學檢測。
1.4 肝功能檢測
取-80℃保存待測血清標本行肝功能檢測。全自動生化分析儀，用直接活力測定法測定血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）及血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）的表達變化情況。
1.5 應用HE染色法檢測肝組織病理學改變
將固定于甲醛中的肝組織制成石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察急性排斥反應，并根據目前國際公認的Banff系統評估標準，將急性排斥反應根據排斥活動指數（RAI）評分（總分為9分）分為4級[11-12]：0級（不明確，RAI2～3分）：匯管區三體（肝動脈、門靜脈和膽管）炎性細胞浸潤程度未達到急性排斥的診斷標準；Ⅰ級（輕度，RAI 3～5分）：排斥性炎性細胞浸潤匯管區少數的膽管和血管，炎性細胞數量較少，僅局限在匯管區間隙中；Ⅱ級（中度，RAI 5～7分）：排斥性炎性細胞浸及多數或全部匯管區的膽管和血管；Ⅲ級（重度，RAI 7～9分）：在中度的基礎上，炎性細胞浸潤匯管區周圍，伴有中至重度靜脈炎并擴展到肝實質，引起靜脈周圍肝細胞壞死。
1.6 應用免疫組織化學方法檢測肝組織中TGF-β1蛋白表達
TGF-β1免疫組織化學檢測試劑盒購于美國R & D公司。采用免疫組織化學SP法[13]檢測肝組織中TGF-β1蛋白表達。切片制備完成后，在光鏡下統一觀察染色情況并進行攝片分析。每張切片隨機選取8個視野（×100），輸入計算機圖像分析系統內分析TGF-β1蛋白表達陽性面積，并與視野測試面積相比求出陽性面積的百分率。
1.7 應用Western blot法檢測肝組織中TGF-β1蛋白表達
TGF-β1多肽抗體購自美國Millipore。采用Western blot方法[14]檢測肝組織TGF-β1蛋白表達。利用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6測定目標顯影條帶灰度值，半定量結果以目標條帶灰度值與相應β-actin條帶灰度值比值表示。
1.8 統計學方法
所有數據分析均采用SPSS 17.0統計軟件進行。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 實驗動物數量分析
實驗組和對照組分別建立恒河猴同種異體原位肝移植模型各4只，其中實驗組術后缺失2只，對照組術后缺失1只，主要原因為移植后腹腔出血和呼吸循環功能衰竭所致，缺失恒河猴均及時予以補齊。
2.2 恒河猴肝移植術后肝功能的變化
2組術后ALT、AST和TBIL水平均隨著時間的延長呈上升趨勢，并且同一組內與前一時相比較差異有統計學意義（P＜0.05）。在移植術后6 h和12 h，2組間ALT、AST和TBIL水平比較接近，差異無統計學意義（P＞0.05）；在移植術后24 h和72 h，實驗組ALT、AST和TBIL水平均較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1、2。
表1
肝移植術后不同時相實驗組和對照組血清ALT和AST的變化（U/L，
表2
肝移植術后實驗組和對照組血清TBIL的變化（μmol/L，2.3 恒河猴肝移植術后肝組織病理學改變結果
實驗組和對照組在移植術后不同時相的病理改變結果見圖 1A～1H。移植術后6 h，2組肝組織基本正常，未見排斥反應，見圖 1A、1E。移植術后12 h，實驗組有輕度急性排斥反應，鏡下可見肝小葉結構基本正常，匯管區有中等量以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，其中可見較多的淋巴細胞浸潤，小葉間靜脈內膜水腫明顯增厚，內膜下可見中等量中性粒細胞浸潤，膽管、血管均存在，但膽管上皮未見明顯損傷，Banff評分Ⅰ～Ⅱ級；而對照組可見肝實質內有中等量的中性粒細胞浸潤，匯管區僅見有少量的中性粒細胞浸潤，排斥反應的分級不明確，Banff評分0～Ⅰ級，見圖 1B、1F。移植術后24 h，實驗組有中度至重度急性排斥反應，鏡下可見匯管區大量單個核細胞浸潤，并累及膽管、血管，肝小葉結構消失，伴有局灶性出血、壞死，Banff評分Ⅱ～Ⅲ級；而對照組有輕度急性排斥反應，鏡下可見匯管區出現少量的單核細胞浸潤，但侵入肝實質、膽管和血管的炎性細胞浸潤程度達到輕型診斷標準，Banff評分0～Ⅰ級，見圖 1C、1G。移植術后72 h，實驗組有重度排斥反應，鏡下可見匯管區大量單個核細胞浸潤，并累及膽管、血管，肝小葉結構消失明顯，且伴有明顯的局灶性出血、壞死，Banff評分Ⅲ級的標本達到3個，見圖 1D；而對照組有輕度急性排斥反應，鏡下可見匯管區出現少量的單核細胞浸潤，Banff評分Ⅰ～Ⅱ級，見圖 1H。且該時點2組Banff評分比較，實驗組排斥反應程度重于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 3。
圖1
原位肝移植后肝組織病理學結果（HE????×100）。1A～1D為實驗組；1E～1H為對照組。1A和1E為移植術后6 h；1B和1F為移植術后12 h；1C和1G為移植術后24 h；1D和1H為移植術后72 h????圖 2????原位肝移植后肝組織中TGF-β1蛋白表達的免疫組織化學染色結果（SP????×100）。2A～2D為實驗組，2E～2H為對照組。2A和2E為移植術后6 h，2B和2F為移植術后12 h，2C和2G為移植術后24 h，2D和2H為移植術后72 h
Figure1.
Histopathology results of liver tissues after orthotopic liver transplantation (HE????×100). 1A-1D: Experimental group; 1E-1H: Control group. 1A and 1E: At 6 h after liver transplantation; 1B and 1F: At 12 h after liver transplantation; 1C and 1G: At 24 h after liver transplantation; 1D and 1H: At 72 h after liver transplantation????Figure 2????Immunohistochemistry results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation (SP????×100). 2A-2D: Experimental group; 2E-2H: Control group. 2A and 2E: At 6 h after liver transplantation; 2B and 2F: At 12 h after liver transplantation; 2C and 2G: At 24 h after liver transplantation; 2D and 2H: At 72 h after liver transplantation
表3
肝移植后72 h 2組移植物病理切片的Banff評分比較（例）
Table3.
Comparison of 72 h graft biopsy score of Banff after liver transplantation between two groups(case)
2.4 恒河猴肝移植術后免疫組織化學方法檢測TGF-β1蛋白表達結果
TGF-β1蛋白表達的免疫組織化學染色陽性呈棕黃色定位于細胞漿，見圖 2A～2H。TGF-β1免疫組織化學染色陽性面積百分率見表 4，從表 4可見，移植術后6 h時2組無明顯變化（圖 2A、2E），2組比較差異無統計學意義（P=0.514）；移植術后12 h時2組均升高，實驗組較對照組升高明顯（圖 2B、2F），2組比較差異有統計學意義（P=0.002）；移植術后24 h時2組繼續有所升高，實驗組升高較明顯（圖 2C、2G），2組比較差異有統計學意義（P=0.021）；移植術后72 h時2組繼續有所升高，實驗組仍然較對照組升高明顯（圖 2D、2H），2組比較差異有統計學意義（P=0.034）。
表4
肝移植術后TGF-β1的免疫組織化學染色陽性面積百分率（%，2.5 恒河猴肝移植術后Western blot法檢測TGF-β1蛋白表達結果
TGF-β1蛋白表達的定性結果見圖 3。半定量結果見圖 4，從圖 4可見整體變化趨勢：實驗組和對照組均在6 h即開始隨著時間的延長呈現上調趨勢，而實驗組上調的幅度較對照組大，在6 h、12 h、24 h和72 h時實驗組均分別明顯高于對照組相應時相（P值分別為0.003、0.001、0.001、0.001）。
圖3
原位肝移植后肝組織中TGF-β1蛋白表達的定性結果
Figure3.
Qualitation results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation
圖4
原位肝移植后肝組織中TGF-β1蛋白表達的半定量結果。與對照組相應時相比較，* P＜0.05
Figure4.
Semi-quantitation results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation. Compared with control group at the same time, * P < 0.05
3 討論
急性排斥反應是肝移植術后常見并發癥，也是導致移植肝無功能的主要原因之一，影響受體的長期生存[15-17]。
TGF-β是一組以多肽形式存在的細胞因子。機體的多種細胞均可分泌非活性狀態的TGF-β，如血小板、T細胞、單核細胞、B細胞和成骨細胞，其中血小板中的TGF-β含量最高，T細胞或B細胞被激活后產生TGF-β的水平比靜止期細胞明顯高。TGF-β參與機體免疫反應的多個環節，并且對機體免疫功能起負向調節的作用，可抑制T、B細胞的活化和增殖，同時還可以抑制自然殺傷細胞和巨噬細胞的功能等，而且TGF-β通過下調白細胞介素-1受體的表達而阻斷白細胞介素-1的作用[18-20]。TGF-β在炎癥過程中也起著重要作用[18-22]。在炎癥早期，富含TGF-β的血小板通過在損傷部位脫顆粒釋放TGF-β進入損傷周圍組織，此時，無活性的TGF-β與局部暴露的細胞外基質層結合后被激活，有活性的TGF-β對白細胞、單核細胞、T細胞等具有很強的化學趨化作用，這樣，炎性細胞聚集導致組織損傷處大量炎癥介質分泌，從而引起局部的一系列炎癥過程。TGF-β屬于一個結構相關的調節蛋白超家族，哺乳動物有3個TGF-β亞型表達，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 [23-24]。其中TGF-β1是一種多效性、多功能的細胞因子，參與免疫排斥反應的重要環節，它與同種異體移植免疫排斥反應密切相關，已成為器官移植及相關領域的一個研究熱點[4, 25]。在本研究中，對實驗組和對照組中不同時點的肝組織中TGF-β1蛋白定量以及免疫組織化學的細胞定位和微觀形態學進行了檢測，肝組織中TGF-β1蛋白定量檢測則反映了局部的免疫變化，而肝組織的TGF-β1免疫組織化學結果則是揭示了TGF-β1的細胞定位和微觀形態學的改變；本實驗結果的整體變化趨勢：實驗組和對照組TGF-β1均在6 h即開始隨著時間的延長呈現上調趨勢，而實驗組上調的幅度相對對照組大，且在24 h和72 h時間點差異有統計學意義（P＜0.05）。其原因可能是，急性排斥反應發生時，肝組織受到炎性細胞的浸潤，引起TGF-β1在局部聚集，從而對組織細胞起到免疫保護作用，但是TGF-β1可能在局部被激活，從而可以趨化炎性細胞的聚集，引起更多的炎性細胞的浸潤。
肝移植術后ALT、AST和TBIL水平是臨床監測早期移植肝功能的常用指標，在臨床用藥和治療中起到非常重要的指導作用。本研究結果顯示，實驗組和對照組移植后24 h、72 h時ALT、AST和TBIL指標均明顯高于對照組（P＜0.05）。
目前，確診急性排斥反應的金標準依然是病理學組織活檢。本研究結果顯示，實驗組在術后72 h時肝組織的急性排斥反應病理學表現明顯重于對照組，其Banff分級明顯高于對照組（P＜0.05）。
從本研究實驗結果初步得出，恒河猴肝移植急性排斥反應早期TGF-β表達明顯上調，并且早于同時點肝功能、病理組織學的改變，可以為預測急性排斥反應發生后的早期診斷提供理論依據。但是，肝移植術后急性排斥反應是一個多因素調控、多環節參與且隨移植術后時間的延長而發生變化的復雜過程，不能從單一指標來判斷術后是否發生了排斥反應及排斥反應的嚴重程度，需要綜合各項指標及臨床表現來判斷，從而為臨床治療提供一定的理論依據。
