引用本文： 李之令, 張東, 劉江偉, 王皓, 高婷, 盧開柏, 趙紅艷. 姜黃素聯合紅景天對大鼠重癥急性胰腺炎相關性腎損傷的保護作用及機制. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(11): 1377-1383. doi: 10.7507/1007-9424.20140330 復制
重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）常可導致腎臟、心血管、肝、肺等機體重要器官的損傷，且其嚴重程度常與腎臟的損傷程度呈正相關[1]。在SAP相關性腎損傷中，炎癥反應起重要作用[2]。誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是炎癥反應中重要的誘導酶，在SAP相關性腎損傷中起重要的損害作用[3]。姜黃是我國一種傳統中藥，早在《唐本草》中就有記載，很早就應用于對急性胰腺炎的防治；紅景天也是我國的一種傳統中藥，具有抗缺氧[4]、抗菌、抗氧化[5]、提高機體免疫力等作用。本研究的目的是觀察姜黃素聯合紅景天對SAP相關性腎損傷的腎組織中iNOS表達以及細胞因子白介素（IL）-1β、IL-6和IL-10的影響，探討姜黃素聯合紅景天對SAP相關性腎損傷是否有協同治療作用及其保護機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑和儀器
1.1.1 實驗動物
8～10周齡SD大鼠，24只，SPF級，雌雄不限，體質量（310±20）g，購自新疆醫科大學實驗動物中心，室溫（21±1）℃，自由進食水。
1.1.2 主要試劑
3%戊巴比妥鈉，武漢人福科技；姜黃素，上海生工生物工程技術服務有限公司；紅景天注射液，蘭州軍區烏魯木齊總醫院藥劑科；生理鹽水，四川科倫醫藥；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，南京建成生物工程研究所；IL-1β、IL-6和IL-10試劑盒，上海依科賽生物制品有限公司；原位末端標記（TUNEL）試劑盒，Roche，USA；DAB顯色劑，北京中山金橋生物技術有限公司；Trizol，北京康為世紀生物技術有限公司；氯仿和異丙醇，天津福晨化學試劑廠；無水乙醇，天津市化學三廠；反轉錄試劑盒，Invtrogen，USA；SYBR Green Select Master Mix，Life Technologies Corporation，USA；5×TBE，上海生工生物工程技術服務有限公司；瓊脂糖，Invitrogen，USA；核酸染料、Marker、Ladder，北京天根生物有限公司。iNOS PCR上游引物為5′-GTGCTAATGCGGAAGGTCATG-3′，下游引物為3′-GCTTCCGACTTTCCTGTCTCAGTA-5′；β-actin上游引物為5′-GCCAGGATAGAGCCACCAATC-3′，下游引物為3′-ACTGCCCTGGCTCCTAGCA-5′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
1.1.3 主要儀器
全自動生化分析儀，邁瑞公司；奧林巴斯光學顯微鏡，日本；電泳儀，北京六一儀器廠；分光光度計，Bio-Rad，USA；PCR基因擴增儀，Bio-Rad，Singapore；RT-PCR儀，Bio-Rad，USA。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組
將24只SD大鼠按窩別及體質量按隨機數字表法隨機分為SAP相關性腎損傷組（簡稱“SAP組”）、姜黃素治療組（簡稱“姜黃素組”）、姜黃素聯合紅景天治療組（簡稱“姜黃素＋紅景天組”），每組8只。
1.2.2 術前準備
術前12 h禁食，自由飲水。3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后固定、備皮、碘伏消毒手術區后常規鋪巾。SAP組大鼠在建模前3 h予以1.5 mL的生理鹽水腹腔注射，姜黃素組大鼠在建模前3 h予以200 mg/kg的1.5 mL姜黃素稀釋液灌胃，姜黃素＋紅景天組大鼠在建模前3 h予以200 mg/kg的1.5 mL姜黃素稀釋液灌胃同時6 g/kg的紅景天注射液腹腔注射。
1.2.3 SAP模型制備
取上腹部正中切口，長約3 cm，逐層切開入腹，在胃大彎側找到并提出胰腺，將腸管推向下腹部并予以無菌鹽水紗布覆蓋保護，胃向上翻，充分暴露胰腺。充分游離胰腺至胰頭部，以雙層無菌鹽水紗布包繞，無創血管鉗夾閉胰頭部，以剛好夾閉血管及胰管避免損傷胰腺組織為宜。無菌鹽水紗布覆蓋手術區，3 h后松開無創血管鉗，可見胰腺組織顏色逐漸恢復，取出紗布后逐層關腹，造模完成。
1.2.4 術后處理
術后放回飼養箱，4 h后可進食水。建模完成后每隔6 h，SAP組予以6 g/kg的生理鹽水腹腔注射，而姜黃素組予以200 mg/kg的1.5 mL姜黃素稀釋液灌胃，姜黃素＋紅景天組予以200 mg/kg的1.5 mL姜黃素稀釋液灌胃同時6 g/kg的紅景天注射液腹腔注射。
1.2.5 標本的采集
各組于建模完成后18 h麻醉大鼠，常規消毒、鋪巾、拆線，進入腹腔觀察腹腔內各臟器的大體情況后尋找出下腔靜脈，用促凝管各抽取3 mL靜脈血液，一只促凝管內靜脈血液行血淀粉酶、肌酐（creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）檢測；另一只促凝管內靜脈血液經3 000 r/min（r=13.5 cm）離心10 min，小心吸取上層血清保存于-70℃備測IL-1β、IL-6和IL-10含量。取左腎一大小約1 cm×1 cm×1 cm的組織用10%甲醛PBS液固定后石蠟包埋，切片后行蘇木素-伊紅（HE）染色，進行組織形態學觀察。取右腎用無菌鹽水紗布擦凈血跡后放入凍存管中密封編號后液氮冷凍保存備用。
1.3 檢測指標
1.3.1 血清淀粉酶、Cr及BUN的檢測
取已經離心好的血清嚴格按操作規范及流程進行上述指標的檢測，檢測前生化分析儀均進行校準，保證質控數據均在質控范圍內。
1.3.2 腎組織中SOD活性的測定
取制備好的10%的腎勻漿組織液采用羥胺法測定，并嚴格按SOD檢測試劑盒說明書上的說明步驟及所加試劑和劑量操作完成。
1.3.3 血清IL-1β、IL-6及IL-10含量的測定
采用雙抗體夾心ELISA法檢測，具體步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。通過繪制標準曲線得出樣品中相應細胞因子含量，該法檢測IL-1β、IL-6及IL-10靈敏度為15 pg/mL。
1.3.4 細胞凋亡的檢測
組織切片固定在防脫片上后采用TUNEL法標記凋亡細胞，DAB顯色，在光鏡下分析結果。每張切片觀察5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，計算每100個細胞中陽性細胞數，即凋亡指數。
1.3.5 RT-PCR檢測大鼠腎組織中iNOS mRNA表達
從凍存管中取0.1 g腎組織放入加有液氮的研缽中，不斷加入液氮轉動杵子直至腎組織研磨成粉末狀后加入1 mL Trizol，按說明書提取腎RNA。通過分光光度計測定其RNA的濃度，根據260 nm/280 nm處的比值測定其純度，滿意后取樣品的RNA 5μg進行反轉錄合成cDNA。再取待測樣品的cDNA按說明書配制成總體積為20μL的RT-PCR反應體系。β-actin反應條件：95℃3 min，95℃10 s，60℃30 s，40循環；65℃10 s，61循環。iNOS反應條件：95℃3 min，95℃10 s，56℃30 s，40循環；65℃10 s，61循環。各PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳回收后稀釋8個濃度梯度制作DNA標準曲線，各樣本的基因濃度結果直接由機器生成。每個樣本的iNOS的濃度與其β-actin基因濃度的比值即為iNOS mRNA的相對表達量。
1.4 統計學方法
應用SPSS 17.0軟件包進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 3組大鼠胰腺大體及病理組織學情況
SAP組在造模完成后大體可見胰腺組織輕度腫脹，18 h時見腹腔有血性腹水，胰腺出現出血、壞死及皂化斑形成。姜黃素組和姜黃素＋紅景天組較SAP組胰腺損傷減輕，胰腺出血壞死不如SAP組明顯，有少量的皂化斑出現，腹腔血性腹水也較SAP組減少。病理切片見SAP組胰腺充血腫脹，胰腺間質和小葉大量炎性細胞浸潤，部分胰腺組織呈彌漫性出血及壞死，胰周脂肪壞死，部分腺泡細胞溶解，只剩下解體細胞殘留。姜黃素組和姜黃素＋紅景天組見胰腺仍充血腫脹，但間質只有少量的炎性細胞浸潤，血管充血不如SAP組明顯，僅有片狀出血與壞死，而且姜黃素＋紅景天組又較姜黃素組減輕。
2.2 3組大鼠腎臟大體觀及病理組織學情況
各組在造模完成時腎臟體積和外觀無明顯變化。18 h時腎臟病理切片見SAP組腎小管上皮細胞水腫、個別細胞壞死脫落進入管腔，管腔變窄、腎小球中度淤血；姜黃素組和姜黃素＋紅景天組病理切片見腎小管上皮細胞水腫不如SAP組明顯，管腔輕度變窄，腎小球輕度淤血，姜黃素＋紅景天組又較姜黃素組病理改變減輕。見圖 1。
圖1
3組大鼠腎組織病理組織學改變（HE染色????×400）。1A：SAP組；1B：姜黃素組；1C：姜黃素＋紅景天組????圖 2????3組大鼠腎組織細胞凋亡情況（TUNEL????×400）。2A：SAP組；2B：姜黃素組；2C：姜黃素＋紅景天組
Figure1.
Pathological changes of renal tissues among three groups rats (HE staining????×400). 1A: SAP group; 1B: Curcumin group; 1C: Curcumin combined with Rhodiola group????Figure 2????Cell apoptosis of renal tissues among three groups rats (TUNEL????×400). 2A: SAP group; 2B: Curcumin group; 2C: Curcumin combined with Rhodiola group
2.3 3組大鼠腎臟組織細胞凋亡情況
SAP組見大量凋亡細胞，沿腎小管分布為主，腎小球可見少許凋亡細胞；姜黃素組和姜黃素＋紅景天組見腎小管凋亡細胞明顯減少，腎小球偶見凋亡細胞。見圖 2。姜黃素組和姜黃素＋紅景天組大鼠腎組織的凋亡指數分別為（25.4±5.4）%和（17.2±4.4）%，均分別明顯低于SAP組的（42.0±7.4）%，差異均有統計學意義（P＜0.05），并且姜黃素＋紅景天組明顯低于姜黃素組，差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.4 3組大鼠血清淀粉酶、Cr、BUN及SOD檢測結果
姜黃素組和姜黃素＋紅景天組大鼠血清淀粉酶、Cr及BUN含量均明顯低于SAP組（P＜0.05），SOD活性明顯高于SAP組（P＜0.05）；而姜黃素＋紅景天組大鼠血清淀粉酶、Cr及BUN含量均明顯低于姜黃素組（P＜0.05），SOD活性明顯高于姜黃素組（P＜0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠血清淀粉酶、Cr、BUN及SOD檢測結果比較（2.5 3組大鼠血清中細胞因子IL-1β、IL-6及IL-10含量的檢測結果
姜黃素組和姜黃素＋紅景天組大鼠血清中IL-1β和IL-6含量均明顯低于SAP組（P＜0.05），IL-10的含量明顯高于SAP組（P＜0.05）；而姜黃素＋紅景天組IL-1β和IL-6含量又明顯低于姜黃素組（P＜0.05），IL-10的含量又明顯高于姜黃素組（P＜0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠血清中細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10含量的比較（pg/mL，2.6 3組大鼠腎組織中iNOS mRNA的相對表達量
姜黃素組和姜黃素＋紅景天組腎組織中iNOS mRNA相對表達量明顯低于SAP組（P＜0.05），而姜黃素＋紅景天組又明顯低于姜黃素組（P＜0.05）。見圖 3。
圖3
各組大鼠的腎組織中iNOS mRNA相對表達量結果。與SAP組比較，* P＜0.05；與姜黃素組比較，△P＜0.05
Figure3.
Relative expression of iNOS mRNA of renal tissues in each group rats. Compared with SAP, * P < 0.05; Compared with Curcumin group, △P < 0.05
3 討論
SAP相關性腎損傷是由于機體發生SAP時所釋放出來的胰蛋白酶、缺氧、氧自由基、細菌感染、機體的免疫平衡失調等綜合因素的共同作用下所導致損傷的結果。
在SAP相關性腎損傷中，由于SAP所釋放出來的多種損傷因子促進SAP腎組織中的iNOS mRNA表達明顯升高，NO過度生成與呼吸鏈復合體Ⅲ所釋放的超氧化物結合形成過氧化亞硝酸鹽，造成線粒體損傷[7]；而且局部過量的NO與氧自由基相互作用后對腎組織細胞起直接毒性作用[8]。iNOS為一種機體內重要的促炎性酶，常表達于多種細胞，是機體內NO生成的主要限速酶[6]，NO產生量的多少主要受到NOS的調控，iNOS的激活可產生大量的NO。iNOS通常在細菌脂多糖、細胞因子、內毒素等誘導因素下激活。姜黃素和紅景天具有很好的抗菌作用[9-11]，因此姜黃素和紅景天可以抑制機體內的異常細菌產生脂多糖和內毒素來避免刺激iNOS的激活。在本研究中，姜黃素組和姜黃素＋紅景天組中iNOS mRNA表達均明顯下降（P＜0.05），但姜黃素＋紅景天組iNOS mRNA的表達量下降更明顯，故推測姜黃素聯合紅景天對SAP相關性腎損傷的治療作用有協同效應，姜黃素和紅景天可能通過下調iNOS mRNA的表達來減少機體產生大量的NO，抑制大量NO的生成對腎細胞的破壞作用，所以在聯合干預組中，我們可以看見腎的細胞凋亡數量也明顯少于SAP組和單純姜黃素治療組。
當SAP發生時，機體大量的內毒素及促炎性因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等細胞因子）的產生，機體的單核巨噬細胞釋放，刺激粒細胞的活化，粒細胞與內皮細胞的黏附，刺激吞噬細胞功能的激活，釋放活性自由基以及蛋白酶和水解酶。大量炎性介質的活化和氧自由基產生以及溶酶體對細胞膜造成損傷；而且大量活化了的炎性細胞黏附在腎血管內皮，導致腎毛細血管嚴重受損。此時機體還伴有血小板活化因子、血栓素A2的促凝物質的釋放，血液黏度的增加，促進微循環血栓的形成，加之機體的低血容量造成腎血容量灌注不足，進一步加重腎損傷[12]。在SAP的發生和發展中存在著一個免疫過激和免疫抑制相互并存的病理過程[13]，隨著病程的進展和多種刺激因素的共同作用，抗炎性因子IL-10表達量不斷升高，其升高不但可以抑制炎性因子的表達，還可以誘導合成促炎性因子拮抗劑來發揮抵抗作用[14]。姜黃素和紅景天可以通過抑制促炎性因子的表達以及促進抗炎性因子的表達，調節機體的免疫平衡[15-17]，對機體的炎性損傷起到很好的保護作用。在本研究中，在姜黃素聯合紅景天治療組中，促炎性細胞因子IL-1、IL-6的表達明顯下降，而抑炎癥因子IL-10的表達明顯升高（P＜0.05）。
當SAP發生時，胰蛋白酶激活激肽釋放酶-激肽系統的產物具有強烈的腎毒性[18]。大量活化的胰蛋白酶可以將前彈力酶、羧基肽酶原、非活性型磷脂酶A2激活釋放進入血液，其中磷脂酶A2使細胞膜的磷脂和卵磷脂分解。異常的脂類代謝產物如游離脂肪酸、酰基肉堿、溶血磷脂等都是細胞膜活性因子，可以破壞腎細胞膜，游離脂肪酸還能使線粒體的氧化磷酸化脫偶聯，阻止細胞膜上鈉泵的工作，使細胞內外不能維持有效的電位差。胰蛋白溶解酶可以在降解血漿蛋白的過程中釋放多肽，導致腎小球通透性增加，繼發腎小管及間質的損害。高濃度的胰蛋白酶還可以使機體出現高凝狀態，微小血栓的出現進一步加重了腎功能的損害。在本研究中，姜黃素組和姜黃素＋紅景天組血液中血淀粉酶值明顯低于SAP組（P＜0.05），胰腺壞死形成的皂化斑及病理切片中胰腺壞死程度也較SAP組減輕，提示紅景天和姜黃素還可能通過抑制過量胰蛋白酶原激活，減輕胰蛋白酶在自身組織內激活對胰腺組織的破壞作用。姜黃素＋紅景天組中腎臟的病理損傷程度最輕，也很好地證實了姜黃素和紅景天具有協同效應，能通過抑制過量胰蛋白酶原激活對腎臟起到很好的保護作用。
在SAP腎損傷中，氧自由基是腎損傷的重要因素之一。SOD具有很好清除機體內氧自由基的作用，因而對腎細胞起到很好的保護作用。姜黃素還含有一種熱穩定蛋白-抗氧化蛋白（TAP）[19]，能通過清除機體內的氧自由基而發揮抗氧化作用。以前很多文獻[20-23]也證實，紅景天具有很好的抗氧化作用，其機制是紅景天可以一定程度上通過提高腎細胞內的還原性物質量，減少細胞內脂質過氧化產物的產生來達到對腎損傷的保護作用。由于紅景天中含有的Cu-Zn-SOD與Mn-SOD是很好的氧自由基清除劑[24]，能提高細胞內SOD的活性，清除細胞內部分氧自由基，細胞內氧自由的量相應減少，腎臟受到氧自由基的損傷減輕。還有研究[20]提示，紅景天中的黃酮具有更強的抗氧化能力，對自由基的清除率大于50%。在本研究中，姜黃素＋紅景天組的SOD活性明顯高于SAP組（P＜0.05）和單純姜黃素組（P＜0.05），提示姜黃素和紅景天均可以通過清除細胞內部分氧自由基來達到對腎臟的保護作用。
當腎臟功能受到損害時，可以引起機體內大量的水鈉潴留以及BUN、Cr等有害物質不能通過尿液排出體外，而且隨著血清Cr明顯升高，其腎臟功能下降，病情迅速惡化，可能發展為急性腎功能衰竭[25]。姜黃素和紅景天可以通過抑制iNOS的表達量、提高腎臟中SOD的活性、清除部分氧自由基等作用來維護腎臟的正常功能，使機體內的代謝產物Cr、BUN可以順利地排出體外，避免對腎臟功能的進一步損害。在本研究中，姜黃素＋紅景天組的腎臟功能表現得更好，BUN、Cr比單純姜黃素組下降更明顯（P＜0.05），故我們推測，姜黃素聯合紅景天治療SAP時，二者對腎臟的抗氧化、抗缺氧作用有協同效應。
總之，姜黃素與紅景天主要通過抑制促炎性因子IL-1、IL-6的表達，促進抗炎性因子IL-10表達，下調iNOS mRNA表達，減少氧自由基的生成以及溶酶體對細胞膜的損害，抑制胰蛋白激活肽系統的激活，保護完整的細胞結構能，維持正常的腎臟功能，對腎臟起到很好的保護作用。在本研究中我們看到，姜黃素聯合紅景天在治療SAP相關性腎損傷的大鼠模型中取得了很好的實驗結果，但姜黃素聯合紅景天在SAP相關性腎損傷治療的應用研究還很少，關于姜黃素和紅景天在臨床應用的劑量等問題需要我們進行更多的研究。
重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）常可導致腎臟、心血管、肝、肺等機體重要器官的損傷，且其嚴重程度常與腎臟的損傷程度呈正相關[1]。在SAP相關性腎損傷中，炎癥反應起重要作用[2]。誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是炎癥反應中重要的誘導酶，在SAP相關性腎損傷中起重要的損害作用[3]。姜黃是我國一種傳統中藥，早在《唐本草》中就有記載，很早就應用于對急性胰腺炎的防治；紅景天也是我國的一種傳統中藥，具有抗缺氧[4]、抗菌、抗氧化[5]、提高機體免疫力等作用。本研究的目的是觀察姜黃素聯合紅景天對SAP相關性腎損傷的腎組織中iNOS表達以及細胞因子白介素（IL）-1β、IL-6和IL-10的影響，探討姜黃素聯合紅景天對SAP相關性腎損傷是否有協同治療作用及其保護機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑和儀器
1.1.1 實驗動物
8～10周齡SD大鼠，24只，SPF級，雌雄不限，體質量（310±20）g，購自新疆醫科大學實驗動物中心，室溫（21±1）℃，自由進食水。
1.1.2 主要試劑
3%戊巴比妥鈉，武漢人福科技；姜黃素，上海生工生物工程技術服務有限公司；紅景天注射液，蘭州軍區烏魯木齊總醫院藥劑科；生理鹽水，四川科倫醫藥；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，南京建成生物工程研究所；IL-1β、IL-6和IL-10試劑盒，上海依科賽生物制品有限公司；原位末端標記（TUNEL）試劑盒，Roche，USA；DAB顯色劑，北京中山金橋生物技術有限公司；Trizol，北京康為世紀生物技術有限公司；氯仿和異丙醇，天津福晨化學試劑廠；無水乙醇，天津市化學三廠；反轉錄試劑盒，Invtrogen，USA；SYBR Green Select Master Mix，Life Technologies Corporation，USA；5×TBE，上海生工生物工程技術服務有限公司；瓊脂糖，Invitrogen，USA；核酸染料、Marker、Ladder，北京天根生物有限公司。iNOS PCR上游引物為5′-GTGCTAATGCGGAAGGTCATG-3′，下游引物為3′-GCTTCCGACTTTCCTGTCTCAGTA-5′；β-actin上游引物為5′-GCCAGGATAGAGCCACCAATC-3′，下游引物為3′-ACTGCCCTGGCTCCTAGCA-5′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
1.1.3 主要儀器
全自動生化分析儀，邁瑞公司；奧林巴斯光學顯微鏡，日本；電泳儀，北京六一儀器廠；分光光度計，Bio-Rad，USA；PCR基因擴增儀，Bio-Rad，Singapore；RT-PCR儀，Bio-Rad，USA。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組
將24只SD大鼠按窩別及體質量按隨機數字表法隨機分為SAP相關性腎損傷組（簡稱“SAP組”）、姜黃素治療組（簡稱“姜黃素組”）、姜黃素聯合紅景天治療組（簡稱“姜黃素＋紅景天組”），每組8只。
1.2.2 術前準備
術前12 h禁食，自由飲水。3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后固定、備皮、碘伏消毒手術區后常規鋪巾。SAP組大鼠在建模前3 h予以1.5 mL的生理鹽水腹腔注射，姜黃素組大鼠在建模前3 h予以200 mg/kg的1.5 mL姜黃素稀釋液灌胃，姜黃素＋紅景天組大鼠在建模前3 h予以200 mg/kg的1.5 mL姜黃素稀釋液灌胃同時6 g/kg的紅景天注射液腹腔注射。
1.2.3 SAP模型制備
取上腹部正中切口，長約3 cm，逐層切開入腹，在胃大彎側找到并提出胰腺，將腸管推向下腹部并予以無菌鹽水紗布覆蓋保護，胃向上翻，充分暴露胰腺。充分游離胰腺至胰頭部，以雙層無菌鹽水紗布包繞，無創血管鉗夾閉胰頭部，以剛好夾閉血管及胰管避免損傷胰腺組織為宜。無菌鹽水紗布覆蓋手術區，3 h后松開無創血管鉗，可見胰腺組織顏色逐漸恢復，取出紗布后逐層關腹，造模完成。
1.2.4 術后處理
術后放回飼養箱，4 h后可進食水。建模完成后每隔6 h，SAP組予以6 g/kg的生理鹽水腹腔注射，而姜黃素組予以200 mg/kg的1.5 mL姜黃素稀釋液灌胃，姜黃素＋紅景天組予以200 mg/kg的1.5 mL姜黃素稀釋液灌胃同時6 g/kg的紅景天注射液腹腔注射。
1.2.5 標本的采集
各組于建模完成后18 h麻醉大鼠，常規消毒、鋪巾、拆線，進入腹腔觀察腹腔內各臟器的大體情況后尋找出下腔靜脈，用促凝管各抽取3 mL靜脈血液，一只促凝管內靜脈血液行血淀粉酶、肌酐（creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）檢測；另一只促凝管內靜脈血液經3 000 r/min（r=13.5 cm）離心10 min，小心吸取上層血清保存于-70℃備測IL-1β、IL-6和IL-10含量。取左腎一大小約1 cm×1 cm×1 cm的組織用10%甲醛PBS液固定后石蠟包埋，切片后行蘇木素-伊紅（HE）染色，進行組織形態學觀察。取右腎用無菌鹽水紗布擦凈血跡后放入凍存管中密封編號后液氮冷凍保存備用。
1.3 檢測指標
1.3.1 血清淀粉酶、Cr及BUN的檢測
取已經離心好的血清嚴格按操作規范及流程進行上述指標的檢測，檢測前生化分析儀均進行校準，保證質控數據均在質控范圍內。
1.3.2 腎組織中SOD活性的測定
取制備好的10%的腎勻漿組織液采用羥胺法測定，并嚴格按SOD檢測試劑盒說明書上的說明步驟及所加試劑和劑量操作完成。
1.3.3 血清IL-1β、IL-6及IL-10含量的測定
采用雙抗體夾心ELISA法檢測，具體步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。通過繪制標準曲線得出樣品中相應細胞因子含量，該法檢測IL-1β、IL-6及IL-10靈敏度為15 pg/mL。
1.3.4 細胞凋亡的檢測
組織切片固定在防脫片上后采用TUNEL法標記凋亡細胞，DAB顯色，在光鏡下分析結果。每張切片觀察5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，計算每100個細胞中陽性細胞數，即凋亡指數。
1.3.5 RT-PCR檢測大鼠腎組織中iNOS mRNA表達
從凍存管中取0.1 g腎組織放入加有液氮的研缽中，不斷加入液氮轉動杵子直至腎組織研磨成粉末狀后加入1 mL Trizol，按說明書提取腎RNA。通過分光光度計測定其RNA的濃度，根據260 nm/280 nm處的比值測定其純度，滿意后取樣品的RNA 5μg進行反轉錄合成cDNA。再取待測樣品的cDNA按說明書配制成總體積為20μL的RT-PCR反應體系。β-actin反應條件：95℃3 min，95℃10 s，60℃30 s，40循環；65℃10 s，61循環。iNOS反應條件：95℃3 min，95℃10 s，56℃30 s，40循環；65℃10 s，61循環。各PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳回收后稀釋8個濃度梯度制作DNA標準曲線，各樣本的基因濃度結果直接由機器生成。每個樣本的iNOS的濃度與其β-actin基因濃度的比值即為iNOS mRNA的相對表達量。
1.4 統計學方法
應用SPSS 17.0軟件包進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 3組大鼠胰腺大體及病理組織學情況
SAP組在造模完成后大體可見胰腺組織輕度腫脹，18 h時見腹腔有血性腹水，胰腺出現出血、壞死及皂化斑形成。姜黃素組和姜黃素＋紅景天組較SAP組胰腺損傷減輕，胰腺出血壞死不如SAP組明顯，有少量的皂化斑出現，腹腔血性腹水也較SAP組減少。病理切片見SAP組胰腺充血腫脹，胰腺間質和小葉大量炎性細胞浸潤，部分胰腺組織呈彌漫性出血及壞死，胰周脂肪壞死，部分腺泡細胞溶解，只剩下解體細胞殘留。姜黃素組和姜黃素＋紅景天組見胰腺仍充血腫脹，但間質只有少量的炎性細胞浸潤，血管充血不如SAP組明顯，僅有片狀出血與壞死，而且姜黃素＋紅景天組又較姜黃素組減輕。
2.2 3組大鼠腎臟大體觀及病理組織學情況
各組在造模完成時腎臟體積和外觀無明顯變化。18 h時腎臟病理切片見SAP組腎小管上皮細胞水腫、個別細胞壞死脫落進入管腔，管腔變窄、腎小球中度淤血；姜黃素組和姜黃素＋紅景天組病理切片見腎小管上皮細胞水腫不如SAP組明顯，管腔輕度變窄，腎小球輕度淤血，姜黃素＋紅景天組又較姜黃素組病理改變減輕。見圖 1。
圖1
3組大鼠腎組織病理組織學改變（HE染色????×400）。1A：SAP組；1B：姜黃素組；1C：姜黃素＋紅景天組????圖 2????3組大鼠腎組織細胞凋亡情況（TUNEL????×400）。2A：SAP組；2B：姜黃素組；2C：姜黃素＋紅景天組
Figure1.
Pathological changes of renal tissues among three groups rats (HE staining????×400). 1A: SAP group; 1B: Curcumin group; 1C: Curcumin combined with Rhodiola group????Figure 2????Cell apoptosis of renal tissues among three groups rats (TUNEL????×400). 2A: SAP group; 2B: Curcumin group; 2C: Curcumin combined with Rhodiola group
2.3 3組大鼠腎臟組織細胞凋亡情況
SAP組見大量凋亡細胞，沿腎小管分布為主，腎小球可見少許凋亡細胞；姜黃素組和姜黃素＋紅景天組見腎小管凋亡細胞明顯減少，腎小球偶見凋亡細胞。見圖 2。姜黃素組和姜黃素＋紅景天組大鼠腎組織的凋亡指數分別為（25.4±5.4）%和（17.2±4.4）%，均分別明顯低于SAP組的（42.0±7.4）%，差異均有統計學意義（P＜0.05），并且姜黃素＋紅景天組明顯低于姜黃素組，差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.4 3組大鼠血清淀粉酶、Cr、BUN及SOD檢測結果
姜黃素組和姜黃素＋紅景天組大鼠血清淀粉酶、Cr及BUN含量均明顯低于SAP組（P＜0.05），SOD活性明顯高于SAP組（P＜0.05）；而姜黃素＋紅景天組大鼠血清淀粉酶、Cr及BUN含量均明顯低于姜黃素組（P＜0.05），SOD活性明顯高于姜黃素組（P＜0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠血清淀粉酶、Cr、BUN及SOD檢測結果比較（2.5 3組大鼠血清中細胞因子IL-1β、IL-6及IL-10含量的檢測結果
姜黃素組和姜黃素＋紅景天組大鼠血清中IL-1β和IL-6含量均明顯低于SAP組（P＜0.05），IL-10的含量明顯高于SAP組（P＜0.05）；而姜黃素＋紅景天組IL-1β和IL-6含量又明顯低于姜黃素組（P＜0.05），IL-10的含量又明顯高于姜黃素組（P＜0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠血清中細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10含量的比較（pg/mL，2.6 3組大鼠腎組織中iNOS mRNA的相對表達量
姜黃素組和姜黃素＋紅景天組腎組織中iNOS mRNA相對表達量明顯低于SAP組（P＜0.05），而姜黃素＋紅景天組又明顯低于姜黃素組（P＜0.05）。見圖 3。
圖3
各組大鼠的腎組織中iNOS mRNA相對表達量結果。與SAP組比較，* P＜0.05；與姜黃素組比較，△P＜0.05
Figure3.
Relative expression of iNOS mRNA of renal tissues in each group rats. Compared with SAP, * P < 0.05; Compared with Curcumin group, △P < 0.05
3 討論
SAP相關性腎損傷是由于機體發生SAP時所釋放出來的胰蛋白酶、缺氧、氧自由基、細菌感染、機體的免疫平衡失調等綜合因素的共同作用下所導致損傷的結果。
在SAP相關性腎損傷中，由于SAP所釋放出來的多種損傷因子促進SAP腎組織中的iNOS mRNA表達明顯升高，NO過度生成與呼吸鏈復合體Ⅲ所釋放的超氧化物結合形成過氧化亞硝酸鹽，造成線粒體損傷[7]；而且局部過量的NO與氧自由基相互作用后對腎組織細胞起直接毒性作用[8]。iNOS為一種機體內重要的促炎性酶，常表達于多種細胞，是機體內NO生成的主要限速酶[6]，NO產生量的多少主要受到NOS的調控，iNOS的激活可產生大量的NO。iNOS通常在細菌脂多糖、細胞因子、內毒素等誘導因素下激活。姜黃素和紅景天具有很好的抗菌作用[9-11]，因此姜黃素和紅景天可以抑制機體內的異常細菌產生脂多糖和內毒素來避免刺激iNOS的激活。在本研究中，姜黃素組和姜黃素＋紅景天組中iNOS mRNA表達均明顯下降（P＜0.05），但姜黃素＋紅景天組iNOS mRNA的表達量下降更明顯，故推測姜黃素聯合紅景天對SAP相關性腎損傷的治療作用有協同效應，姜黃素和紅景天可能通過下調iNOS mRNA的表達來減少機體產生大量的NO，抑制大量NO的生成對腎細胞的破壞作用，所以在聯合干預組中，我們可以看見腎的細胞凋亡數量也明顯少于SAP組和單純姜黃素治療組。
當SAP發生時，機體大量的內毒素及促炎性因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等細胞因子）的產生，機體的單核巨噬細胞釋放，刺激粒細胞的活化，粒細胞與內皮細胞的黏附，刺激吞噬細胞功能的激活，釋放活性自由基以及蛋白酶和水解酶。大量炎性介質的活化和氧自由基產生以及溶酶體對細胞膜造成損傷；而且大量活化了的炎性細胞黏附在腎血管內皮，導致腎毛細血管嚴重受損。此時機體還伴有血小板活化因子、血栓素A2的促凝物質的釋放，血液黏度的增加，促進微循環血栓的形成，加之機體的低血容量造成腎血容量灌注不足，進一步加重腎損傷[12]。在SAP的發生和發展中存在著一個免疫過激和免疫抑制相互并存的病理過程[13]，隨著病程的進展和多種刺激因素的共同作用，抗炎性因子IL-10表達量不斷升高，其升高不但可以抑制炎性因子的表達，還可以誘導合成促炎性因子拮抗劑來發揮抵抗作用[14]。姜黃素和紅景天可以通過抑制促炎性因子的表達以及促進抗炎性因子的表達，調節機體的免疫平衡[15-17]，對機體的炎性損傷起到很好的保護作用。在本研究中，在姜黃素聯合紅景天治療組中，促炎性細胞因子IL-1、IL-6的表達明顯下降，而抑炎癥因子IL-10的表達明顯升高（P＜0.05）。
當SAP發生時，胰蛋白酶激活激肽釋放酶-激肽系統的產物具有強烈的腎毒性[18]。大量活化的胰蛋白酶可以將前彈力酶、羧基肽酶原、非活性型磷脂酶A2激活釋放進入血液，其中磷脂酶A2使細胞膜的磷脂和卵磷脂分解。異常的脂類代謝產物如游離脂肪酸、酰基肉堿、溶血磷脂等都是細胞膜活性因子，可以破壞腎細胞膜，游離脂肪酸還能使線粒體的氧化磷酸化脫偶聯，阻止細胞膜上鈉泵的工作，使細胞內外不能維持有效的電位差。胰蛋白溶解酶可以在降解血漿蛋白的過程中釋放多肽，導致腎小球通透性增加，繼發腎小管及間質的損害。高濃度的胰蛋白酶還可以使機體出現高凝狀態，微小血栓的出現進一步加重了腎功能的損害。在本研究中，姜黃素組和姜黃素＋紅景天組血液中血淀粉酶值明顯低于SAP組（P＜0.05），胰腺壞死形成的皂化斑及病理切片中胰腺壞死程度也較SAP組減輕，提示紅景天和姜黃素還可能通過抑制過量胰蛋白酶原激活，減輕胰蛋白酶在自身組織內激活對胰腺組織的破壞作用。姜黃素＋紅景天組中腎臟的病理損傷程度最輕，也很好地證實了姜黃素和紅景天具有協同效應，能通過抑制過量胰蛋白酶原激活對腎臟起到很好的保護作用。
在SAP腎損傷中，氧自由基是腎損傷的重要因素之一。SOD具有很好清除機體內氧自由基的作用，因而對腎細胞起到很好的保護作用。姜黃素還含有一種熱穩定蛋白-抗氧化蛋白（TAP）[19]，能通過清除機體內的氧自由基而發揮抗氧化作用。以前很多文獻[20-23]也證實，紅景天具有很好的抗氧化作用，其機制是紅景天可以一定程度上通過提高腎細胞內的還原性物質量，減少細胞內脂質過氧化產物的產生來達到對腎損傷的保護作用。由于紅景天中含有的Cu-Zn-SOD與Mn-SOD是很好的氧自由基清除劑[24]，能提高細胞內SOD的活性，清除細胞內部分氧自由基，細胞內氧自由的量相應減少，腎臟受到氧自由基的損傷減輕。還有研究[20]提示，紅景天中的黃酮具有更強的抗氧化能力，對自由基的清除率大于50%。在本研究中，姜黃素＋紅景天組的SOD活性明顯高于SAP組（P＜0.05）和單純姜黃素組（P＜0.05），提示姜黃素和紅景天均可以通過清除細胞內部分氧自由基來達到對腎臟的保護作用。
當腎臟功能受到損害時，可以引起機體內大量的水鈉潴留以及BUN、Cr等有害物質不能通過尿液排出體外，而且隨著血清Cr明顯升高，其腎臟功能下降，病情迅速惡化，可能發展為急性腎功能衰竭[25]。姜黃素和紅景天可以通過抑制iNOS的表達量、提高腎臟中SOD的活性、清除部分氧自由基等作用來維護腎臟的正常功能，使機體內的代謝產物Cr、BUN可以順利地排出體外，避免對腎臟功能的進一步損害。在本研究中，姜黃素＋紅景天組的腎臟功能表現得更好，BUN、Cr比單純姜黃素組下降更明顯（P＜0.05），故我們推測，姜黃素聯合紅景天治療SAP時，二者對腎臟的抗氧化、抗缺氧作用有協同效應。
總之，姜黃素與紅景天主要通過抑制促炎性因子IL-1、IL-6的表達，促進抗炎性因子IL-10表達，下調iNOS mRNA表達，減少氧自由基的生成以及溶酶體對細胞膜的損害，抑制胰蛋白激活肽系統的激活，保護完整的細胞結構能，維持正常的腎臟功能，對腎臟起到很好的保護作用。在本研究中我們看到，姜黃素聯合紅景天在治療SAP相關性腎損傷的大鼠模型中取得了很好的實驗結果，但姜黃素聯合紅景天在SAP相關性腎損傷治療的應用研究還很少，關于姜黃素和紅景天在臨床應用的劑量等問題需要我們進行更多的研究。
