引用本文： 胡潔瓊, 金安琴, 黃曉俊, 楊麗虹, 蔣濤. miR-339-3p和miR-339-5p在體外胃癌細胞中的表達和意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(10): 1216-1221. doi: 10.7507/1007-9424.20140292 復制
胃癌是常見的惡性腫瘤之一，目前胃癌的發病原因及發病機理仍不明確，對人類胃癌的研究表明，胃癌的發生是多種因素共同作用的結果。在基因研究水平，基于編碼蛋白的癌基因與抑癌基因是腫瘤發生的原因這一共識，對胃癌的研究主要局限在編碼蛋白的癌基因與抑癌基因上，如ras、bcl-2、p53基因等。但是近年來，隨著微小RNA（microRNA，miRNA）的發現，認為腫瘤的發生發展是一個多因素、多步驟以及編碼基因和非編碼基因共同參與的復雜過程，其中miRNA作為重要的非編碼基因起著至關重要的作用。
miRNA是近20年來新發現的內源性非編碼小分子RNA，長度為21～25個核苷酸，可在翻譯水平調控基因的表達[1-6]。在已發現的人類miRNA中，約有一半以上定位于已知的腫瘤相關基因組區域內或已知的基因脆性位點，提示miRNA在腫瘤發生過程中可能扮演了重要的角色[7]。研究表明，肝癌[8]、乳腺癌[9]、結腸癌[10]、白血病[11]、前列腺癌[12-13]肺癌[14]、甲狀腺癌[15]等多種腫瘤都與miRNAs相關。目前，圍繞胃癌miRNA的研究亦不斷深入，利用miRNA基因芯片技術，對胃癌患者胃黏膜的miRNA表達譜進行分析，其結果顯示多個miRNA在胃癌組織及其鄰近的非腫瘤組織中的表達有顯著差異[16]。基于miRNA在腫瘤中的重要作用，本研究旨在探索miRNA-339-3p（miR-339-3p）及miRNA-339-5p（miR-339-5p）與胃癌的相關性，為胃癌的早期診斷尋求新的腫瘤標志物，并為腫瘤的分子靶點治療尋求科學依據。
1 材料和方法
1.1 材料
人正常胃黏膜上皮細胞GES-1，胃癌細胞株MKN-45、SGC-7901及BGC-823均由蘭州大學第二醫院消化系腫瘤重點實驗室保存；胎牛血清和PRMI 1640培養基購自美國Hyclone公司；miRNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光實時定量多聚酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒、Universal RNU6B primer以及miRNA引物均購自寶生物工程（大連）有限責任公司；miRNA mimics和miRNA mimics NC，購自上海吉瑪制藥技術有限公司；LipfectamineTM2000購自美國Invitrigen公司；細胞計數試劑盒8（CCK-8）購自碧云天生物技術研究所。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
取人正常胃黏膜上皮細胞GES-1及胃癌細胞株MKN-45、SGC-7901和BGC-823接種于25 cm2細胞培養瓶中，用含10%胎牛血清和1%雙抗（青鏈霉素）的PRMI 1640培養基于37℃、5% CO2條件下培養，待鏡下細胞生長至90%～100%密度時行傳代培養，取傳代3代以上者行下一步實驗。用于轉染的細胞培養基中不加雙抗。
1.2.2 RT-PCR
①小分子RNA（small RNA，smRNA）的提取：采用RNAiso for smRNA試劑分別提取上述各各細胞株的smRNA，并將其溶解于適量焦炭酸二乙酯水中，用紫外分光光度儀測定其濃度及純度。②聚腺苷酸（A）加尾反應和反轉錄反應：20μL反應體系中依次加入2×miRNAReaction Buffer Mix 10μL、miRNA Prime Script RT Enzyme Mix 2μL、0.1%BSA 2μL、smRNA 1μL、RNase free dH2O 5μL，混勻后在37℃反應60 min，然后85℃5 s使酶滅活。向得到的RT反應液中加入RNase Free dH2O補足至100μL，混勻后取2μLcDNA稀釋液加入到無RNase酶的0.2 mL PCR管中，加入5μL Easy Dilution再次稀釋混勻后取2μL用于下一步實時多聚酶鏈式反應。③RT-PCR：在20μL的PCR反應體系中依次加入dH2O6.8μL、SYBR Premix Ex TMⅡ10μL、ROX Reference DyeⅡ0.4μL、PCR Forward Primer（10 Um）0.4μL、Uni-miR qPCR Primer（10 Um）0.4μL及cDNA溶液2μL混勻。內參基因RNU6B的20μL反應體系由以下成分組成：dH2O 6.8μL、SYBR Premix Ex TMⅡ10μL、ROX Reference DyeⅡ0.4μL、Universal RNU6B primer0.8μL和cDNA溶液2μL。將混合好的PCR反應體系放入ABI7500熒光定量PCR反應儀中，其反應條件：95℃、30 s，95℃、3 s，60℃、34 s，共40個循環。內參RNU6B的序列（5′～3′）F為CTCGCTTCGGCAG-CACA；R為AACGCTTCACGAATTTG。miR-339-3p及miR-339-5p序列由miRBase數據庫查得，miR-339-3p序列（5′～3′）為UGAGCGCCUCGACGACA-GAGCCG；miR-339-5p序列（5′～3′）為UCCCUGU-CCUCCAGGAGCUCACA。結果采用2-△△Ct相對定量法計算各細胞株的miR-339-3p和miR-339-5p的表達。
1.2.3 miRNA轉染
取MKN-45細胞接種于6孔板上（2.5×105個/孔），過夜生長，待貼壁細胞密度達50%～70%時使用LipofectamineTM2000轉染試劑進行轉染，實驗設實驗組、陰性對照組（NC組）和空白對照組3組。根據上海吉瑪制藥有限公司提供的操作步驟分別轉染miR-339-5p mimics/miR-339-3p mimics（實驗組）、陰性熒光對照（negative control FAM，NC組）及mock transfection（空白對照組），其中LipofectamineTM2000：miRNA mimics/NC/mock transfection為1:3（V/V），每組設6復孔，實驗重復3次。轉染后于6、24及48 h時段給細胞拍照，觀察轉染效率；轉染后48 h用RT-PCR檢測MKN-45細胞中miR-339-3p及miR-339-5p的表達。hsa-miR-339-3p mimic序列（5′～3′）：UGAG-CGCCUCGACGACAGAGCG，GCUCUGUCGUCG-AGGCGCUCAUU（該序列是根據hsa-miR-339-3p序列在基因庫中搜索到相應序列后人工合成的）；hsa-miR-339-5p mimics序列（5′～3′）：UCCCUGU-CCUCCAGGAGCUCACG，UGAGCUCCUGGAGG-ACAGGGAUU；陰性對照序列（5′～3′）：SenseUU-CUCCGAACGUGUCACGUTT，Anti-senseACGUG-ACACGUUCGGAGAATT。轉染后胃癌細胞株的轉染效率用RT-PCR進行驗證。
1.2.4 細胞增殖分析
應用CCK-8對轉染后胃癌細胞的增殖情況進行分析。取MKN-45細胞接種至96孔板上（3 000個/孔），方法同miRNA轉染。培養72 h后每孔中加入10μL CCK-8試劑，放入37℃、5% CO2的細胞孵育箱中繼續培養2 h。然后使用酶標儀檢測波長為450 nm處的吸光度值（A值）。每組設6個復孔，并重復3次。
1.2.5 細胞凋亡情況測定
取MKN-45細胞接種至25 cm2細胞培養瓶中常規培養，24 h內待細胞增長至密度達50%～70%時即可用于轉染，轉染時LipofectamineTM2000：miR-339-3p mimics/miR-339-5p mimics為1:3，即LipofectamineTM2000為15μL/瓶，miR-339-3p mimics/miR-339-5p mimics為45μL/瓶；轉染方法同1.2.3的方法。72 h后用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。
1.3 統計學方法
應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。RT-PCR實驗結果用2-△△Ct法比較不同細胞株間miR-339-3p和miR-339-5p的表達差異；細胞增殖結果行方差分析；細胞凋亡結果行t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞中的表達情況
以人正常胃黏膜上皮細胞GES-1為參照，miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞株SGC-7901中的表達量分別為GES-1的0.142倍及0.115倍，在BGC-823中分別為GES-1的0.086倍及0.091倍，在MKN-45中分別為GES-1的0.184倍及0.261倍（表 1及表 2）。提示miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞株SGC-7901、BGC-823和MKN-45中的表達量均明顯低于人正常胃黏膜上皮細胞GES-1的表達量（P < 0.05）。
表1
miR-339-3p在GES-1、SGC-7901、MKN-45和BGC-823細胞株中的表達結果（n=6，
表2
miR-339-5p在GES-1、SGC-7901、MKN-45、BGC-823細胞株中的表達結果（n=6，2.2 轉染效率RT-PCR檢測結果
2.2.1 miR-339-3p轉染效率RT-PCR檢測結果
以NC組為基準，miR-339-3p在實驗組中的表達量是NC組的4 688.885倍；在空白對照組中的表達量是NC組的10.824倍。提示MKN-45細胞轉染miR-339-3p mimics后細胞中的miR-339-3p表達量顯著增高（表 3），P < 0.01。
表3
miR-339-3p在空白對照組、實驗組及NC組中的表達結果（n=6，2.2.2 miR-339-5p轉染效率RT-PCR檢測結果
以NC組為基準，miR-339-5p在實驗組中的表達量是NC組的8 820.942倍；在空白對照組中的表達量是NC組的1.387倍。提示MKN-45細胞轉染miR-339-5p mimics后細胞中的miR-339-5p表達量顯著增高（表 4），P < 0.01。
表4
miR-339-5p在空白對照組、實驗組及NC組中的表達結果（n=6，2.3 miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞增殖中的作用
為確定miR-339-3p和miR-339-5p對胃癌細胞增殖的影響，本研究在MKN-45細胞株中轉染miRNA，應用CCK-8法進行實驗。結果發現，與NC組及空白對照組比較，轉染miR-339-3p mimics/miR-339-5p mimics 72 h后，MKN-45細胞的增殖明顯減慢（P < 0.01），而空白對照組與NC組之間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 5和表 6。
表5
miR-339-3p mimics組、NC組和空白對照組MKN-45細胞增殖能力的比較
Table5.
Comparison of MKN-45 cell proliferation between the miR-339-3p mimics group, NC group, and Mock group
表6
miR-339-5p mimics組、NC組和空白對照組MKN-45細胞增殖能力的比較
Table6.
Comparison of MKN-45 cell proliferation between the miR-339-5p mimics group, NC group, and Mock group
2.4 miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞凋亡中的作用
與NC組相比，轉染miR-339-3p mimics/miR-339-5p mimics的MKN-45細胞的凋亡率增高，其差異有統計學意義（P < 0.05）。其中轉染miR-339-3p mimics組與NC組MKN-45細胞凋亡率的差值為（3.25±0.22）%，見圖 1及圖 2；轉染miR-339-5p mimics與NC組MKN-45細胞凋亡率的差值為（5.86±0.24）%，見圖 3及圖 4。
圖1
示NC組MKN-45細胞的凋亡檢測結果??圖 2?示miR-339-3p mimics轉染組MKN-45細胞凋亡檢測結果??圖 3?示NC組MKN-45細胞的凋亡檢測結果??圖 4?示miR-339-5p mimics轉染組MKN-45細胞凋亡檢測結果
Figure1.
Results of MKN-45 cells apoptosis in NC group??Figure 2?Results of MKN-45 cells apoptosis in miR-339-3p mimics transfection group ??Figure 3?Results of MKN-45 cells apoptosis in NC group??Figure 4?Results of MKN-45 cells apoptosis in miR-339-5p mimics transfection group
3 討論
自從1993年人類在線蟲中發現第1個miRNA [17]后，miRNA便成為RNA研究領域的又一重要突破。隨著人類對這個龐大家族的不斷研究，逐漸認識到miRNA這個非編碼單鏈小RNA分子不僅與胚胎的生長、發育，細胞的增殖、分化以及凋亡有關，還與物質的代謝等過程關系密切[18-19, 3-5]。更進一步的研究也表明，miRNA還參與胃癌細胞的增殖、凋亡、侵襲轉移等過程，如miR-24 [20]、miR-21 [21]、miR-218 [22]等。關于miR-339-5p在腫瘤中的表達情況，有研究顯示，miR-339-5p在肺癌[23]、胃癌[24-25]及乳腺癌[26]中均呈低表達，但是無miR-339-3p相關研究；在胃癌中無miR-339-5p的進一步研究。
在本研究中，采用RT-PCR對正常胃黏膜上皮細胞及不同分化程度的胃癌細胞中的miR-339-3p和miR-339-5p進行檢測發現，miR-339-3p和miR-339-5p在3株不同分化程度的胃癌細胞中的表達量均下降，結合以上結果分析：miR-339-3p和miR-339-5p均為Hsa-mir-339前體的3，端和5，端分別加工而成的成熟體，但是在同一細胞中的表達豐度是不相同的；目前關于miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞及組織中的表達豐度的差異無相關資料，在進行RT-PCR檢測的基礎上可以結合更多miRNA檢測方法來驗證二者在腫瘤中的表達豐度，以進一步說明二者在同一腫瘤細胞株中表達的差異性。Wu等[26]對乳腺癌的研究表明，miR-339-5p在人高侵襲性乳腺癌中呈低表達，低侵襲性乳腺癌中呈高表達。miR-339-5p在乳腺癌細胞和胃癌細胞中的表達結果是不相符的，但是miR-339-3p和miR-339-5p在腫瘤細胞和正常細胞中的差異表達可以作為我們選擇新的腫瘤標志物的有效參考。
本研究發現，與NC組及空白對照組相比，轉染miR-339-3p mimics和miR-339-5p mimics后，MKN-45細胞的增殖明顯減慢（P < 0.01），而NC組與空白對照組之間比較差異無統計學意義（P > 0.05），提示miR-339-3p和miR-339-5p的過表達可使胃癌細胞的增殖能力減弱，從而抑制腫瘤細胞的生長；與NC組相比，miR-339-3p和miR-339-5p的過表達可以促進MKN-45細胞的凋亡。以上結果提示，miR-339-3p和miR-339-5p可能參與了胃癌細胞增殖及凋亡的調控過程。
綜上，miR-339-3p和miR-339-5p在不同分化程度胃癌細胞中的表達均呈下調趨勢，下調程度與腫瘤分化程度無明顯相關性；miR-339-3p和miR-339-5p的過表達能使胃癌細胞的增殖能力減弱。故筆者認為，對于miR-339-5p在腫瘤細胞中的表達總體是呈下調趨勢的，下調的程度是否與腫瘤的分化程度相關需要更多相關研究的進一步驗證。但這些數據均不影響miR-339-5p成為腫瘤早期診斷的分子水平的新腫瘤標志物。同時本研究對miR-339的另一個成熟體miR-339-3p亦進行了進一步的研究，研究的最終結果是與miR-339-5p的結果是基本一致的，這個結果提示我們對于同一前體加工而成的不同成熟體可能都可作為對同一種腫瘤診斷的標志物，表達豐度的不同不會影響對腫瘤的診斷結果。當然，miR-339-3p和miR-339-5p在腫瘤中的作用機理還需要更多的研究數據來驗證。
胃癌是常見的惡性腫瘤之一，目前胃癌的發病原因及發病機理仍不明確，對人類胃癌的研究表明，胃癌的發生是多種因素共同作用的結果。在基因研究水平，基于編碼蛋白的癌基因與抑癌基因是腫瘤發生的原因這一共識，對胃癌的研究主要局限在編碼蛋白的癌基因與抑癌基因上，如ras、bcl-2、p53基因等。但是近年來，隨著微小RNA（microRNA，miRNA）的發現，認為腫瘤的發生發展是一個多因素、多步驟以及編碼基因和非編碼基因共同參與的復雜過程，其中miRNA作為重要的非編碼基因起著至關重要的作用。
miRNA是近20年來新發現的內源性非編碼小分子RNA，長度為21～25個核苷酸，可在翻譯水平調控基因的表達[1-6]。在已發現的人類miRNA中，約有一半以上定位于已知的腫瘤相關基因組區域內或已知的基因脆性位點，提示miRNA在腫瘤發生過程中可能扮演了重要的角色[7]。研究表明，肝癌[8]、乳腺癌[9]、結腸癌[10]、白血病[11]、前列腺癌[12-13]肺癌[14]、甲狀腺癌[15]等多種腫瘤都與miRNAs相關。目前，圍繞胃癌miRNA的研究亦不斷深入，利用miRNA基因芯片技術，對胃癌患者胃黏膜的miRNA表達譜進行分析，其結果顯示多個miRNA在胃癌組織及其鄰近的非腫瘤組織中的表達有顯著差異[16]。基于miRNA在腫瘤中的重要作用，本研究旨在探索miRNA-339-3p（miR-339-3p）及miRNA-339-5p（miR-339-5p）與胃癌的相關性，為胃癌的早期診斷尋求新的腫瘤標志物，并為腫瘤的分子靶點治療尋求科學依據。
1 材料和方法
1.1 材料
人正常胃黏膜上皮細胞GES-1，胃癌細胞株MKN-45、SGC-7901及BGC-823均由蘭州大學第二醫院消化系腫瘤重點實驗室保存；胎牛血清和PRMI 1640培養基購自美國Hyclone公司；miRNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光實時定量多聚酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒、Universal RNU6B primer以及miRNA引物均購自寶生物工程（大連）有限責任公司；miRNA mimics和miRNA mimics NC，購自上海吉瑪制藥技術有限公司；LipfectamineTM2000購自美國Invitrigen公司；細胞計數試劑盒8（CCK-8）購自碧云天生物技術研究所。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
取人正常胃黏膜上皮細胞GES-1及胃癌細胞株MKN-45、SGC-7901和BGC-823接種于25 cm2細胞培養瓶中，用含10%胎牛血清和1%雙抗（青鏈霉素）的PRMI 1640培養基于37℃、5% CO2條件下培養，待鏡下細胞生長至90%～100%密度時行傳代培養，取傳代3代以上者行下一步實驗。用于轉染的細胞培養基中不加雙抗。
1.2.2 RT-PCR
①小分子RNA（small RNA，smRNA）的提取：采用RNAiso for smRNA試劑分別提取上述各各細胞株的smRNA，并將其溶解于適量焦炭酸二乙酯水中，用紫外分光光度儀測定其濃度及純度。②聚腺苷酸（A）加尾反應和反轉錄反應：20μL反應體系中依次加入2×miRNAReaction Buffer Mix 10μL、miRNA Prime Script RT Enzyme Mix 2μL、0.1%BSA 2μL、smRNA 1μL、RNase free dH2O 5μL，混勻后在37℃反應60 min，然后85℃5 s使酶滅活。向得到的RT反應液中加入RNase Free dH2O補足至100μL，混勻后取2μLcDNA稀釋液加入到無RNase酶的0.2 mL PCR管中，加入5μL Easy Dilution再次稀釋混勻后取2μL用于下一步實時多聚酶鏈式反應。③RT-PCR：在20μL的PCR反應體系中依次加入dH2O6.8μL、SYBR Premix Ex TMⅡ10μL、ROX Reference DyeⅡ0.4μL、PCR Forward Primer（10 Um）0.4μL、Uni-miR qPCR Primer（10 Um）0.4μL及cDNA溶液2μL混勻。內參基因RNU6B的20μL反應體系由以下成分組成：dH2O 6.8μL、SYBR Premix Ex TMⅡ10μL、ROX Reference DyeⅡ0.4μL、Universal RNU6B primer0.8μL和cDNA溶液2μL。將混合好的PCR反應體系放入ABI7500熒光定量PCR反應儀中，其反應條件：95℃、30 s，95℃、3 s，60℃、34 s，共40個循環。內參RNU6B的序列（5′～3′）F為CTCGCTTCGGCAG-CACA；R為AACGCTTCACGAATTTG。miR-339-3p及miR-339-5p序列由miRBase數據庫查得，miR-339-3p序列（5′～3′）為UGAGCGCCUCGACGACA-GAGCCG；miR-339-5p序列（5′～3′）為UCCCUGU-CCUCCAGGAGCUCACA。結果采用2-△△Ct相對定量法計算各細胞株的miR-339-3p和miR-339-5p的表達。
1.2.3 miRNA轉染
取MKN-45細胞接種于6孔板上（2.5×105個/孔），過夜生長，待貼壁細胞密度達50%～70%時使用LipofectamineTM2000轉染試劑進行轉染，實驗設實驗組、陰性對照組（NC組）和空白對照組3組。根據上海吉瑪制藥有限公司提供的操作步驟分別轉染miR-339-5p mimics/miR-339-3p mimics（實驗組）、陰性熒光對照（negative control FAM，NC組）及mock transfection（空白對照組），其中LipofectamineTM2000：miRNA mimics/NC/mock transfection為1:3（V/V），每組設6復孔，實驗重復3次。轉染后于6、24及48 h時段給細胞拍照，觀察轉染效率；轉染后48 h用RT-PCR檢測MKN-45細胞中miR-339-3p及miR-339-5p的表達。hsa-miR-339-3p mimic序列（5′～3′）：UGAG-CGCCUCGACGACAGAGCG，GCUCUGUCGUCG-AGGCGCUCAUU（該序列是根據hsa-miR-339-3p序列在基因庫中搜索到相應序列后人工合成的）；hsa-miR-339-5p mimics序列（5′～3′）：UCCCUGU-CCUCCAGGAGCUCACG，UGAGCUCCUGGAGG-ACAGGGAUU；陰性對照序列（5′～3′）：SenseUU-CUCCGAACGUGUCACGUTT，Anti-senseACGUG-ACACGUUCGGAGAATT。轉染后胃癌細胞株的轉染效率用RT-PCR進行驗證。
1.2.4 細胞增殖分析
應用CCK-8對轉染后胃癌細胞的增殖情況進行分析。取MKN-45細胞接種至96孔板上（3 000個/孔），方法同miRNA轉染。培養72 h后每孔中加入10μL CCK-8試劑，放入37℃、5% CO2的細胞孵育箱中繼續培養2 h。然后使用酶標儀檢測波長為450 nm處的吸光度值（A值）。每組設6個復孔，并重復3次。
1.2.5 細胞凋亡情況測定
取MKN-45細胞接種至25 cm2細胞培養瓶中常規培養，24 h內待細胞增長至密度達50%～70%時即可用于轉染，轉染時LipofectamineTM2000：miR-339-3p mimics/miR-339-5p mimics為1:3，即LipofectamineTM2000為15μL/瓶，miR-339-3p mimics/miR-339-5p mimics為45μL/瓶；轉染方法同1.2.3的方法。72 h后用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。
1.3 統計學方法
應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。RT-PCR實驗結果用2-△△Ct法比較不同細胞株間miR-339-3p和miR-339-5p的表達差異；細胞增殖結果行方差分析；細胞凋亡結果行t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞中的表達情況
以人正常胃黏膜上皮細胞GES-1為參照，miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞株SGC-7901中的表達量分別為GES-1的0.142倍及0.115倍，在BGC-823中分別為GES-1的0.086倍及0.091倍，在MKN-45中分別為GES-1的0.184倍及0.261倍（表 1及表 2）。提示miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞株SGC-7901、BGC-823和MKN-45中的表達量均明顯低于人正常胃黏膜上皮細胞GES-1的表達量（P < 0.05）。
表1
miR-339-3p在GES-1、SGC-7901、MKN-45和BGC-823細胞株中的表達結果（n=6，
表2
miR-339-5p在GES-1、SGC-7901、MKN-45、BGC-823細胞株中的表達結果（n=6，2.2 轉染效率RT-PCR檢測結果
2.2.1 miR-339-3p轉染效率RT-PCR檢測結果
以NC組為基準，miR-339-3p在實驗組中的表達量是NC組的4 688.885倍；在空白對照組中的表達量是NC組的10.824倍。提示MKN-45細胞轉染miR-339-3p mimics后細胞中的miR-339-3p表達量顯著增高（表 3），P < 0.01。
表3
miR-339-3p在空白對照組、實驗組及NC組中的表達結果（n=6，2.2.2 miR-339-5p轉染效率RT-PCR檢測結果
以NC組為基準，miR-339-5p在實驗組中的表達量是NC組的8 820.942倍；在空白對照組中的表達量是NC組的1.387倍。提示MKN-45細胞轉染miR-339-5p mimics后細胞中的miR-339-5p表達量顯著增高（表 4），P < 0.01。
表4
miR-339-5p在空白對照組、實驗組及NC組中的表達結果（n=6，2.3 miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞增殖中的作用
為確定miR-339-3p和miR-339-5p對胃癌細胞增殖的影響，本研究在MKN-45細胞株中轉染miRNA，應用CCK-8法進行實驗。結果發現，與NC組及空白對照組比較，轉染miR-339-3p mimics/miR-339-5p mimics 72 h后，MKN-45細胞的增殖明顯減慢（P < 0.01），而空白對照組與NC組之間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 5和表 6。
表5
miR-339-3p mimics組、NC組和空白對照組MKN-45細胞增殖能力的比較
Table5.
Comparison of MKN-45 cell proliferation between the miR-339-3p mimics group, NC group, and Mock group
表6
miR-339-5p mimics組、NC組和空白對照組MKN-45細胞增殖能力的比較
Table6.
Comparison of MKN-45 cell proliferation between the miR-339-5p mimics group, NC group, and Mock group
2.4 miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞凋亡中的作用
與NC組相比，轉染miR-339-3p mimics/miR-339-5p mimics的MKN-45細胞的凋亡率增高，其差異有統計學意義（P < 0.05）。其中轉染miR-339-3p mimics組與NC組MKN-45細胞凋亡率的差值為（3.25±0.22）%，見圖 1及圖 2；轉染miR-339-5p mimics與NC組MKN-45細胞凋亡率的差值為（5.86±0.24）%，見圖 3及圖 4。
圖1
示NC組MKN-45細胞的凋亡檢測結果??圖 2?示miR-339-3p mimics轉染組MKN-45細胞凋亡檢測結果??圖 3?示NC組MKN-45細胞的凋亡檢測結果??圖 4?示miR-339-5p mimics轉染組MKN-45細胞凋亡檢測結果
Figure1.
Results of MKN-45 cells apoptosis in NC group??Figure 2?Results of MKN-45 cells apoptosis in miR-339-3p mimics transfection group ??Figure 3?Results of MKN-45 cells apoptosis in NC group??Figure 4?Results of MKN-45 cells apoptosis in miR-339-5p mimics transfection group
3 討論
自從1993年人類在線蟲中發現第1個miRNA [17]后，miRNA便成為RNA研究領域的又一重要突破。隨著人類對這個龐大家族的不斷研究，逐漸認識到miRNA這個非編碼單鏈小RNA分子不僅與胚胎的生長、發育，細胞的增殖、分化以及凋亡有關，還與物質的代謝等過程關系密切[18-19, 3-5]。更進一步的研究也表明，miRNA還參與胃癌細胞的增殖、凋亡、侵襲轉移等過程，如miR-24 [20]、miR-21 [21]、miR-218 [22]等。關于miR-339-5p在腫瘤中的表達情況，有研究顯示，miR-339-5p在肺癌[23]、胃癌[24-25]及乳腺癌[26]中均呈低表達，但是無miR-339-3p相關研究；在胃癌中無miR-339-5p的進一步研究。
在本研究中，采用RT-PCR對正常胃黏膜上皮細胞及不同分化程度的胃癌細胞中的miR-339-3p和miR-339-5p進行檢測發現，miR-339-3p和miR-339-5p在3株不同分化程度的胃癌細胞中的表達量均下降，結合以上結果分析：miR-339-3p和miR-339-5p均為Hsa-mir-339前體的3，端和5，端分別加工而成的成熟體，但是在同一細胞中的表達豐度是不相同的；目前關于miR-339-3p和miR-339-5p在胃癌細胞及組織中的表達豐度的差異無相關資料，在進行RT-PCR檢測的基礎上可以結合更多miRNA檢測方法來驗證二者在腫瘤中的表達豐度，以進一步說明二者在同一腫瘤細胞株中表達的差異性。Wu等[26]對乳腺癌的研究表明，miR-339-5p在人高侵襲性乳腺癌中呈低表達，低侵襲性乳腺癌中呈高表達。miR-339-5p在乳腺癌細胞和胃癌細胞中的表達結果是不相符的，但是miR-339-3p和miR-339-5p在腫瘤細胞和正常細胞中的差異表達可以作為我們選擇新的腫瘤標志物的有效參考。
本研究發現，與NC組及空白對照組相比，轉染miR-339-3p mimics和miR-339-5p mimics后，MKN-45細胞的增殖明顯減慢（P < 0.01），而NC組與空白對照組之間比較差異無統計學意義（P > 0.05），提示miR-339-3p和miR-339-5p的過表達可使胃癌細胞的增殖能力減弱，從而抑制腫瘤細胞的生長；與NC組相比，miR-339-3p和miR-339-5p的過表達可以促進MKN-45細胞的凋亡。以上結果提示，miR-339-3p和miR-339-5p可能參與了胃癌細胞增殖及凋亡的調控過程。
綜上，miR-339-3p和miR-339-5p在不同分化程度胃癌細胞中的表達均呈下調趨勢，下調程度與腫瘤分化程度無明顯相關性；miR-339-3p和miR-339-5p的過表達能使胃癌細胞的增殖能力減弱。故筆者認為，對于miR-339-5p在腫瘤細胞中的表達總體是呈下調趨勢的，下調的程度是否與腫瘤的分化程度相關需要更多相關研究的進一步驗證。但這些數據均不影響miR-339-5p成為腫瘤早期診斷的分子水平的新腫瘤標志物。同時本研究對miR-339的另一個成熟體miR-339-3p亦進行了進一步的研究，研究的最終結果是與miR-339-5p的結果是基本一致的，這個結果提示我們對于同一前體加工而成的不同成熟體可能都可作為對同一種腫瘤診斷的標志物，表達豐度的不同不會影響對腫瘤的診斷結果。當然，miR-339-3p和miR-339-5p在腫瘤中的作用機理還需要更多的研究數據來驗證。
