引用本文： 邵俊偉, 蔡遜, 馬丹丹, 胡逸林, 張翌. SD大鼠2型糖尿病模型的建立與評價. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(10): 1212-1215. doi: 10.7507/1007-9424.20140291 復制
糖尿病是嚴重危害人類健康的慢性疾病之一。近年來，隨著老齡人口的增加、人民生活水平的提高以及飲食結構的改變，糖尿病的發病率呈逐年上升趨勢，成為繼心血管、腫瘤疾病以后的第3號健康殺手。目前，全球約有1.5億人患有糖尿病，其中90%以上是2型糖尿病[1]，其發病機理尚未完全闡明。因此，建立合適的2型糖尿病動物模型，對研究其病因、發病機理、完善預防及臨床治療具有重要意義。國內外研究[2-4]一致表明，制備2型糖尿病大鼠模型可通過高脂飲食誘導大鼠胰島素抵抗后，再注射低劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）損傷胰島功能，引起血糖升高，可模擬2型糖尿病的發病過程。本研究以SD大鼠作為實驗動物，觀察不同劑量的STZ對模型建立的影響，以選取最佳劑量來誘導產生糖尿病大鼠模型，為糖尿病及其并發癥的研究提供理想的動物實驗技術平臺。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SPF級雄性Sprague Dawley（SD）大鼠60只，6周齡，體質量180～200 g，購于武漢大學動物實驗中心，動物合格證號：42000600002150，使用證號：0012272。室內通風良好，室溫20～25℃，相對濕度40%～70%，每日光照12 h，自由攝食飲水。
1.2 飼料
高脂高糖飼料按照以往文獻[5-7]報道的配方做部分調整，成分如下：20.0%豬油、15.0%蔗糖、2.5%膽固醇、0.4%膽酸鈉及62.0%常規飼料。
1.3 儀器與試劑
STZ（美國Sigma公司），大鼠胰島素放射免疫方法試劑盒（碧云天生物技術公司），大鼠總膽固醇試劑盒和甘油三酯試劑盒（武漢凌飛科技公司）。檸檬酸（批號：20120521）及檸檬酸鈉（批號：20120509）購自武漢潔美試劑公司。穩豪One-Touch血糖測量儀及試紙（美國強生公司）。STZ溶液的配制方法：將STZ溶解于0.1 mol/L（pH4.4）檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，新鮮配制成1% STZ溶液。STZ必須保存于-20℃冰箱，現配現用，配好的檸檬酸緩沖溶液和STZ溶液應避光冰浴，30 min內用完。
1.4 動物分組與模型建立
高脂高糖喂養4周，將大鼠按隨機數字表法隨機分為3組：①對照組，20只，腹腔注射檸檬酸50 mg/kg，普通飼料喂養。②糖尿病造模組，根據腹腔注射STZ劑量的不同，分為了2個組，各20只，分別腹腔注射STZ 50 mg/kg或35 mg/kg（模型1組及模型2組），注射后3 d取尾靜脈血檢測大鼠血糖，以空腹血糖值≥16.7 mmol/L，并穩定10 d，則為大鼠糖尿病造模成功。
1.5 觀察指標及方法
1.5.1 大鼠一般情況及存活情況觀察
每天觀察大鼠進食量、飲水量、排尿量及死亡情況，每隔1～2周稱重。
1.5.2 血生化指標檢測
糖尿病大鼠模型建好后，大鼠禁食不禁水12 h后剪尾取血檢測大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）及空腹血清胰島素（fasting serum insulin，FSI）水平，采用大鼠ELISA試劑盒檢測，并計算胰島素敏感指數（insulin sensetivity index，ISI）。同時采用日立8060全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇（TC）及甘油三酯（TG）水平。
1.6 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 各組大鼠一般情況及存活情況觀察結果
實驗期間，對照組大鼠體質量無明顯變化，精神狀況良好，雙目有神，反應敏捷，毛發有光澤，無糖尿病臨床表現（成模率為0），也無死亡。兩模型組大鼠體質量逐漸增加，注射STZ后則出現生長遲緩、身體消瘦、精神萎靡、倦怠懶動、嗜睡、反應遲鈍、臀尾出汗潮濕、臀毛枯黃、拉尾排便，伴有多食、多飲、多尿等典型的糖尿病臨床表現；其中模型1組的糖尿病成模率為75%（15/20），死亡率為25%（5/20），其中4只大鼠在注射STZ 24 h后死亡，經解剖發現，其腎臟和脾臟有瘀血，臟器變小，推測可能是由于大劑量的STZ損傷了腎臟和脾臟，最后導致大鼠的死亡；另1只大鼠在注射STZ 3 d后死亡，系高血糖形成酮癥酸中毒所致。而模型2組的糖尿病成模率為85%（17/20），死亡率為0，分別高于或低于模型1組（P < 0.05）。
2.2 各組大鼠FBG、FINS及ISI檢測結果
結果見表 1。由表 1可見，兩模型組大鼠的FBG及FSI水平均明顯高于對照組（P < 0.05），ISI則低于對照組（P < 0.05）；模型1組的FBG水平高于模型2組（P < 0.05），同時FSI水平低于模型2組（P < 0.05）。提示模型組大鼠均出現了明顯的高血糖和高胰島素血癥為特征的胰島素抵抗。
表1
各組大鼠FBG、FSI及ISI的比較
Table1.
Comparison of FBG, FSI, and ISI levels in each group
2.3 各組大鼠TG及TC檢測結果
與對照組比較，兩模型組大鼠的血TG和TC水平均明顯升高（P < 0.05），而兩模型組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 2。
表2
各組大鼠TG及TC水平的比較（3 討論
目前，構建糖尿病大鼠模型的方法主要有自發性糖尿病動物模型[8]、轉基因/基因敲除糖尿病動物模型[9]和STZ與飲食協同作用所致糖尿病動物模型[10]。但前兩者由于存在來源相對減少、飼養和繁殖條件要求嚴格、動物價格昂貴等缺點，限制了其在科學研究中的廣泛應用和普及。目前，國內外最常用的是STZ與飲食協同作用所致糖尿病動物模型。本研究采用高脂高糖飼料喂養結合小劑量STZ注射的方法成功建立了2型糖尿病大鼠模型，為糖尿病及其并發癥的發病機理、預防、診斷及治療的研究提供理想的動物實驗技術平臺。高脂高糖飲食是誘發2型糖尿病及胰島素抵抗的重要因素[11]。高脂高糖飲食導致體內糖脂代謝紊亂，通過糖脂肪酸循環、胰島素信號傳導等多個途徑抑制糖儲存，降低胰島素敏感性，進而導致胰島素抵抗的發生。STZ對胰島β細胞具有高度選擇性毒性作用，通過自由基損傷胰島β細胞，使其發生功能障礙，胰島素合成減少，引發糖尿病[12-13]。高脂高糖飼料喂養結合小劑量STZ注射方法建立的動物模型更接近人類2型糖尿病的特點。
在本研究中，模型1組大鼠經高脂高糖喂養4周后，50 mg/kg STZ腹腔注射，成模率為75%，但是死亡率亦高，達25%；其中4只死亡大鼠經解剖發現，其腎臟和脾臟有瘀血，臟器變小，推測可能是由于大劑量的STZ損傷了腎臟和脾臟，最后導致大鼠的死亡；另1只大鼠在成模后死亡，系高血糖形成酮癥酸中毒所致。研究[14-15]表明，單純的高脂高糖飼料喂養可以使動物血糖升高，但需要很長時間，至少要6個月到1年以上。如果一次性大劑量注射STZ，則直接損傷胰島β細胞，則更傾向于1型糖尿病的表型特點，影響研究結果，而且死亡率明顯增高[16-17]。因此不建議一次性大劑量注射STZ。本研究中的模型2組大鼠經高脂高糖喂養4周后，予以35 mg/kg STZ腹腔注射，成模率增高，達85%，模型穩定，無大鼠死亡，是理想的2型糖尿病模型；其中有3只大鼠未成模，其原因系注射部位選擇不當，導致藥物誤入皮下，從而降低了成模率。高脂飲食誘導時間延長，動物肥胖和胰島素抵抗更加明顯，加重了胰島素分泌功能的負擔，故所需STZ劑量減少。小劑量（30 mg/kg）注射STZ可激活機體免疫系統，誘導胰島的免疫反應，產生更接近于2型糖尿病的模型[18]。Zhou等[19]發現，高脂高糖喂養4周后腹腔注射STZ 40 mg/kg，成模率為72.2%；張玉領等[6]發現，高脂高糖喂養4周后，待大鼠出現明顯的肥胖和胰島素抵抗時，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，可成功制備2型糖尿病大鼠模型；施紅等[20]發現，高脂高糖喂養6周后加一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，可成功制備空腹和隨機血糖均升高、糖耐量減低及高血脂的2型糖尿病大鼠模型。本研究考慮到動物的年齡以及造模后續的實驗還需要一定的時間，因此選擇了高脂高糖飼養時間為4周，予以35 mg/kg STZ腹腔注射成功建立了2型糖尿病大鼠模型。綜上所述，高脂高糖喂養4周后，一次性腹腔注射STZ 30～40 mg/kg，均可成功制備2型糖尿病大鼠模型。
對于成功建立SD大鼠2型糖尿病模型，筆者有以下幾點體會：①STZ必須保存于-20℃冰箱中，現配現用，配好的檸檬酸緩沖溶液和STZ溶液應避光冰浴，30 min內用完；0.1 mol/L、pH4.2～4.5的檸檬酸緩沖液可作為STZ理想的溶劑。②注射STZ前，對大鼠禁食不禁水12 h以上，可提高成模率；注射STZ后，應觀察2 h左右，給予充足的飲水和食物；STZ注射在腹腔的固定一側，可保證相同實驗條件，成模后血糖數據均一穩定。③腹腔注射時抓住大鼠頭朝下，腹腔朝上，使內臟移向上腹，避免注射入其他臟器內[21]；另外，還要注意注射部位的適當選擇，避免藥物誤入皮下、降低成模率。④STZ誘導糖尿病大鼠模型有性別差異。Morimoto等[22]發現，雄性大鼠制備模型的成模率明顯高于雌性大鼠。另外，選擇成年雄性，可避免因受孕而影響觀測數據。蔣升等[23]發現，雄性大鼠腹腔注射STZ后14 d血糖穩定，而雌鼠4周后血糖才穩定，而且成年后的雌激素對糖脂代謝會產生一定的影響。因此選擇雄鼠造模對后續實驗干擾更少。⑤大鼠對于STZ的敏感性有年齡依賴性，成鼠或大體質量鼠較幼鼠或小體質量鼠的成模率高[24]。因此，本研究選擇了成年雄性大鼠，體質量均大于180 g。⑥在動物飼養期間，一定要保證供水充足；由于成模動物排尿量增多，每天應更換墊料1～2次，保持干燥。
本研究結果所示，高脂高糖喂養4周后，一次性腹腔注射35 mg/kg STZ制備的2型糖尿病大鼠模型成模率高，安全性強，模型穩定。由于2型糖尿病大鼠模型的成模率受各種因素的影響，因此，仍需探索一個合適的STZ注射劑量，建立更長期穩定的2型糖尿病大鼠模型，方能為糖尿病新藥的開發及其慢性并發癥的研究提供更理想的動物實驗技術平臺。
糖尿病是嚴重危害人類健康的慢性疾病之一。近年來，隨著老齡人口的增加、人民生活水平的提高以及飲食結構的改變，糖尿病的發病率呈逐年上升趨勢，成為繼心血管、腫瘤疾病以后的第3號健康殺手。目前，全球約有1.5億人患有糖尿病，其中90%以上是2型糖尿病[1]，其發病機理尚未完全闡明。因此，建立合適的2型糖尿病動物模型，對研究其病因、發病機理、完善預防及臨床治療具有重要意義。國內外研究[2-4]一致表明，制備2型糖尿病大鼠模型可通過高脂飲食誘導大鼠胰島素抵抗后，再注射低劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）損傷胰島功能，引起血糖升高，可模擬2型糖尿病的發病過程。本研究以SD大鼠作為實驗動物，觀察不同劑量的STZ對模型建立的影響，以選取最佳劑量來誘導產生糖尿病大鼠模型，為糖尿病及其并發癥的研究提供理想的動物實驗技術平臺。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SPF級雄性Sprague Dawley（SD）大鼠60只，6周齡，體質量180～200 g，購于武漢大學動物實驗中心，動物合格證號：42000600002150，使用證號：0012272。室內通風良好，室溫20～25℃，相對濕度40%～70%，每日光照12 h，自由攝食飲水。
1.2 飼料
高脂高糖飼料按照以往文獻[5-7]報道的配方做部分調整，成分如下：20.0%豬油、15.0%蔗糖、2.5%膽固醇、0.4%膽酸鈉及62.0%常規飼料。
1.3 儀器與試劑
STZ（美國Sigma公司），大鼠胰島素放射免疫方法試劑盒（碧云天生物技術公司），大鼠總膽固醇試劑盒和甘油三酯試劑盒（武漢凌飛科技公司）。檸檬酸（批號：20120521）及檸檬酸鈉（批號：20120509）購自武漢潔美試劑公司。穩豪One-Touch血糖測量儀及試紙（美國強生公司）。STZ溶液的配制方法：將STZ溶解于0.1 mol/L（pH4.4）檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，新鮮配制成1% STZ溶液。STZ必須保存于-20℃冰箱，現配現用，配好的檸檬酸緩沖溶液和STZ溶液應避光冰浴，30 min內用完。
1.4 動物分組與模型建立
高脂高糖喂養4周，將大鼠按隨機數字表法隨機分為3組：①對照組，20只，腹腔注射檸檬酸50 mg/kg，普通飼料喂養。②糖尿病造模組，根據腹腔注射STZ劑量的不同，分為了2個組，各20只，分別腹腔注射STZ 50 mg/kg或35 mg/kg（模型1組及模型2組），注射后3 d取尾靜脈血檢測大鼠血糖，以空腹血糖值≥16.7 mmol/L，并穩定10 d，則為大鼠糖尿病造模成功。
1.5 觀察指標及方法
1.5.1 大鼠一般情況及存活情況觀察
每天觀察大鼠進食量、飲水量、排尿量及死亡情況，每隔1～2周稱重。
1.5.2 血生化指標檢測
糖尿病大鼠模型建好后，大鼠禁食不禁水12 h后剪尾取血檢測大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）及空腹血清胰島素（fasting serum insulin，FSI）水平，采用大鼠ELISA試劑盒檢測，并計算胰島素敏感指數（insulin sensetivity index，ISI）。同時采用日立8060全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇（TC）及甘油三酯（TG）水平。
1.6 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 各組大鼠一般情況及存活情況觀察結果
實驗期間，對照組大鼠體質量無明顯變化，精神狀況良好，雙目有神，反應敏捷，毛發有光澤，無糖尿病臨床表現（成模率為0），也無死亡。兩模型組大鼠體質量逐漸增加，注射STZ后則出現生長遲緩、身體消瘦、精神萎靡、倦怠懶動、嗜睡、反應遲鈍、臀尾出汗潮濕、臀毛枯黃、拉尾排便，伴有多食、多飲、多尿等典型的糖尿病臨床表現；其中模型1組的糖尿病成模率為75%（15/20），死亡率為25%（5/20），其中4只大鼠在注射STZ 24 h后死亡，經解剖發現，其腎臟和脾臟有瘀血，臟器變小，推測可能是由于大劑量的STZ損傷了腎臟和脾臟，最后導致大鼠的死亡；另1只大鼠在注射STZ 3 d后死亡，系高血糖形成酮癥酸中毒所致。而模型2組的糖尿病成模率為85%（17/20），死亡率為0，分別高于或低于模型1組（P < 0.05）。
2.2 各組大鼠FBG、FINS及ISI檢測結果
結果見表 1。由表 1可見，兩模型組大鼠的FBG及FSI水平均明顯高于對照組（P < 0.05），ISI則低于對照組（P < 0.05）；模型1組的FBG水平高于模型2組（P < 0.05），同時FSI水平低于模型2組（P < 0.05）。提示模型組大鼠均出現了明顯的高血糖和高胰島素血癥為特征的胰島素抵抗。
表1
各組大鼠FBG、FSI及ISI的比較
Table1.
Comparison of FBG, FSI, and ISI levels in each group
2.3 各組大鼠TG及TC檢測結果
與對照組比較，兩模型組大鼠的血TG和TC水平均明顯升高（P < 0.05），而兩模型組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 2。
表2
各組大鼠TG及TC水平的比較（3 討論
目前，構建糖尿病大鼠模型的方法主要有自發性糖尿病動物模型[8]、轉基因/基因敲除糖尿病動物模型[9]和STZ與飲食協同作用所致糖尿病動物模型[10]。但前兩者由于存在來源相對減少、飼養和繁殖條件要求嚴格、動物價格昂貴等缺點，限制了其在科學研究中的廣泛應用和普及。目前，國內外最常用的是STZ與飲食協同作用所致糖尿病動物模型。本研究采用高脂高糖飼料喂養結合小劑量STZ注射的方法成功建立了2型糖尿病大鼠模型，為糖尿病及其并發癥的發病機理、預防、診斷及治療的研究提供理想的動物實驗技術平臺。高脂高糖飲食是誘發2型糖尿病及胰島素抵抗的重要因素[11]。高脂高糖飲食導致體內糖脂代謝紊亂，通過糖脂肪酸循環、胰島素信號傳導等多個途徑抑制糖儲存，降低胰島素敏感性，進而導致胰島素抵抗的發生。STZ對胰島β細胞具有高度選擇性毒性作用，通過自由基損傷胰島β細胞，使其發生功能障礙，胰島素合成減少，引發糖尿病[12-13]。高脂高糖飼料喂養結合小劑量STZ注射方法建立的動物模型更接近人類2型糖尿病的特點。
在本研究中，模型1組大鼠經高脂高糖喂養4周后，50 mg/kg STZ腹腔注射，成模率為75%，但是死亡率亦高，達25%；其中4只死亡大鼠經解剖發現，其腎臟和脾臟有瘀血，臟器變小，推測可能是由于大劑量的STZ損傷了腎臟和脾臟，最后導致大鼠的死亡；另1只大鼠在成模后死亡，系高血糖形成酮癥酸中毒所致。研究[14-15]表明，單純的高脂高糖飼料喂養可以使動物血糖升高，但需要很長時間，至少要6個月到1年以上。如果一次性大劑量注射STZ，則直接損傷胰島β細胞，則更傾向于1型糖尿病的表型特點，影響研究結果，而且死亡率明顯增高[16-17]。因此不建議一次性大劑量注射STZ。本研究中的模型2組大鼠經高脂高糖喂養4周后，予以35 mg/kg STZ腹腔注射，成模率增高，達85%，模型穩定，無大鼠死亡，是理想的2型糖尿病模型；其中有3只大鼠未成模，其原因系注射部位選擇不當，導致藥物誤入皮下，從而降低了成模率。高脂飲食誘導時間延長，動物肥胖和胰島素抵抗更加明顯，加重了胰島素分泌功能的負擔，故所需STZ劑量減少。小劑量（30 mg/kg）注射STZ可激活機體免疫系統，誘導胰島的免疫反應，產生更接近于2型糖尿病的模型[18]。Zhou等[19]發現，高脂高糖喂養4周后腹腔注射STZ 40 mg/kg，成模率為72.2%；張玉領等[6]發現，高脂高糖喂養4周后，待大鼠出現明顯的肥胖和胰島素抵抗時，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，可成功制備2型糖尿病大鼠模型；施紅等[20]發現，高脂高糖喂養6周后加一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，可成功制備空腹和隨機血糖均升高、糖耐量減低及高血脂的2型糖尿病大鼠模型。本研究考慮到動物的年齡以及造模后續的實驗還需要一定的時間，因此選擇了高脂高糖飼養時間為4周，予以35 mg/kg STZ腹腔注射成功建立了2型糖尿病大鼠模型。綜上所述，高脂高糖喂養4周后，一次性腹腔注射STZ 30～40 mg/kg，均可成功制備2型糖尿病大鼠模型。
對于成功建立SD大鼠2型糖尿病模型，筆者有以下幾點體會：①STZ必須保存于-20℃冰箱中，現配現用，配好的檸檬酸緩沖溶液和STZ溶液應避光冰浴，30 min內用完；0.1 mol/L、pH4.2～4.5的檸檬酸緩沖液可作為STZ理想的溶劑。②注射STZ前，對大鼠禁食不禁水12 h以上，可提高成模率；注射STZ后，應觀察2 h左右，給予充足的飲水和食物；STZ注射在腹腔的固定一側，可保證相同實驗條件，成模后血糖數據均一穩定。③腹腔注射時抓住大鼠頭朝下，腹腔朝上，使內臟移向上腹，避免注射入其他臟器內[21]；另外，還要注意注射部位的適當選擇，避免藥物誤入皮下、降低成模率。④STZ誘導糖尿病大鼠模型有性別差異。Morimoto等[22]發現，雄性大鼠制備模型的成模率明顯高于雌性大鼠。另外，選擇成年雄性，可避免因受孕而影響觀測數據。蔣升等[23]發現，雄性大鼠腹腔注射STZ后14 d血糖穩定，而雌鼠4周后血糖才穩定，而且成年后的雌激素對糖脂代謝會產生一定的影響。因此選擇雄鼠造模對后續實驗干擾更少。⑤大鼠對于STZ的敏感性有年齡依賴性，成鼠或大體質量鼠較幼鼠或小體質量鼠的成模率高[24]。因此，本研究選擇了成年雄性大鼠，體質量均大于180 g。⑥在動物飼養期間，一定要保證供水充足；由于成模動物排尿量增多，每天應更換墊料1～2次，保持干燥。
本研究結果所示，高脂高糖喂養4周后，一次性腹腔注射35 mg/kg STZ制備的2型糖尿病大鼠模型成模率高，安全性強，模型穩定。由于2型糖尿病大鼠模型的成模率受各種因素的影響，因此，仍需探索一個合適的STZ注射劑量，建立更長期穩定的2型糖尿病大鼠模型，方能為糖尿病新藥的開發及其慢性并發癥的研究提供更理想的動物實驗技術平臺。
