引用本文： 羅偉, 李煒曄, 秦紅軍, 胡仁健, 胡紅強, 李昂. 人外周血內皮細胞與大鼠胰島共移植改善胰島的存活和功能. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(10): 1222-1225. doi: 10.7507/1007-9424.20140293 復制
胰島移植用于治療1型糖尿病（T1DM）目前被認為是唯一可行的方法。目前，臨床人胰島移植方案面臨兩個障礙：供源不足和移植后移植物的丟失及功能障礙，因此需要尋找能夠保持移植物長期存活并能發揮功能的方法。2000年，Shapiro等[1]通過埃德蒙頓（Edmonton）方案對T1DM患者進行胰島移植治療，90%的患者在1年后即可完全脫離胰島素。雖然與之前的治療效果相比得到改善，但長期效果仍不盡人意，移植5年后只有40%～50%的患者脫離外源胰島素[2-3]。有研究[4-6]表明，在移植后的當天有高于50%的移植物凋亡，而且其具體的凋亡機理尚不十分清楚。為了應對這種因早期胰島細胞凋亡而需要移植大量的胰島[7]，從而進一步加大了供源緊張的問題，因此需要一種能夠保持移植物的早期功能和存活的方案是非常有必要的。
胰島與大鼠主動脈內皮細胞的共移植能夠改善移植物的存活及功能[8]；人內皮祖細胞（EPCs）能夠促進豬胰島移植后新生血管的重建[9]。其原理可能是由于移植后移植物新生血管的形成能快速供給足量的氧氣和養分，進而促進其存活并發揮功能。EPCs在骨髓中生成，經動員后進入血液，在特定培養環境下分化成為成熟的內皮細胞。EPCs既參與血管生成，也參與機體和器官損傷后的血管修復與新生，在心腦血管疾病、神經創傷修復、組織工程等方面均發揮重要作用，具有廣闊的應用前景[10-13]。人外周血內皮細胞是EPCs生長晚期的一種細胞[14]，能夠參與形成新的血管并且提供營養支持[15-16]。此外，人外周血內皮細胞的獲取非常方便，分離方法成熟。本研究通過人外周血內皮細胞與大鼠胰島細胞共移植到糖尿病裸鼠腎包膜下，以觀察其對移植胰島存活和功能發揮的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要設備及試劑
①實驗動物：雄性SD大鼠10只，體質量（180±20）g，雄性裸鼠15只，體質量（25±2）g，均由四川大學實驗動物中心提供(動物合格證號：川醫實驗動物準字010）。②儀器與試劑：倒置相差顯微鏡（Olympus IX 50，日本），熒光倒置相差顯微鏡（Olympus IX 71，日本），低溫離心機（Sorvall，Legend RT，美國），超凈工作臺（Nuaire NU-425-400E，美國），Ⅳ型膠原蛋白酶（Sigma，USA），牛血清白蛋白（BSA，Sigma，USA），聚蔗糖400（Ficoll-400，天津市聚合科貿有限公司），苯二硫腙（Dithizone，DTZ，成都試劑廠），二醋酸酯熒光素（FDA）及碘化丙啶(propidium iodide，PI）均購自阿拉丁試劑上海有限公司，人淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），C肽試劑盒(優爾生公司，武漢）
1.2 方法
1.2.1 裸鼠糖尿病模型的建立
裸鼠在造模前禁食16 h，自由飲水，將現配的鏈脲菌素（Sigma公司）檸檬酸緩沖液溶液（40 mg/mL）在5 min之內按160 mg/kg的劑量經腹腔注入裸鼠體內，次日開始檢測血糖，1周后連續2 d的空腹血糖水平>11.1 mmol/L，則提示糖尿病建模成功。
1.2.2 SD大鼠胰島的分離及純化
采用侯凌等[17]的方法：SD大鼠在胰島分離前禁食16 h，開腹經膽總管原位灌注Ⅳ型膠原蛋白酶（0.5 mg/mL）10 mL，37℃水浴消化12 min，消化完畢后用Ficoll-400非連續密度梯度法純化胰島，然后通過DTZ染色鑒定胰島細胞的純度并計算胰島當量（IEQ）。
1.2.3 胰島活性檢測
取100 IEQ的胰島細胞加入20μl FDA/PI混合溶液，室溫避光反應10 min，用PBS緩沖液洗滌3次后，于Olympus IX71熒光顯微鏡下觀察，綠色FDA熒光指示活細胞，紅色PI熒光指示死亡細胞，成像系統采集圖像，通過綠色面積/紅色面積計算胰島成活率。
1.2.4 人外周血內皮細胞的分離培養
取正常人（健康自愿者）外周血10 mL，采用郭新賓等[18]的方法：密度梯度離心獲得單個核細胞，經體外誘導培養后獲得人外周血內皮細胞。將第6代細胞保存于液氮中待用。
1.2.5 胰島移植
將胰島/人外周血內皮細胞用不含血清的PBS清洗2次，并重懸于100μL不含血清的PBS后吸到連有頭皮針的1 mL注射器內，使胰島沉在近針頭處。糖尿病裸鼠經乙醚麻醉后，取季肋處切口0.5 cm長暴露左側腎臟并固定，將胰島注入腎包膜內，縫合切口。為了驗證共移植的人外周血內皮細胞對移植的胰島有保護作用，首先建立糖尿病極限移植模型，即分別移植600、300及150 IEQ的胰島在糖尿病小鼠的腎包膜下，觀察小鼠的血糖控制情況，找到移植胰島的極限量。正常裸鼠不作任何處理作為正常組；對照組：將胰島細胞用不含血清的Hank液重懸；實驗組：將5×105個人外周血內皮細胞與胰島細胞共同重懸在不含血清的Hank液中，移植在糖尿病小鼠的左腎包膜下。然后分別于移植后3、7、14、21及28 d測定糖尿病裸鼠的空腹血糖和體質量。
1.2.6 移植后胰島功能鑒定
為驗證移植胰島功能，在移植后第28天3組裸鼠進行腹腔葡萄糖耐量試驗（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）。實驗前動物禁食12 h，監測空腹血糖，然后腹腔內注射葡萄糖溶液（0.5 g/kg），分別于注射后5、10、20、30、45、60、90和120 min取裸鼠尾靜脈血測定血糖水平。
1.2.7 外周血C肽水平的測定
在移植后的第28天，胰島移植受體經乙醚麻醉后心臟取血1 mL，1 940×g離心10 min分離血清，并用C肽試劑盒檢測C肽含量。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13統計軟件，結果用均數±標準差（
2 結果
2.1 胰島的純度及活性
胰島細胞經DTZ染色后絕大部分呈特異性紅色，幾乎沒有腺泡組織，胰島細胞不粘連成團，獲取的胰島純度>90%（圖 1A）。經雙熒光染色（PI/FDA）見絕大多數胰島為綠色，僅見少量點狀紅色。新鮮分離的胰島存活率為>95%（圖 1B）。
圖1
示胰島細胞純度及活性鑒定結果。1A：胰島純度；1B：胰島活性
Figure1.
The identification results of purity and activity of islet cells. 1A:Islet purity; 1B:Islet viability
2.2 移植后血糖及體質量控制情況
移植600 IEQ的小鼠能夠很好地控制血糖，而移植300 IEQ的小鼠能夠保持血糖正常7 d，移植150 IEQ的小鼠依然保持高血糖（圖 2A）。提示300 IEQ是胰島移植的極限移植量。每周檢測2次空腹血糖。結果顯示，實驗組裸鼠能夠保持血糖正常長達28 d，第28天處死動物前1 h取下左腎后血糖明顯升高，而對照組裸鼠僅能保持血糖正常7 d（圖 2B）；移植后實驗組裸鼠體質量緩慢增加，而對照組裸鼠體質量逐漸降低（圖 3），P < 0.05；正常組裸鼠血糖正常，體質量逐漸增加。
圖2
胰島移植后小鼠血糖水平檢測結果。2A：移植不同量的胰島后血糖檢測結果；2B：各組血糖檢測結果，圖中黑箭表示摘除移植受體左腎后的血糖，與對照組比較，# P < 0.01??圖 3?各組小鼠體質量檢測結果，與對照組比較，# P < 0.01
Figure2.
The detection results of blood glucose in mice after islet transplantation. 2A:The results of blood glucose detection of different quantity of islets after transplantation; 2B:Each group of blood glucose testing results, the black arrow indicates blood glucose after removal of the left kidney transplant recipients; Compared with the control group, # P < 0.01??Figure 3?Body mass of mice test results in each group. Compared with the control group, # P < 0.01
2.3 移植物功能檢測結果
IPGTT結果顯示，在移植后的第28天，實驗組裸鼠各時間點的血糖水平均明顯低于對照組（P<0.01），提示受者糖耐量情況得到有效改善，移植后的胰島對血糖直接的調節能力得到了有效糾正（圖 4）。
圖4
示各組移植后第28天IPGTT實驗結果
Figure4.
result of IPGTT on 28 days after transplantatio in each group
2.4 外周血C肽水平檢測結果
移植后第28天，外周血C肽水平實驗組明顯高于對照組（P < 0.01），但與正常組相比差異無統計學意義（P > 0.05），提示人外周血內皮細胞對移植胰島具有保護作用（圖 5）。
圖5
示各組移植后第28天C肽水平檢測結果
Figure5.
The detection results of C-peptide level on 28 days after transplantation in each group
3 討論
當前臨床胰島移植治療T1DM主要面臨兩大問題，即供源不足和移植后移植物的丟失及功能障礙。早期的移植物失功導致了T1DM患者在接受胰島移植后不能長期控制葡萄糖的代謝[5-6]，而且，胰島移植需要多個供體，進而導致供源短缺的問題。因此，改善當前胰島移植的方案是很有必要的。眾所周知，除了免疫因素外，缺氧也是誘導胰島細胞移植后早期凋亡的重要因素。由于胰島本身沒有血管，沒有營養供給，因此移植后早期移植的胰島對氧特別敏感，缺氧能夠導致大量的胰島細胞凋亡。移植后血管重建顯得非常必要。
之前有文獻[8-9, 19]報道表明，不同來源的內皮細胞均能夠促進移植的β細胞存活及其功能的發揮。本研究將成年人外周血內皮細胞與新鮮分離的SD大鼠的胰島細胞共移植給裸鼠，結果顯示，移植受體的血漿C肽水平明顯升高，移植胰島的存活時間延長，其對血糖的控制得到了改善。提示人外周血內皮細胞能夠改善裸鼠移植胰島的生存，這可能是共移植后內皮細胞促進了新生血管的生成所致。
目前，通過從人外周血分離的內皮細胞并與胰島共移植能夠起到逆轉糖尿病的效果。自體外周血內皮細胞的使用可以避免來自受體的免疫反應，其他的內皮細胞如肝內皮細胞[20]，似乎具有抗原呈遞能力，導致特異性的T細胞耐受，有實驗[21]顯示，間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）也具有這一特性。但是外周血內皮細胞對于外源性胰島細胞是否顯示了同樣的免疫耐受或者相反增強了移植胰島細胞的免疫原性尚不清楚。此外，人外周血內皮細胞對移植胰島的作用在代謝和免疫原性水平的結果以及其促進移植胰島的存活和功能發揮的機理還需要再進一步驗證。
胰島移植用于治療1型糖尿病（T1DM）目前被認為是唯一可行的方法。目前，臨床人胰島移植方案面臨兩個障礙：供源不足和移植后移植物的丟失及功能障礙，因此需要尋找能夠保持移植物長期存活并能發揮功能的方法。2000年，Shapiro等[1]通過埃德蒙頓（Edmonton）方案對T1DM患者進行胰島移植治療，90%的患者在1年后即可完全脫離胰島素。雖然與之前的治療效果相比得到改善，但長期效果仍不盡人意，移植5年后只有40%～50%的患者脫離外源胰島素[2-3]。有研究[4-6]表明，在移植后的當天有高于50%的移植物凋亡，而且其具體的凋亡機理尚不十分清楚。為了應對這種因早期胰島細胞凋亡而需要移植大量的胰島[7]，從而進一步加大了供源緊張的問題，因此需要一種能夠保持移植物的早期功能和存活的方案是非常有必要的。
胰島與大鼠主動脈內皮細胞的共移植能夠改善移植物的存活及功能[8]；人內皮祖細胞（EPCs）能夠促進豬胰島移植后新生血管的重建[9]。其原理可能是由于移植后移植物新生血管的形成能快速供給足量的氧氣和養分，進而促進其存活并發揮功能。EPCs在骨髓中生成，經動員后進入血液，在特定培養環境下分化成為成熟的內皮細胞。EPCs既參與血管生成，也參與機體和器官損傷后的血管修復與新生，在心腦血管疾病、神經創傷修復、組織工程等方面均發揮重要作用，具有廣闊的應用前景[10-13]。人外周血內皮細胞是EPCs生長晚期的一種細胞[14]，能夠參與形成新的血管并且提供營養支持[15-16]。此外，人外周血內皮細胞的獲取非常方便，分離方法成熟。本研究通過人外周血內皮細胞與大鼠胰島細胞共移植到糖尿病裸鼠腎包膜下，以觀察其對移植胰島存活和功能發揮的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要設備及試劑
①實驗動物：雄性SD大鼠10只，體質量（180±20）g，雄性裸鼠15只，體質量（25±2）g，均由四川大學實驗動物中心提供(動物合格證號：川醫實驗動物準字010）。②儀器與試劑：倒置相差顯微鏡（Olympus IX 50，日本），熒光倒置相差顯微鏡（Olympus IX 71，日本），低溫離心機（Sorvall，Legend RT，美國），超凈工作臺（Nuaire NU-425-400E，美國），Ⅳ型膠原蛋白酶（Sigma，USA），牛血清白蛋白（BSA，Sigma，USA），聚蔗糖400（Ficoll-400，天津市聚合科貿有限公司），苯二硫腙（Dithizone，DTZ，成都試劑廠），二醋酸酯熒光素（FDA）及碘化丙啶(propidium iodide，PI）均購自阿拉丁試劑上海有限公司，人淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），C肽試劑盒(優爾生公司，武漢）
1.2 方法
1.2.1 裸鼠糖尿病模型的建立
裸鼠在造模前禁食16 h，自由飲水，將現配的鏈脲菌素（Sigma公司）檸檬酸緩沖液溶液（40 mg/mL）在5 min之內按160 mg/kg的劑量經腹腔注入裸鼠體內，次日開始檢測血糖，1周后連續2 d的空腹血糖水平>11.1 mmol/L，則提示糖尿病建模成功。
1.2.2 SD大鼠胰島的分離及純化
采用侯凌等[17]的方法：SD大鼠在胰島分離前禁食16 h，開腹經膽總管原位灌注Ⅳ型膠原蛋白酶（0.5 mg/mL）10 mL，37℃水浴消化12 min，消化完畢后用Ficoll-400非連續密度梯度法純化胰島，然后通過DTZ染色鑒定胰島細胞的純度并計算胰島當量（IEQ）。
1.2.3 胰島活性檢測
取100 IEQ的胰島細胞加入20μl FDA/PI混合溶液，室溫避光反應10 min，用PBS緩沖液洗滌3次后，于Olympus IX71熒光顯微鏡下觀察，綠色FDA熒光指示活細胞，紅色PI熒光指示死亡細胞，成像系統采集圖像，通過綠色面積/紅色面積計算胰島成活率。
1.2.4 人外周血內皮細胞的分離培養
取正常人（健康自愿者）外周血10 mL，采用郭新賓等[18]的方法：密度梯度離心獲得單個核細胞，經體外誘導培養后獲得人外周血內皮細胞。將第6代細胞保存于液氮中待用。
1.2.5 胰島移植
將胰島/人外周血內皮細胞用不含血清的PBS清洗2次，并重懸于100μL不含血清的PBS后吸到連有頭皮針的1 mL注射器內，使胰島沉在近針頭處。糖尿病裸鼠經乙醚麻醉后，取季肋處切口0.5 cm長暴露左側腎臟并固定，將胰島注入腎包膜內，縫合切口。為了驗證共移植的人外周血內皮細胞對移植的胰島有保護作用，首先建立糖尿病極限移植模型，即分別移植600、300及150 IEQ的胰島在糖尿病小鼠的腎包膜下，觀察小鼠的血糖控制情況，找到移植胰島的極限量。正常裸鼠不作任何處理作為正常組；對照組：將胰島細胞用不含血清的Hank液重懸；實驗組：將5×105個人外周血內皮細胞與胰島細胞共同重懸在不含血清的Hank液中，移植在糖尿病小鼠的左腎包膜下。然后分別于移植后3、7、14、21及28 d測定糖尿病裸鼠的空腹血糖和體質量。
1.2.6 移植后胰島功能鑒定
為驗證移植胰島功能，在移植后第28天3組裸鼠進行腹腔葡萄糖耐量試驗（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）。實驗前動物禁食12 h，監測空腹血糖，然后腹腔內注射葡萄糖溶液（0.5 g/kg），分別于注射后5、10、20、30、45、60、90和120 min取裸鼠尾靜脈血測定血糖水平。
1.2.7 外周血C肽水平的測定
在移植后的第28天，胰島移植受體經乙醚麻醉后心臟取血1 mL，1 940×g離心10 min分離血清，并用C肽試劑盒檢測C肽含量。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13統計軟件，結果用均數±標準差（
2 結果
2.1 胰島的純度及活性
胰島細胞經DTZ染色后絕大部分呈特異性紅色，幾乎沒有腺泡組織，胰島細胞不粘連成團，獲取的胰島純度>90%（圖 1A）。經雙熒光染色（PI/FDA）見絕大多數胰島為綠色，僅見少量點狀紅色。新鮮分離的胰島存活率為>95%（圖 1B）。
圖1
示胰島細胞純度及活性鑒定結果。1A：胰島純度；1B：胰島活性
Figure1.
The identification results of purity and activity of islet cells. 1A:Islet purity; 1B:Islet viability
2.2 移植后血糖及體質量控制情況
移植600 IEQ的小鼠能夠很好地控制血糖，而移植300 IEQ的小鼠能夠保持血糖正常7 d，移植150 IEQ的小鼠依然保持高血糖（圖 2A）。提示300 IEQ是胰島移植的極限移植量。每周檢測2次空腹血糖。結果顯示，實驗組裸鼠能夠保持血糖正常長達28 d，第28天處死動物前1 h取下左腎后血糖明顯升高，而對照組裸鼠僅能保持血糖正常7 d（圖 2B）；移植后實驗組裸鼠體質量緩慢增加，而對照組裸鼠體質量逐漸降低（圖 3），P < 0.05；正常組裸鼠血糖正常，體質量逐漸增加。
圖2
胰島移植后小鼠血糖水平檢測結果。2A：移植不同量的胰島后血糖檢測結果；2B：各組血糖檢測結果，圖中黑箭表示摘除移植受體左腎后的血糖，與對照組比較，# P < 0.01??圖 3?各組小鼠體質量檢測結果，與對照組比較，# P < 0.01
Figure2.
The detection results of blood glucose in mice after islet transplantation. 2A:The results of blood glucose detection of different quantity of islets after transplantation; 2B:Each group of blood glucose testing results, the black arrow indicates blood glucose after removal of the left kidney transplant recipients; Compared with the control group, # P < 0.01??Figure 3?Body mass of mice test results in each group. Compared with the control group, # P < 0.01
2.3 移植物功能檢測結果
IPGTT結果顯示，在移植后的第28天，實驗組裸鼠各時間點的血糖水平均明顯低于對照組（P<0.01），提示受者糖耐量情況得到有效改善，移植后的胰島對血糖直接的調節能力得到了有效糾正（圖 4）。
圖4
示各組移植后第28天IPGTT實驗結果
Figure4.
result of IPGTT on 28 days after transplantatio in each group
2.4 外周血C肽水平檢測結果
移植后第28天，外周血C肽水平實驗組明顯高于對照組（P < 0.01），但與正常組相比差異無統計學意義（P > 0.05），提示人外周血內皮細胞對移植胰島具有保護作用（圖 5）。
圖5
示各組移植后第28天C肽水平檢測結果
Figure5.
The detection results of C-peptide level on 28 days after transplantation in each group
3 討論
當前臨床胰島移植治療T1DM主要面臨兩大問題，即供源不足和移植后移植物的丟失及功能障礙。早期的移植物失功導致了T1DM患者在接受胰島移植后不能長期控制葡萄糖的代謝[5-6]，而且，胰島移植需要多個供體，進而導致供源短缺的問題。因此，改善當前胰島移植的方案是很有必要的。眾所周知，除了免疫因素外，缺氧也是誘導胰島細胞移植后早期凋亡的重要因素。由于胰島本身沒有血管，沒有營養供給，因此移植后早期移植的胰島對氧特別敏感，缺氧能夠導致大量的胰島細胞凋亡。移植后血管重建顯得非常必要。
之前有文獻[8-9, 19]報道表明，不同來源的內皮細胞均能夠促進移植的β細胞存活及其功能的發揮。本研究將成年人外周血內皮細胞與新鮮分離的SD大鼠的胰島細胞共移植給裸鼠，結果顯示，移植受體的血漿C肽水平明顯升高，移植胰島的存活時間延長，其對血糖的控制得到了改善。提示人外周血內皮細胞能夠改善裸鼠移植胰島的生存，這可能是共移植后內皮細胞促進了新生血管的生成所致。
目前，通過從人外周血分離的內皮細胞并與胰島共移植能夠起到逆轉糖尿病的效果。自體外周血內皮細胞的使用可以避免來自受體的免疫反應，其他的內皮細胞如肝內皮細胞[20]，似乎具有抗原呈遞能力，導致特異性的T細胞耐受，有實驗[21]顯示，間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）也具有這一特性。但是外周血內皮細胞對于外源性胰島細胞是否顯示了同樣的免疫耐受或者相反增強了移植胰島細胞的免疫原性尚不清楚。此外，人外周血內皮細胞對移植胰島的作用在代謝和免疫原性水平的結果以及其促進移植胰島的存活和功能發揮的機理還需要再進一步驗證。
