引用本文： 李文仿, 張丹峰, 王群, 趙宗彬, 王耕. 乳腺癌腫塊表面皮膚浸潤情況的臨床研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(8): 976-979. doi: 10.7507/1007-9424.20140235 復制
Fisher等[1]提出乳腺癌是一個全身性疾病，不同手術方式對乳腺癌生存率影響并不是很明顯。隨后，多個醫療機構的大樣本前瞻性試驗證實了傳統根治術同保乳手術在長期生存率方面無明顯差異，從而使得乳腺癌的手術治療模式由“可以耐受的最大治療”轉為“最小而有效的治療”[2]。保乳手術因為其良好的美容效果，在歐美國家得到廣泛開展，但確保手術邊緣無腫瘤殘留是手術成敗的關鍵[3]。目前隨著早中期乳腺癌乳腺再造手術的廣泛開展，在行乳腺癌手術治療的同時需要保留更多的乳腺皮膚，以利于乳腺癌手術后再造手術，但過多的乳腺腫瘤表面皮膚保留可能因皮膚早期浸潤而導致腫瘤復發[4]。人乳腺珠蛋白（human mammaglobin，hMAM）是子宮珠蛋白超家族成員之一，定位于11號染色體，具有乳腺組織特異性[5]。本研究通過巢式逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術檢測hMAM mRNA在乳腺癌組織中的表達，并檢測乳腺癌患者腫塊表面皮膚浸潤情況，以期判斷hMAM是否可為臨床乳腺癌患者手術皮膚切除范圍提供重要的臨床資料。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2012年12月至2013年1月期間湖北醫藥學院附屬太和醫院病例，所有患者均為青年女性。乳腺纖維腺瘤15例，年齡（18.3±3.2）歲。乳腺增生癥15例，年齡（36.3±7.3）歲。乳腺癌患者60例，年齡（44.5±6.3）歲；腫瘤分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期19例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例；腋窩淋巴結有轉移27例，無轉移33例。皮膚標本取自腫塊表面中央0.5 cm×0.5 cm大小，所有皮膚組織標本均無局部肉眼可見皮膚浸潤情況，所取皮膚深度約0.5 cm以內，凍存于液氮，備提取RNA用。
1.2 巢式RT-PCR方法檢測hMAM mRNA在不同乳腺（癌）組織中的表達及其相應腫塊表面皮膚浸潤情況
引物設計參照文獻[6]。hMAM引物序列均由上海生工技術服務有限公司合成。外引物：上游引物為5′-GAAGTTGCTGATGGTCCTCATGCTGGC-3′，下游引物為5′-CTCACCATACCCTGCAGTTCTGT-GAGC-3′；內引物：上游引物為5′-CTCCCAGCAC-TGCTACGCAGGCTC-3′，下游引物為5′-CACCTC-AACATTGCTCAGAGTTTCATCCG-3′；GAPDH為內參物，上游引物為5′-CCACCCATGGCAAATT-CCATGGCA-3′，下游引物為5′-TCTAGACGGCAG-GTAAGGTCCACC-3′。主要實驗步驟：Trizol抽提細胞總RNA，第一步采用RT-PCR，反應體系如下：AMV/Tfl5x反應緩沖液10 mL，外引物上游及下游引物各0.5 mmol/L，dNTP濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度2 mmol/L，AMV 0.1 U/μL，Tfl DNA poly-merase 0.1 U/μL，RNA 5μL，加去離子水至總反應體積50μL，48℃條件下45 min逆轉錄，94℃條件下2 min行AMV RT滅活及RNA/cDNA引物變性，PCR反應條件：94℃30 s，58℃1 min，68℃1.5 min，共35個循環，70℃條件下延伸7 min。巢式第二步反應體系如下：AMV/Tfl5x反應緩沖液10μL，內引物上游及下游引物各0.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+ 2 mmol/L，Tfl DNA polymerase 0.1 U/μL，反應中取第一次反應產物3μL，加無離子水至總體積50μL。PCR反應條件：94℃3 min，94℃30 s，59℃1 min，68℃1 min，35個循環，然后70℃條件下延伸7 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色顯示DNA條帶，紫外光下顯像，201 bp處出現DNA條帶時判斷為hMAM mRNA陽性結果。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0進行統計學分析。用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hMAM mRNA在不同乳腺（癌）組織中的表達情況
hMAM mRNA表達陽性率在乳腺纖維腺瘤組織中為40.00%（6/15），在乳腺增生組織中為53.33%（8/15），在乳腺癌組織中為83.33%（50/60），乳腺癌組織中hMAM mRNA表達陽性率較纖維腺瘤組織和乳腺增生組織明顯增高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。乳腺纖維腺瘤組織及乳腺增生組織表面皮膚均未檢測出hMAM mRNA表達。60例乳腺癌患者腫塊表面皮膚檢測出hMAM mRNA陽性表達3例。
2.2 乳腺癌患者腫塊表面皮膚中hMAM mRNA表達與臨床病理特征的關系
乳腺癌腫塊表面皮膚中hMAM mRNA表達與患者年齡、腫瘤直徑及腫瘤分期無關（P＞0.05），但在腋窩淋巴結有轉移及腫瘤距離乳頭中央距離＜4 cm患者中，hMAM mRNA表達陽性率明顯高于無腋窩淋巴結轉移及腫瘤距離乳頭中央距離≥4 cm者（P＜0.05）。見表 1。
表1
60例乳腺癌患者腫塊表面皮膚中hMAM mRNA表達與臨床病理特征的關系（例）
Table1.
Relationship of hMAM mRNA expression to clinicopathologic features in 60 patients with infiltration of breast cancer surface skin(case)
3 討論
hMAM在乳腺組織中特異性高表達，乳腺癌患者hMAM蛋白水平升高可能與腫瘤的形成、發展和轉移密切相關，而手術切除和（或）化療后hMAM蛋白水平降低[7]。研究[8]發現，在卵巢、子宮、肺、睪丸、前列腺、結腸、肝臟、大腦等組織均不表達，而幾乎專一表達在正常乳腺上皮和乳腺癌組織中，尤其在不同病理分級的乳腺癌組織中均可檢測到hMAM表達，這使得hMAM有一定的乳腺組織特異性。本組60例乳腺癌組織中hMAM mRNA表達陽性率為83.33%，明顯高于其在乳腺纖維腺瘤組織（40.00%）及乳腺增生組織（53.33%）中的表達陽性率，表明乳腺癌組織中hMAM mRNA高表達，而在乳腺良性疾病中表達較低。由于hMAM在乳腺癌組織中的特異性使得針對hMAM的乳腺癌靶向治療得以研究和開發，可以進一步增強乳腺癌治療的靶向性，以防造成對其他組織的傷害[9]。有文獻[10]報道，在乳腺癌患者非乳腺組織檢測出hMAM表達，這提示腫瘤細胞浸潤或轉移，乳腺癌患者外周血中檢出hMAM提示乳腺癌發生血液轉移，外周血中hMAM檢出與乳腺癌病理分期相關，在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌的外周血中hMAM檢出率為82.9%，而在Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者的外周血中hMAM檢出率為23.4%，而且外周血中hMAM檢出提示較低的生存率，是患者不良預后的指標。外周血中hMAM檢出也被用于乳腺癌患者存在循環腫瘤細胞的診斷，是患者無病生存率及總生存率較低的指標[5]。
從組織學發生來看，皮膚與乳腺組織發生于不同胚層，是完全不同的組織，乳腺癌腫塊表面的皮膚不會因為靠近乳腺癌組織而發生癌變，而且無論是血液循環還是淋巴結轉移途徑，皮膚均不是其轉移的靶點，但乳腺癌腫塊可突破腫塊與皮膚間的包膜，發生皮膚直接浸潤[11]。Lookingbill等[12]發現，有1.3%（92/7316）的乳腺癌患者在診斷時有腫塊表面皮膚受累，5.0%（367/7316）的患者有皮膚浸潤。Ho等[13]對30例全乳切除術的標本進行分析后發現，Ⅰ期乳腺癌皮膚受累率為0，Ⅱ期乳腺癌皮膚受累率為4%。本組60例乳腺癌患者腫塊表面皮膚檢出hMAM mRNA陽性表達共3例，浸潤率為5.00%（3/60），與文獻報道基本一致，而且均為臨床分期Ⅲ、Ⅳ期患者。本組在乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥良性乳腺疾病腫塊表面皮膚未檢出hMAM mRNA表達，這與皮膚與乳腺組織是發生于不同胚層的組織有關，雖然hMAM mRNA特異性表達于乳腺組織，乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥良性乳腺疾病腫塊中存在一定的hMAM mRNA表達，但乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥良性乳腺疾病乳腺細胞一般不會遷移到皮膚，故未檢出皮膚hMAM mRNA表達。乳腺癌再造手術需要盡可能保留皮膚及乳頭和乳暈復合體，這樣術后可保持乳腺對稱，形狀良好，還可減少術后疤痕形成，具有良好的美容效果，但如果皮膚或乳頭乳暈復合體有腫瘤浸潤則可導致術后復發和轉移[14]。
乳腺癌患者腋窩淋巴結轉移提示乳腺癌細胞已發生擴散，其腫瘤復發及發生轉移可能性明顯增高，治療效果不理想[15-16]。淋巴結轉移數目較多及具有較高的腫瘤級別患者，以及分子指標檢測雌激素受體陰性患者，具有極低的無病生存率[17]。本組研究結果表明，腋窩淋巴結轉移患者的乳腺癌腫塊表面皮膚更易發生癌細胞浸潤。文獻[18]報道，腫塊距離乳頭乳暈復合體小于3 cm患者更易發生乳頭乳暈復合體受累。本研究結果發現，乳腺癌腫塊距離乳頭中央距離小于4 cm的患者腫瘤更易發生局部皮膚浸潤，提示中央區乳腺癌患者手術時需盡可能切除較多乳腺腫瘤表面皮膚。
總之，本研究結果表明，hMAM mRNA表達在乳腺癌組織中明顯增高，可用作乳腺癌患者診斷的分子指標，而且乳腺癌患者中腫塊表面皮膚浸潤更多見于Ⅲ～Ⅳ期、腋窩淋巴結轉移、腫塊距離乳頭中央區較近的患者。但由于本組樣本量有限，獲取乳腺腫瘤皮膚浸潤的更加有價值的臨床病理特征尚需進一步大樣本研究。
Fisher等[1]提出乳腺癌是一個全身性疾病，不同手術方式對乳腺癌生存率影響并不是很明顯。隨后，多個醫療機構的大樣本前瞻性試驗證實了傳統根治術同保乳手術在長期生存率方面無明顯差異，從而使得乳腺癌的手術治療模式由“可以耐受的最大治療”轉為“最小而有效的治療”[2]。保乳手術因為其良好的美容效果，在歐美國家得到廣泛開展，但確保手術邊緣無腫瘤殘留是手術成敗的關鍵[3]。目前隨著早中期乳腺癌乳腺再造手術的廣泛開展，在行乳腺癌手術治療的同時需要保留更多的乳腺皮膚，以利于乳腺癌手術后再造手術，但過多的乳腺腫瘤表面皮膚保留可能因皮膚早期浸潤而導致腫瘤復發[4]。人乳腺珠蛋白（human mammaglobin，hMAM）是子宮珠蛋白超家族成員之一，定位于11號染色體，具有乳腺組織特異性[5]。本研究通過巢式逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術檢測hMAM mRNA在乳腺癌組織中的表達，并檢測乳腺癌患者腫塊表面皮膚浸潤情況，以期判斷hMAM是否可為臨床乳腺癌患者手術皮膚切除范圍提供重要的臨床資料。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2012年12月至2013年1月期間湖北醫藥學院附屬太和醫院病例，所有患者均為青年女性。乳腺纖維腺瘤15例，年齡（18.3±3.2）歲。乳腺增生癥15例，年齡（36.3±7.3）歲。乳腺癌患者60例，年齡（44.5±6.3）歲；腫瘤分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期19例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例；腋窩淋巴結有轉移27例，無轉移33例。皮膚標本取自腫塊表面中央0.5 cm×0.5 cm大小，所有皮膚組織標本均無局部肉眼可見皮膚浸潤情況，所取皮膚深度約0.5 cm以內，凍存于液氮，備提取RNA用。
1.2 巢式RT-PCR方法檢測hMAM mRNA在不同乳腺（癌）組織中的表達及其相應腫塊表面皮膚浸潤情況
引物設計參照文獻[6]。hMAM引物序列均由上海生工技術服務有限公司合成。外引物：上游引物為5′-GAAGTTGCTGATGGTCCTCATGCTGGC-3′，下游引物為5′-CTCACCATACCCTGCAGTTCTGT-GAGC-3′；內引物：上游引物為5′-CTCCCAGCAC-TGCTACGCAGGCTC-3′，下游引物為5′-CACCTC-AACATTGCTCAGAGTTTCATCCG-3′；GAPDH為內參物，上游引物為5′-CCACCCATGGCAAATT-CCATGGCA-3′，下游引物為5′-TCTAGACGGCAG-GTAAGGTCCACC-3′。主要實驗步驟：Trizol抽提細胞總RNA，第一步采用RT-PCR，反應體系如下：AMV/Tfl5x反應緩沖液10 mL，外引物上游及下游引物各0.5 mmol/L，dNTP濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度2 mmol/L，AMV 0.1 U/μL，Tfl DNA poly-merase 0.1 U/μL，RNA 5μL，加去離子水至總反應體積50μL，48℃條件下45 min逆轉錄，94℃條件下2 min行AMV RT滅活及RNA/cDNA引物變性，PCR反應條件：94℃30 s，58℃1 min，68℃1.5 min，共35個循環，70℃條件下延伸7 min。巢式第二步反應體系如下：AMV/Tfl5x反應緩沖液10μL，內引物上游及下游引物各0.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+ 2 mmol/L，Tfl DNA polymerase 0.1 U/μL，反應中取第一次反應產物3μL，加無離子水至總體積50μL。PCR反應條件：94℃3 min，94℃30 s，59℃1 min，68℃1 min，35個循環，然后70℃條件下延伸7 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色顯示DNA條帶，紫外光下顯像，201 bp處出現DNA條帶時判斷為hMAM mRNA陽性結果。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0進行統計學分析。用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hMAM mRNA在不同乳腺（癌）組織中的表達情況
hMAM mRNA表達陽性率在乳腺纖維腺瘤組織中為40.00%（6/15），在乳腺增生組織中為53.33%（8/15），在乳腺癌組織中為83.33%（50/60），乳腺癌組織中hMAM mRNA表達陽性率較纖維腺瘤組織和乳腺增生組織明顯增高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。乳腺纖維腺瘤組織及乳腺增生組織表面皮膚均未檢測出hMAM mRNA表達。60例乳腺癌患者腫塊表面皮膚檢測出hMAM mRNA陽性表達3例。
2.2 乳腺癌患者腫塊表面皮膚中hMAM mRNA表達與臨床病理特征的關系
乳腺癌腫塊表面皮膚中hMAM mRNA表達與患者年齡、腫瘤直徑及腫瘤分期無關（P＞0.05），但在腋窩淋巴結有轉移及腫瘤距離乳頭中央距離＜4 cm患者中，hMAM mRNA表達陽性率明顯高于無腋窩淋巴結轉移及腫瘤距離乳頭中央距離≥4 cm者（P＜0.05）。見表 1。
表1
60例乳腺癌患者腫塊表面皮膚中hMAM mRNA表達與臨床病理特征的關系（例）
Table1.
Relationship of hMAM mRNA expression to clinicopathologic features in 60 patients with infiltration of breast cancer surface skin(case)
3 討論
hMAM在乳腺組織中特異性高表達，乳腺癌患者hMAM蛋白水平升高可能與腫瘤的形成、發展和轉移密切相關，而手術切除和（或）化療后hMAM蛋白水平降低[7]。研究[8]發現，在卵巢、子宮、肺、睪丸、前列腺、結腸、肝臟、大腦等組織均不表達，而幾乎專一表達在正常乳腺上皮和乳腺癌組織中，尤其在不同病理分級的乳腺癌組織中均可檢測到hMAM表達，這使得hMAM有一定的乳腺組織特異性。本組60例乳腺癌組織中hMAM mRNA表達陽性率為83.33%，明顯高于其在乳腺纖維腺瘤組織（40.00%）及乳腺增生組織（53.33%）中的表達陽性率，表明乳腺癌組織中hMAM mRNA高表達，而在乳腺良性疾病中表達較低。由于hMAM在乳腺癌組織中的特異性使得針對hMAM的乳腺癌靶向治療得以研究和開發，可以進一步增強乳腺癌治療的靶向性，以防造成對其他組織的傷害[9]。有文獻[10]報道，在乳腺癌患者非乳腺組織檢測出hMAM表達，這提示腫瘤細胞浸潤或轉移，乳腺癌患者外周血中檢出hMAM提示乳腺癌發生血液轉移，外周血中hMAM檢出與乳腺癌病理分期相關，在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌的外周血中hMAM檢出率為82.9%，而在Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者的外周血中hMAM檢出率為23.4%，而且外周血中hMAM檢出提示較低的生存率，是患者不良預后的指標。外周血中hMAM檢出也被用于乳腺癌患者存在循環腫瘤細胞的診斷，是患者無病生存率及總生存率較低的指標[5]。
從組織學發生來看，皮膚與乳腺組織發生于不同胚層，是完全不同的組織，乳腺癌腫塊表面的皮膚不會因為靠近乳腺癌組織而發生癌變，而且無論是血液循環還是淋巴結轉移途徑，皮膚均不是其轉移的靶點，但乳腺癌腫塊可突破腫塊與皮膚間的包膜，發生皮膚直接浸潤[11]。Lookingbill等[12]發現，有1.3%（92/7316）的乳腺癌患者在診斷時有腫塊表面皮膚受累，5.0%（367/7316）的患者有皮膚浸潤。Ho等[13]對30例全乳切除術的標本進行分析后發現，Ⅰ期乳腺癌皮膚受累率為0，Ⅱ期乳腺癌皮膚受累率為4%。本組60例乳腺癌患者腫塊表面皮膚檢出hMAM mRNA陽性表達共3例，浸潤率為5.00%（3/60），與文獻報道基本一致，而且均為臨床分期Ⅲ、Ⅳ期患者。本組在乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥良性乳腺疾病腫塊表面皮膚未檢出hMAM mRNA表達，這與皮膚與乳腺組織是發生于不同胚層的組織有關，雖然hMAM mRNA特異性表達于乳腺組織，乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥良性乳腺疾病腫塊中存在一定的hMAM mRNA表達，但乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥良性乳腺疾病乳腺細胞一般不會遷移到皮膚，故未檢出皮膚hMAM mRNA表達。乳腺癌再造手術需要盡可能保留皮膚及乳頭和乳暈復合體，這樣術后可保持乳腺對稱，形狀良好，還可減少術后疤痕形成，具有良好的美容效果，但如果皮膚或乳頭乳暈復合體有腫瘤浸潤則可導致術后復發和轉移[14]。
乳腺癌患者腋窩淋巴結轉移提示乳腺癌細胞已發生擴散，其腫瘤復發及發生轉移可能性明顯增高，治療效果不理想[15-16]。淋巴結轉移數目較多及具有較高的腫瘤級別患者，以及分子指標檢測雌激素受體陰性患者，具有極低的無病生存率[17]。本組研究結果表明，腋窩淋巴結轉移患者的乳腺癌腫塊表面皮膚更易發生癌細胞浸潤。文獻[18]報道，腫塊距離乳頭乳暈復合體小于3 cm患者更易發生乳頭乳暈復合體受累。本研究結果發現，乳腺癌腫塊距離乳頭中央距離小于4 cm的患者腫瘤更易發生局部皮膚浸潤，提示中央區乳腺癌患者手術時需盡可能切除較多乳腺腫瘤表面皮膚。
總之，本研究結果表明，hMAM mRNA表達在乳腺癌組織中明顯增高，可用作乳腺癌患者診斷的分子指標，而且乳腺癌患者中腫塊表面皮膚浸潤更多見于Ⅲ～Ⅳ期、腋窩淋巴結轉移、腫塊距離乳頭中央區較近的患者。但由于本組樣本量有限，獲取乳腺腫瘤皮膚浸潤的更加有價值的臨床病理特征尚需進一步大樣本研究。
