引用本文： 楊韻, 彭偉, 汪曉東, 唐恬, 段寶鳳, 夏霖, 舒曄. miR21在不同分期直腸癌中的表達及意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(8): 971-975. doi: 10.7507/1007-9424.20140234 復制
直腸癌是最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率均位居前列[1]。直腸癌患者的預后取決于其初診時的腫瘤分期（尤其是N、M分期），50%的患者初診時已有局部或遠處轉移[2]。因此，為了更加有效地制定術前新輔助放化療的方案，早期診斷和明確腫瘤分期顯得尤為重要。臨床上術前通常采用影像學檢查如增強CT、MRI等估計腫瘤淋巴結轉移情況（即N分期），但由于各種主、客觀因素的影響，其準確度存在較大差異。因此，探尋一種客觀、準確的預測直腸癌分期的指標具有重要的臨床價值。MicroRNA是一類含18～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，調控細胞分化、細胞周期及細胞凋亡[3]，其能形成微小RNA誘導沉默復合物（microRNA-induced silencing complex，miRISC），并與信使RNA（mRNA）的3′-非翻譯區（3′-untran-slated-regions，3′-UTR）特異性結合，致翻譯抑制或mRNA降解，從而影響基因的轉錄后表達[4-5]。人類基因組中有30%的基因及其生物效應可能受microRNA調控[6-7]，亦包括腫瘤的發生與發展[8]。盡管目前各種microRNA的具體調控機理及功能尚未完全闡明，但多數研究[9-11]表明，microRNA的異常表達與多種腫瘤的發生和發展均有關。其中，miR21作為致癌microRNA的典型代表，已發現在一些腫瘤中存在高表達[12-15]；進一步的轉化醫學方面的研究[16-17]也提示microRNA可以用于診斷癌和判斷預后。但目前尚缺乏miR21在不同分期直腸癌中的表達及意義的報道，miR21能否作為術前預測直腸癌分期的指標也值得探討。故本研究旨在檢測miR21在不同分期直腸癌中的表達量并討論其臨床意義及價值。
1 資料與方法
1.1 患者及組織資料
2012年8～10月期間在我院胃腸外科中心經病理檢查確診的直腸癌患者40例納入本研究。納入標準：①無家族性多發性結腸息肉病；②術前未接受新輔助放化療；③無腸梗阻、腸穿孔及其他急腹癥。納入患者的直腸癌組織和相應癌旁正常組織（近側距腫瘤5 cm以上的正常直腸組織）于術后將被冷藏于液氮中。由同一病理科醫生對腫瘤進行術后腫瘤分期（TNM分期和Dukes分期）；同時，另一組固定的研究者對樣品中的miR21表達量進行檢測。2組檢驗者對組間檢驗結果互不知情。
1.2 microRNA Taq Man實時熒光定量檢測組織中miR21的表達
使用Trizol抽提組織中總RNA。miR21、U6 snRNA和U47特異性探針由ABI公司定制。整個檢測過程參照ABI公司的Taq Man microRNA檢測方法（Taq Man microRNA assay protocol，4364031 Rev.E，01/2011）。U6 snRNA和U47兩個內參表達量的幾何平均數用以校正miR21的表達量[18]。Taq Man microRNA reverse transcription kit用于逆轉錄。每25μL反應管中包含5 ng總RNA、9.6μL 5×RT primer（1.6μL/基因）、0.3μL Rnase Inhibitor（20 U/μL）、2.5μL 10×RT buffer、1.6μL MultiScribe reverse tran-scriptase和0.25μL dNTPs（100 mmol/L）。反應樣品將加入到PCR系統中，16℃反應30 min，42℃反應30 min，85℃反應5 min，最后降至4℃。Taq Man Universal PCR Master Mix Taq Man用于實時熒光定量。每3次技術重復（10μL/技術重復），包含2.4μL template、1.6μL 20×Taq Man microRNA assay mix和16μL 2×Taq Man Universal PCR buffer（帶尿嘧啶DNA糖基化酶）。反應樣品將加入到384孔反應盤中并在7900 HT定量系統內進行反應，50℃維持2 min，95℃維持10 min，接著40次循環95℃維持15 s，60℃維持1 min。miR21的相對定量采用2-ΔCt法即進行運算。
1.3 統計學方法
統計學分析采用IBM SPSS 20.0軟件。miR21表達量均數的比較采用配對樣本t檢驗或獨立樣本t檢驗。Tukey HSD檢驗法用于N0、N1、N2三組間miR21表達量的比較。受試者操作特征（ROC）曲線用于分析miR21在預測直腸癌分期時的敏感度及特異性。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 患者的臨床資料
本組40例直腸癌患者中男23例，女17例；年齡（57.5±11.951）歲，中位年齡56.5歲；分化程度：中分化26例，低分化14例；T分期：T1期2例，T2期10例，T3期28例；N分期：N0期20例，N1期10例，N2期10例；M分期：M0期36例，M1期4例。Dukes分期：A期7例，B期12例，C期17例，D期4例。
2.2 miR21在直腸癌組織和相應癌旁正常組織中的表達量
miR21在直腸癌組織中的表達量明顯高于相應癌旁正常組織（4.122±1.973比1.825±0.661，P=0.000），差異有統計學意義，見圖 1。
圖1
miR21在腫瘤組織和相應癌旁正常組織中的表達量
Figure1.
Expressions of miR21 in cancer tissues and corresponding adjacent normal tissues
2.3 miR21在不同分期直腸癌中表達量的比較
miR21在有淋巴結轉移組（N1～N2組）、Dukes分期C～D期組中的表達量明顯高于無淋巴結轉移組（N0組）和Dukes分期A～B期組，差異有統計學意義（P=0.019，P=0.021）。采用Tukey HSD檢驗法，對N0、N1、N2 3組分期直腸癌中miR21表達量進行比較發現，雖然N1組表達量高于N0組（4.148±2.876比3.391±1.171，P=0.530），N2組高于N1組（5.556±1.500比4.148±2.876，P=0.203），但差異均無統計學意義，而N2組中miR21表達量明顯高于N0組（5.556±1.500比3.391±1.171，P=0.010）。miR21在直腸癌不同分化程度、不同T分期及不同M分期中表達量差異均無統計學意義（P=0.697，P=0.873，P=0.611）。見表 1。
表1
miR21在不同分期及分化程度直腸癌中表達量的比較（2.4 miR21預測直腸癌N分期和Dukes分期的評價
為了進一步評價miR21預測腫瘤N分期和Dukes分期的價值，ROC曲線分析（圖 2、3）結果顯示：miR21在預測淋巴結轉移時（即區分N0和N1～N2時），其AUC值為0.698（95% CI為0.530～0.865），臨界值為4.87，敏感度為50.0%，特異性為90.0%。在預測中晚期直腸癌時（即區分Dukes A～B期和C～D期時），臨界值為5.12，其AUC值為0.689（95% CI為0.524～0.855），敏感度為42.9%，特異性為94.7%。
圖2
miR21預測直腸癌淋巴結轉移情況（即N1～N2期）
Figure2.
N1-N2 stage was distinguished from N0 stage by miR21
圖3
miR21預測中晚期直腸癌（即Dukes C～D期）
Figure3.
Dukes C-D stage was distinguished from A-B stage by miR21
3 討論
全球范圍內每年約有123萬人患結直腸癌，并有約60萬患者死于結直腸癌[19]。隨著其診療手段的不斷進步，尤其是利用現代化檢查手段對癌前病變的篩檢，使得結直腸癌在一定程度上仍能可防可治[20]。特別是更加準確的術前腫瘤分期，能為術前新輔助放化療方案的制定提供有力依據，進而更好地改善預后。目前，術前影像學檢查如增強CT、MRI等是最為廣泛使用的用于估計腫瘤淋巴結轉移情況（即N分期）的檢測手段，但由于各種主、客觀因素（如閱片人經驗差異、假陽性或假陰性淋巴結）的影響，其準確度存在較大差異（CT為22%～73%，MRI為39%～75%）[21]。因此，尋找一種敏感性及特異性均高的結直腸癌術前分期指標，具有很高的臨床應用價值。
miR21作為促癌miRNA，在腫瘤中常為過表達狀態，可負向調節某些抑癌基因的表達，如原肌球蛋白1（tropomyosin1，TPM1）、第10號染色體缺失的同源性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）基因、程序性細胞死亡蛋白4（programmed cell death 4，PDCD4）基因及乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑（mammary serine proteaseinhibitor，Maspin）基因，miR-21通過作用于這些抗轉移基因，在腫瘤的生長、浸潤和轉移方面起重要作用[22]。Asangani等[23]發現，miR21可下調PDCD4的表達，從而誘導腫瘤的發生、進展、浸潤、金屬蛋白酶激活，并抑制細胞凋亡。在體內、外試驗中，Wang等[24]發現，若敲出PDCD4能下調上皮特異性蛋白的表達，同時上調間葉細胞特異性蛋白的表達，致使在創面愈合實驗和博伊登室（體外趨化）實驗中，細胞遷移能力明顯增強。故miR21的高表達及PDCD4的低表達可導致上皮細胞-間充質細胞轉換（EMT）并促進細胞遷移，此為腫瘤細胞轉移的關鍵機制。Slaby等[25]發現結直腸癌組織中miR21高表達，且與淋巴結轉移、遠處轉移和腫瘤分期密切相關。隨后的一項包含有中國及美國結腸癌患者的隊列研究[26]發現，miR21與患者預后也密切相關，其中高表達miR21與低生存率密切相關，且在Ⅲ期腫瘤患者中，這種高表達與化療敏感性和早期復發均有關。
在本研究中，miR21在直腸癌組織中的表達水平明顯高于相應癌旁正常組織中的表達水平，miR21在N1～N2期以及Dukes C～D期直腸癌組織中的表達明顯高于N0期以及Dukes A～B期，結果提示，miR21高表達可能與腫瘤N分期（即淋巴結轉移）和Dukes分期（即中晚期腫瘤）有潛在關聯。miR21表達與腫瘤分化程度及T分期無關。另外，miR21在預測淋巴結轉移時（即區分N0和N1～N2時），其AUC值為0.698，敏感度為50.0%，特異性為90.0%；在預測中晚期直腸癌時（即區分C＋D期和A＋B期時），其AUC值為0.689，敏感度為42.9%，特異性為94.7%，有一定的診斷價值。
綜上所述，miR21可能是術前預測直腸癌N和Dukes分期的潛在新型腫瘤標志物。但由于本研究的樣本量有限，microRNA定量技術的高成本以及其中逆轉錄和RT-PCR技術的高條件要求，miR21能否成為術前預測直腸癌N分期和Dukes分期的理想指標以及能否推廣、應用還有大量的工作要做。
直腸癌是最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率均位居前列[1]。直腸癌患者的預后取決于其初診時的腫瘤分期（尤其是N、M分期），50%的患者初診時已有局部或遠處轉移[2]。因此，為了更加有效地制定術前新輔助放化療的方案，早期診斷和明確腫瘤分期顯得尤為重要。臨床上術前通常采用影像學檢查如增強CT、MRI等估計腫瘤淋巴結轉移情況（即N分期），但由于各種主、客觀因素的影響，其準確度存在較大差異。因此，探尋一種客觀、準確的預測直腸癌分期的指標具有重要的臨床價值。MicroRNA是一類含18～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，調控細胞分化、細胞周期及細胞凋亡[3]，其能形成微小RNA誘導沉默復合物（microRNA-induced silencing complex，miRISC），并與信使RNA（mRNA）的3′-非翻譯區（3′-untran-slated-regions，3′-UTR）特異性結合，致翻譯抑制或mRNA降解，從而影響基因的轉錄后表達[4-5]。人類基因組中有30%的基因及其生物效應可能受microRNA調控[6-7]，亦包括腫瘤的發生與發展[8]。盡管目前各種microRNA的具體調控機理及功能尚未完全闡明，但多數研究[9-11]表明，microRNA的異常表達與多種腫瘤的發生和發展均有關。其中，miR21作為致癌microRNA的典型代表，已發現在一些腫瘤中存在高表達[12-15]；進一步的轉化醫學方面的研究[16-17]也提示microRNA可以用于診斷癌和判斷預后。但目前尚缺乏miR21在不同分期直腸癌中的表達及意義的報道，miR21能否作為術前預測直腸癌分期的指標也值得探討。故本研究旨在檢測miR21在不同分期直腸癌中的表達量并討論其臨床意義及價值。
1 資料與方法
1.1 患者及組織資料
2012年8～10月期間在我院胃腸外科中心經病理檢查確診的直腸癌患者40例納入本研究。納入標準：①無家族性多發性結腸息肉病；②術前未接受新輔助放化療；③無腸梗阻、腸穿孔及其他急腹癥。納入患者的直腸癌組織和相應癌旁正常組織（近側距腫瘤5 cm以上的正常直腸組織）于術后將被冷藏于液氮中。由同一病理科醫生對腫瘤進行術后腫瘤分期（TNM分期和Dukes分期）；同時，另一組固定的研究者對樣品中的miR21表達量進行檢測。2組檢驗者對組間檢驗結果互不知情。
1.2 microRNA Taq Man實時熒光定量檢測組織中miR21的表達
使用Trizol抽提組織中總RNA。miR21、U6 snRNA和U47特異性探針由ABI公司定制。整個檢測過程參照ABI公司的Taq Man microRNA檢測方法（Taq Man microRNA assay protocol，4364031 Rev.E，01/2011）。U6 snRNA和U47兩個內參表達量的幾何平均數用以校正miR21的表達量[18]。Taq Man microRNA reverse transcription kit用于逆轉錄。每25μL反應管中包含5 ng總RNA、9.6μL 5×RT primer（1.6μL/基因）、0.3μL Rnase Inhibitor（20 U/μL）、2.5μL 10×RT buffer、1.6μL MultiScribe reverse tran-scriptase和0.25μL dNTPs（100 mmol/L）。反應樣品將加入到PCR系統中，16℃反應30 min，42℃反應30 min，85℃反應5 min，最后降至4℃。Taq Man Universal PCR Master Mix Taq Man用于實時熒光定量。每3次技術重復（10μL/技術重復），包含2.4μL template、1.6μL 20×Taq Man microRNA assay mix和16μL 2×Taq Man Universal PCR buffer（帶尿嘧啶DNA糖基化酶）。反應樣品將加入到384孔反應盤中并在7900 HT定量系統內進行反應，50℃維持2 min，95℃維持10 min，接著40次循環95℃維持15 s，60℃維持1 min。miR21的相對定量采用2-ΔCt法即進行運算。
1.3 統計學方法
統計學分析采用IBM SPSS 20.0軟件。miR21表達量均數的比較采用配對樣本t檢驗或獨立樣本t檢驗。Tukey HSD檢驗法用于N0、N1、N2三組間miR21表達量的比較。受試者操作特征（ROC）曲線用于分析miR21在預測直腸癌分期時的敏感度及特異性。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 患者的臨床資料
本組40例直腸癌患者中男23例，女17例；年齡（57.5±11.951）歲，中位年齡56.5歲；分化程度：中分化26例，低分化14例；T分期：T1期2例，T2期10例，T3期28例；N分期：N0期20例，N1期10例，N2期10例；M分期：M0期36例，M1期4例。Dukes分期：A期7例，B期12例，C期17例，D期4例。
2.2 miR21在直腸癌組織和相應癌旁正常組織中的表達量
miR21在直腸癌組織中的表達量明顯高于相應癌旁正常組織（4.122±1.973比1.825±0.661，P=0.000），差異有統計學意義，見圖 1。
圖1
miR21在腫瘤組織和相應癌旁正常組織中的表達量
Figure1.
Expressions of miR21 in cancer tissues and corresponding adjacent normal tissues
2.3 miR21在不同分期直腸癌中表達量的比較
miR21在有淋巴結轉移組（N1～N2組）、Dukes分期C～D期組中的表達量明顯高于無淋巴結轉移組（N0組）和Dukes分期A～B期組，差異有統計學意義（P=0.019，P=0.021）。采用Tukey HSD檢驗法，對N0、N1、N2 3組分期直腸癌中miR21表達量進行比較發現，雖然N1組表達量高于N0組（4.148±2.876比3.391±1.171，P=0.530），N2組高于N1組（5.556±1.500比4.148±2.876，P=0.203），但差異均無統計學意義，而N2組中miR21表達量明顯高于N0組（5.556±1.500比3.391±1.171，P=0.010）。miR21在直腸癌不同分化程度、不同T分期及不同M分期中表達量差異均無統計學意義（P=0.697，P=0.873，P=0.611）。見表 1。
表1
miR21在不同分期及分化程度直腸癌中表達量的比較（2.4 miR21預測直腸癌N分期和Dukes分期的評價
為了進一步評價miR21預測腫瘤N分期和Dukes分期的價值，ROC曲線分析（圖 2、3）結果顯示：miR21在預測淋巴結轉移時（即區分N0和N1～N2時），其AUC值為0.698（95% CI為0.530～0.865），臨界值為4.87，敏感度為50.0%，特異性為90.0%。在預測中晚期直腸癌時（即區分Dukes A～B期和C～D期時），臨界值為5.12，其AUC值為0.689（95% CI為0.524～0.855），敏感度為42.9%，特異性為94.7%。
圖2
miR21預測直腸癌淋巴結轉移情況（即N1～N2期）
Figure2.
N1-N2 stage was distinguished from N0 stage by miR21
圖3
miR21預測中晚期直腸癌（即Dukes C～D期）
Figure3.
Dukes C-D stage was distinguished from A-B stage by miR21
3 討論
全球范圍內每年約有123萬人患結直腸癌，并有約60萬患者死于結直腸癌[19]。隨著其診療手段的不斷進步，尤其是利用現代化檢查手段對癌前病變的篩檢，使得結直腸癌在一定程度上仍能可防可治[20]。特別是更加準確的術前腫瘤分期，能為術前新輔助放化療方案的制定提供有力依據，進而更好地改善預后。目前，術前影像學檢查如增強CT、MRI等是最為廣泛使用的用于估計腫瘤淋巴結轉移情況（即N分期）的檢測手段，但由于各種主、客觀因素（如閱片人經驗差異、假陽性或假陰性淋巴結）的影響，其準確度存在較大差異（CT為22%～73%，MRI為39%～75%）[21]。因此，尋找一種敏感性及特異性均高的結直腸癌術前分期指標，具有很高的臨床應用價值。
miR21作為促癌miRNA，在腫瘤中常為過表達狀態，可負向調節某些抑癌基因的表達，如原肌球蛋白1（tropomyosin1，TPM1）、第10號染色體缺失的同源性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）基因、程序性細胞死亡蛋白4（programmed cell death 4，PDCD4）基因及乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑（mammary serine proteaseinhibitor，Maspin）基因，miR-21通過作用于這些抗轉移基因，在腫瘤的生長、浸潤和轉移方面起重要作用[22]。Asangani等[23]發現，miR21可下調PDCD4的表達，從而誘導腫瘤的發生、進展、浸潤、金屬蛋白酶激活，并抑制細胞凋亡。在體內、外試驗中，Wang等[24]發現，若敲出PDCD4能下調上皮特異性蛋白的表達，同時上調間葉細胞特異性蛋白的表達，致使在創面愈合實驗和博伊登室（體外趨化）實驗中，細胞遷移能力明顯增強。故miR21的高表達及PDCD4的低表達可導致上皮細胞-間充質細胞轉換（EMT）并促進細胞遷移，此為腫瘤細胞轉移的關鍵機制。Slaby等[25]發現結直腸癌組織中miR21高表達，且與淋巴結轉移、遠處轉移和腫瘤分期密切相關。隨后的一項包含有中國及美國結腸癌患者的隊列研究[26]發現，miR21與患者預后也密切相關，其中高表達miR21與低生存率密切相關，且在Ⅲ期腫瘤患者中，這種高表達與化療敏感性和早期復發均有關。
在本研究中，miR21在直腸癌組織中的表達水平明顯高于相應癌旁正常組織中的表達水平，miR21在N1～N2期以及Dukes C～D期直腸癌組織中的表達明顯高于N0期以及Dukes A～B期，結果提示，miR21高表達可能與腫瘤N分期（即淋巴結轉移）和Dukes分期（即中晚期腫瘤）有潛在關聯。miR21表達與腫瘤分化程度及T分期無關。另外，miR21在預測淋巴結轉移時（即區分N0和N1～N2時），其AUC值為0.698，敏感度為50.0%，特異性為90.0%；在預測中晚期直腸癌時（即區分C＋D期和A＋B期時），其AUC值為0.689，敏感度為42.9%，特異性為94.7%，有一定的診斷價值。
綜上所述，miR21可能是術前預測直腸癌N和Dukes分期的潛在新型腫瘤標志物。但由于本研究的樣本量有限，microRNA定量技術的高成本以及其中逆轉錄和RT-PCR技術的高條件要求，miR21能否成為術前預測直腸癌N分期和Dukes分期的理想指標以及能否推廣、應用還有大量的工作要做。
