引用本文： 徐麗, 孫慧萍, 李冬梅, 李霞, 曹軍平. 七葉皂苷鈉預防大鼠術后腸粘連的機制研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(8): 957-959. doi: 10.7507/1007-9424.20140231 復制
腸粘連是腹腔術后的一種常見并發癥，發生率可高達80%～90% [1-2]，目前尚無理想的預防術后腸粘連藥物供臨床使用。七葉皂苷鈉是從七葉樹果實娑羅子中提取的三萜皂苷鈉鹽，具有抗炎、抗滲出、消水腫、改善血液循環等作用[3-5]。前期研究[6]發現，七葉皂苷鈉能夠預防腹腔術后腸粘連的形成。本研究從炎性細胞因子入手，探討七葉皂苷鈉預防術后腸粘連的機制，為其臨床應用提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SD大鼠50只，雌雄各半，體質量（200±20）g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（冀）2008-1-003。動物分籠飼養，適應性喂養1周后進行實驗。
1.2 藥品、試劑和主要儀器
注射用七葉皂苷鈉，由北京四環科寶制藥有限公司提供。地塞米松磷酸鈉注射液，由天津金耀氨基酸有限公司提供。羥脯氨酸試劑盒和考馬斯亮藍試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、IL-6酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒均購自美國R & D公司。AC100-110型酶標儀，瑞士Tecan公司。
1.3 方法
1.3.1 Ellis法制備大鼠術后腸粘連模型[1 ]
取SD大鼠，禁食不禁水12 h后，麻醉、固定，腹部消毒，取下腹部正中切口，提出盲腸，置于紗布上約5 min，使漿膜干燥，以解剖刀片輕刮整個盲腸漿膜10遍，造成輕度滲血，然后以無齒鑷夾住盲腸系膜動脈約2 min，造成暫時局部缺血。盲腸回納入腹腔原位后以止血鉗夾傷相應腹壁，常規關腹。
1.3.2 分組與給藥
取造模成功的大鼠，按隨機數字表法分為模型組（注射等體積蒸餾水）、地塞米松組（地塞米松5 mg/kg）、七葉皂苷鈉組（注射七葉皂苷鈉2 mg/kg），每組10只。另取10只大鼠開腹后立即縫合作為假手術組（注射等體積蒸餾水）。給藥方式均采用尾靜脈注射，造模前1 d給藥1次，造模后繼續給藥3 d，1次/d。
1.3.3 檢測指標
①細胞因子的檢測。造模后1周，各組動物進行心臟采血，3 500 r/min（r=10 cm）離心5 min分離血清，采用雙抗體夾心ELISA法上酶標儀檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平，操作按試劑盒說明書進行。②粘連程度分級。采血后處死動物，開腹觀察腸粘連發生情況，并按Phillips 5級標準[7]進行分級：0級，無粘連；Ⅰ級，粘連面積小于20%，易分離；Ⅱ級，粘連面積20%～40%，分離后局部漿膜稍有損傷；Ⅲ級，粘連面積為40%～60%，分離后局部有損傷和滲血；Ⅳ級，粘連面積大于60%，組織粘連成團，分離困難。③羥脯氨酸水平檢測。分級后，切除所有盲腸粘連區段，制備組織勻漿，3 500 r/min（r=10 cm）離心10 min后取上清液，分別測定羥脯氨酸和蛋白質含量，操作按試劑盒說明書進行。以羥脯氨酸和蛋白質含量之比（μg/g）來表示組織的羥脯氨酸水平。
1.3.4 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，粘連程度分級采用秩和檢驗，計量資料組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 七葉皂苷鈉對腸粘連程度的影響
腹腔手術后1周，各組動物均存活。假手術組有1只發生粘連，模型組動物均發生粘連，七葉皂苷鈉組的部分動物未見粘連或粘連程度較輕。與模型組比較，七葉皂苷鈉組或地塞米松組的腸粘連程度明顯改善（P＜0.01）。見表 1。
表1
各組術后腸粘連分級情況（例）
Table1.
Status of grading of intestinal adhesion in each group (case)
2.2 七葉皂苷鈉對血清細胞因子表達的影響
模型組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯高于假手術組（P＜0.01）。七葉皂苷鈉可明顯降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平，明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。見表 2。
表2
各組大鼠血清炎癥因子表達的比較（ng/L，2.3 七葉皂苷鈉對粘連腸段羥脯氨酸水平的影響
術后粘連腸段羥脯氨酸水平模型組為（240.5±29.6）μg/g，明顯高于假手術組的（118.8±20.0）μg/g；給藥后，七葉皂苷鈉組為（178.4±22.7）μg/g，地塞米松組為（169.2±18.9）μg/g，均明顯低于模型組（P＜0.01）。
3 討論
目前對于腹腔術后腸粘連的發生機制仍以炎癥學說較流行[8]，認為腹膜損傷導致炎癥滲出，改變了膠原合成和分解之間的平衡，進而產生纖維粘連[9]。組織粘連主要取決于膠原的合成，而羥脯氨酸是膠原合成的前體。Ozo?ul等[10]研究發現，組織中羥脯氨酸水平與粘連程度分級呈線性正相關，標記的羥脯氨酸出現在損傷后的組織中，并隨著組織的愈合而逐漸增多。因此，組織中羥脯氨酸水平是反映腹腔術后腸粘連程度的一個重要指標。
細胞因子在術后腸粘連形成中的作用正逐漸被認識并受到重視[11-12]。TNF-α在損傷后的炎癥反應過程中起重要作用，如刺激其他介質包括IL-1、IL-6和血小板激活因子的釋放[13]；通過刺激黏附分子的產生，促進中性粒細胞-上皮細胞間的粘連[14]。Kaidi等[15]研究發現，局部和全身高水平的TNF-α在術后短時間內與腸粘連形成的程度有密切聯系，可作為粘連形成的一種標志物。另據報道[16]，早期阻斷TNF-α活性有利于降低術后腸粘連的發生率。IL-1是機體組織受到損傷和發生炎癥反應時做出急性反應的關鍵介質[17]。Saba等[18]研究發現，術后早期血清中較高水平的IL-1與腹膜粘連的形成顯著相關，IL-1升高可作為術后發生腸粘連的可靠指標。IL-6是機體對損傷做出反應時分泌的多功能細胞因子，與免疫性增殖和新生物的形成過程有關[19]。Saba等[20]發現，術前給予抗IL-6抗體能減少腸損傷模型大鼠腸粘連形成且不影響傷口愈合，認為IL-6在刺激術后腸粘連形成中起作用。有臨床研究[21]證實，IL-6是腹腔液中的正常成分，但在許多發生術后腹腔粘連患者中IL-6水平明顯升高。
本研究觀察了七葉皂苷鈉對術后腸粘連大鼠血清中細胞因子表達的影響，結果表明，七葉皂苷鈉對術后腸粘連有預防作用，能明顯改善腸粘連程度，顯著降低血清細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。這與王春霞等[22]關于常通口服液對術后腸粘連大鼠血清細胞因子的研究結果有相似之處。本研究結果提示，七葉皂苷鈉預防術后腸粘連的機制可能與抑制炎癥因子的過度表達，進而減輕腹腔的早期急性炎癥反應有關。
腸粘連是腹腔術后的一種常見并發癥，發生率可高達80%～90% [1-2]，目前尚無理想的預防術后腸粘連藥物供臨床使用。七葉皂苷鈉是從七葉樹果實娑羅子中提取的三萜皂苷鈉鹽，具有抗炎、抗滲出、消水腫、改善血液循環等作用[3-5]。前期研究[6]發現，七葉皂苷鈉能夠預防腹腔術后腸粘連的形成。本研究從炎性細胞因子入手，探討七葉皂苷鈉預防術后腸粘連的機制，為其臨床應用提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SD大鼠50只，雌雄各半，體質量（200±20）g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（冀）2008-1-003。動物分籠飼養，適應性喂養1周后進行實驗。
1.2 藥品、試劑和主要儀器
注射用七葉皂苷鈉，由北京四環科寶制藥有限公司提供。地塞米松磷酸鈉注射液，由天津金耀氨基酸有限公司提供。羥脯氨酸試劑盒和考馬斯亮藍試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、IL-6酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒均購自美國R & D公司。AC100-110型酶標儀，瑞士Tecan公司。
1.3 方法
1.3.1 Ellis法制備大鼠術后腸粘連模型[1 ]
取SD大鼠，禁食不禁水12 h后，麻醉、固定，腹部消毒，取下腹部正中切口，提出盲腸，置于紗布上約5 min，使漿膜干燥，以解剖刀片輕刮整個盲腸漿膜10遍，造成輕度滲血，然后以無齒鑷夾住盲腸系膜動脈約2 min，造成暫時局部缺血。盲腸回納入腹腔原位后以止血鉗夾傷相應腹壁，常規關腹。
1.3.2 分組與給藥
取造模成功的大鼠，按隨機數字表法分為模型組（注射等體積蒸餾水）、地塞米松組（地塞米松5 mg/kg）、七葉皂苷鈉組（注射七葉皂苷鈉2 mg/kg），每組10只。另取10只大鼠開腹后立即縫合作為假手術組（注射等體積蒸餾水）。給藥方式均采用尾靜脈注射，造模前1 d給藥1次，造模后繼續給藥3 d，1次/d。
1.3.3 檢測指標
①細胞因子的檢測。造模后1周，各組動物進行心臟采血，3 500 r/min（r=10 cm）離心5 min分離血清，采用雙抗體夾心ELISA法上酶標儀檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平，操作按試劑盒說明書進行。②粘連程度分級。采血后處死動物，開腹觀察腸粘連發生情況，并按Phillips 5級標準[7]進行分級：0級，無粘連；Ⅰ級，粘連面積小于20%，易分離；Ⅱ級，粘連面積20%～40%，分離后局部漿膜稍有損傷；Ⅲ級，粘連面積為40%～60%，分離后局部有損傷和滲血；Ⅳ級，粘連面積大于60%，組織粘連成團，分離困難。③羥脯氨酸水平檢測。分級后，切除所有盲腸粘連區段，制備組織勻漿，3 500 r/min（r=10 cm）離心10 min后取上清液，分別測定羥脯氨酸和蛋白質含量，操作按試劑盒說明書進行。以羥脯氨酸和蛋白質含量之比（μg/g）來表示組織的羥脯氨酸水平。
1.3.4 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，粘連程度分級采用秩和檢驗，計量資料組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 七葉皂苷鈉對腸粘連程度的影響
腹腔手術后1周，各組動物均存活。假手術組有1只發生粘連，模型組動物均發生粘連，七葉皂苷鈉組的部分動物未見粘連或粘連程度較輕。與模型組比較，七葉皂苷鈉組或地塞米松組的腸粘連程度明顯改善（P＜0.01）。見表 1。
表1
各組術后腸粘連分級情況（例）
Table1.
Status of grading of intestinal adhesion in each group (case)
2.2 七葉皂苷鈉對血清細胞因子表達的影響
模型組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯高于假手術組（P＜0.01）。七葉皂苷鈉可明顯降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平，明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。見表 2。
表2
各組大鼠血清炎癥因子表達的比較（ng/L，2.3 七葉皂苷鈉對粘連腸段羥脯氨酸水平的影響
術后粘連腸段羥脯氨酸水平模型組為（240.5±29.6）μg/g，明顯高于假手術組的（118.8±20.0）μg/g；給藥后，七葉皂苷鈉組為（178.4±22.7）μg/g，地塞米松組為（169.2±18.9）μg/g，均明顯低于模型組（P＜0.01）。
3 討論
目前對于腹腔術后腸粘連的發生機制仍以炎癥學說較流行[8]，認為腹膜損傷導致炎癥滲出，改變了膠原合成和分解之間的平衡，進而產生纖維粘連[9]。組織粘連主要取決于膠原的合成，而羥脯氨酸是膠原合成的前體。Ozo?ul等[10]研究發現，組織中羥脯氨酸水平與粘連程度分級呈線性正相關，標記的羥脯氨酸出現在損傷后的組織中，并隨著組織的愈合而逐漸增多。因此，組織中羥脯氨酸水平是反映腹腔術后腸粘連程度的一個重要指標。
細胞因子在術后腸粘連形成中的作用正逐漸被認識并受到重視[11-12]。TNF-α在損傷后的炎癥反應過程中起重要作用，如刺激其他介質包括IL-1、IL-6和血小板激活因子的釋放[13]；通過刺激黏附分子的產生，促進中性粒細胞-上皮細胞間的粘連[14]。Kaidi等[15]研究發現，局部和全身高水平的TNF-α在術后短時間內與腸粘連形成的程度有密切聯系，可作為粘連形成的一種標志物。另據報道[16]，早期阻斷TNF-α活性有利于降低術后腸粘連的發生率。IL-1是機體組織受到損傷和發生炎癥反應時做出急性反應的關鍵介質[17]。Saba等[18]研究發現，術后早期血清中較高水平的IL-1與腹膜粘連的形成顯著相關，IL-1升高可作為術后發生腸粘連的可靠指標。IL-6是機體對損傷做出反應時分泌的多功能細胞因子，與免疫性增殖和新生物的形成過程有關[19]。Saba等[20]發現，術前給予抗IL-6抗體能減少腸損傷模型大鼠腸粘連形成且不影響傷口愈合，認為IL-6在刺激術后腸粘連形成中起作用。有臨床研究[21]證實，IL-6是腹腔液中的正常成分，但在許多發生術后腹腔粘連患者中IL-6水平明顯升高。
本研究觀察了七葉皂苷鈉對術后腸粘連大鼠血清中細胞因子表達的影響，結果表明，七葉皂苷鈉對術后腸粘連有預防作用，能明顯改善腸粘連程度，顯著降低血清細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。這與王春霞等[22]關于常通口服液對術后腸粘連大鼠血清細胞因子的研究結果有相似之處。本研究結果提示，七葉皂苷鈉預防術后腸粘連的機制可能與抑制炎癥因子的過度表達，進而減輕腹腔的早期急性炎癥反應有關。
