引用本文： 閆文貌, 程石. FasL在重癥急性胰腺炎肺泡巨噬細胞凋亡機理中的作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(7): 869-871. doi: 10.7507/1007-9424.20140205 復制
重癥急性胰腺炎（SAP）是臨床常見危重疾病。盡管目前國內外對SAP的治療已有了長足發展，但其病死率仍高達20％～30％，其中65％的SAP患者死于急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[1]。筆者的前期研究[2-3]已發現肺泡巨噬細胞（AM）活化在SAP所致ALI中的主要作用，并已證實抑制AM活化，促使AM適度凋亡，可減輕SAP所致的ALI。然而，引起AM凋亡的機理較復雜，目前仍不清楚。本實驗將通過觀察FasL在AM中的表達，探討FasL在AM凋亡機理中的作用，以為臨床SAP所致肺損傷的治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑及儀器
氯化釓G-7532（美國Sigma公司）；牛磺酸鈉BR1383-1（晶美生物工程有限公司）；FasL抗體（美國SANTA公司）；胞漿蛋白提取試劑盒（北京普利萊公司）；EM208s透射電鏡（荷蘭Philips公司）；流式細胞儀FACACalibur（美國BD公司）。
1.2 實驗動物及分組
雄性SD大鼠48只（中國醫學科學院實驗動物研究所提供），體質量250～300 g。按數字表法隨機分成對照組、SAP組及氯化釓（GdCl3）組3組，每組16只。對照組：經胰膽管逆行注射生理鹽水（1 mL/kg）；SAP組：經胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉（1 mL/kg）制備SAP模型；GdCl3組在SAP模型制備成功后即刻按10 mg/kg經陰莖背靜脈注射GdCl3。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 支氣管肺泡灌洗及細胞培養
模型制備成功后6 h處死動物，取右肺下葉，備用。用4℃生理鹽水經支氣管行肺泡灌洗（每次10 mL，每只大鼠緩慢連續灌洗4次），收集灌洗液，并離心（1 500 r/min，r=12 cm，5 min）獲取細胞沉淀，將細胞沉淀置于培養皿中，在37℃、5% CO2條件下培養1 h，用20℃1 640培養液沖洗2次，去除未黏附細胞，再以2 000 r/min（r=9 cm）離心10 min，所獲細胞即為AM，備用。所有標本均重復檢查2次。
1.3.2 肺組織病理學檢查
取各組大鼠右肺下葉組織置10%甲醛溶液浸泡，石蠟包埋切片，行HE染色，光學顯微鏡下觀察肺組織的病理學改變。
1.3.3 透射電子顯微鏡觀察AM
將AM團按常規方法制備電鏡超薄切片，于透射電鏡下觀察AM的形態。
1.3.4 流式細胞儀檢測AM凋亡情況
將前述獲得的AM以Annexin V/FITC和碘化丙啶（PI）雙染色法于流式細胞儀上樣，檢測各組AM凋亡情況。
1.3.5 免疫印記Western blot法檢測AM中FasL蛋白表達水平
應用胞質蛋白制備試劑盒提取AM胞質蛋白并測定濃度后，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。結果用計算機掃描，用圖像分析系統測定目的條帶與內參的光密度值，并取兩者的比值作半定量分析。
1.4 統計學方法
計量數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 肺組織病理學改變
結果見圖 1。由圖 1可見，對照組肺泡組織結構清晰，肺泡壁薄，肺泡內未見滲出液；SAP組肺間隔彌漫增厚，肺間質明顯充血、水腫，有大量中性粒細胞浸潤；GdCl3組肺組織改變與SAP組相比有所減輕，但仍有中性粒細胞浸潤，肺呈輕度水腫改變。
圖1
示各組肺組織的病理學改變（HE×200）。1A：對照組；1B：SAP組；1C：GdCl3組??圖 2 ??示正常AM和典型的早期凋亡AM。2A：正常AM（TEM×5 000）；2B：黃
2.2 透射電子顯微鏡觀察結果
GdCl3組AM可見典型早期凋亡形態學特征，即細胞核染色質邊集，在細胞核膜周邊聚集形成新月體；細胞體積縮小，細胞膜表面微絨毛和偽足減少或消失（圖 2）；凋亡晚期可見凋亡小體。對照組及SAP組均無典型細胞凋亡形態出現。
2.3 流式細胞儀檢測AM凋亡率結果
GdCl3組中AM凋亡率顯著高于SAP組和對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；對照組大鼠的AM凋亡率較低，但高于SAP組，而低于GdCl3組，其差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表 1。
表1
各組AM凋亡率級AM中FasL蛋白相對表達量檢測結果（2.4 AM中FasL蛋白表達水平檢測結果
GdCl3組與對照組及SAP組相比，AM中FasL蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.01），見圖 3及表 1）。AM凋亡率與AM中FasL蛋白的表達呈明顯的線性正相關關系（R2=0.766，P＜0.01）。
圖3
示各組AM中的FasL蛋白表達
3 討論
SAP是臨床常見危重疾病，病情進展迅速，早期容易合并多種器官功能障礙，死亡率高[4]。因此，早期預防和治療ALI對降低SAP的病死率及改善疾病的預后具有重要意義。
細胞凋亡在急性胰腺炎發病過程中具有特殊重要的作用，誘導腺泡細胞凋亡可減輕急性胰腺炎病情[5-8]。研究[9]表明，SAP發生后，AM大量活化而導致肺損傷；應用GdCl3處理AM，發現GdCl3能誘導SAP大鼠AM發生凋亡，抑制AM活化，減少AM分泌炎癥介質，進而減輕肺損傷。但GdCl3如何誘導AM發生凋亡，其機理較復雜，目前仍不十分清楚。如果能探明AM凋亡的機理，將會為SAP肺損傷的早期預防和治療提供有力的理論支持。
FasL是TNF家族Ⅱ型跨膜蛋白，分子質量為31×103，糖基化后分子質量為36×103～43×103，Fas與其配體FasL結合可誘導細胞發生凋亡。Fas/FasL系統是多種疾病的細胞凋亡介質，參與外周T淋巴細胞克隆的清除和活化的T淋巴細胞的凋亡，具有免疫下調的作用[10-11]。在SAP中，通過Fas/FasL系統促進T淋巴細胞凋亡，引起CD4+細胞水平的降低而導致免疫功能的損害[12]。
近年來有研究[13-15]表明，Fas/FasL系統活化可能參與了AM的凋亡。Kitsmura等[13]發現，在內毒素誘導的小鼠ALI后，Fas/FasL在AM的表達均明顯上調，且Fas/FasL表達的增強與AM凋亡的增加呈平行關系，提示Fas/FasL系統活化可能參與了AM凋亡的機理。Peng等[14]和Gallagher等[15-16]發現，Fas/FasL系統的激活可誘導急性胰腺炎肝臟Kupffer細胞發生凋亡，進而導致肝損傷。本實驗結果發現，SAP時AM胞漿中FasL蛋白相對表達量較低，AM凋亡減少，而給予GdCl3干預治療后，AM胞漿中FasL蛋白相對表達量明顯增高，AM凋亡明顯增多，且兩者之間存在正相關關系。這表明GdCl3可能通過FasL激活而啟動凋亡信號通路，促使AM凋亡。
Fas/FasL系統是啟動細胞凋亡的上游途徑之一，GdCl3是否同時誘導引起細胞凋亡上游途徑的其他蛋白發生活化，以及引起AM凋亡的下游途徑是什么，其誘導AM發生凋亡機理較復雜，尚需我們今后進一步研究驗證。
重癥急性胰腺炎（SAP）是臨床常見危重疾病。盡管目前國內外對SAP的治療已有了長足發展，但其病死率仍高達20％～30％，其中65％的SAP患者死于急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[1]。筆者的前期研究[2-3]已發現肺泡巨噬細胞（AM）活化在SAP所致ALI中的主要作用，并已證實抑制AM活化，促使AM適度凋亡，可減輕SAP所致的ALI。然而，引起AM凋亡的機理較復雜，目前仍不清楚。本實驗將通過觀察FasL在AM中的表達，探討FasL在AM凋亡機理中的作用，以為臨床SAP所致肺損傷的治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑及儀器
氯化釓G-7532（美國Sigma公司）；牛磺酸鈉BR1383-1（晶美生物工程有限公司）；FasL抗體（美國SANTA公司）；胞漿蛋白提取試劑盒（北京普利萊公司）；EM208s透射電鏡（荷蘭Philips公司）；流式細胞儀FACACalibur（美國BD公司）。
1.2 實驗動物及分組
雄性SD大鼠48只（中國醫學科學院實驗動物研究所提供），體質量250～300 g。按數字表法隨機分成對照組、SAP組及氯化釓（GdCl3）組3組，每組16只。對照組：經胰膽管逆行注射生理鹽水（1 mL/kg）；SAP組：經胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉（1 mL/kg）制備SAP模型；GdCl3組在SAP模型制備成功后即刻按10 mg/kg經陰莖背靜脈注射GdCl3。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 支氣管肺泡灌洗及細胞培養
模型制備成功后6 h處死動物，取右肺下葉，備用。用4℃生理鹽水經支氣管行肺泡灌洗（每次10 mL，每只大鼠緩慢連續灌洗4次），收集灌洗液，并離心（1 500 r/min，r=12 cm，5 min）獲取細胞沉淀，將細胞沉淀置于培養皿中，在37℃、5% CO2條件下培養1 h，用20℃1 640培養液沖洗2次，去除未黏附細胞，再以2 000 r/min（r=9 cm）離心10 min，所獲細胞即為AM，備用。所有標本均重復檢查2次。
1.3.2 肺組織病理學檢查
取各組大鼠右肺下葉組織置10%甲醛溶液浸泡，石蠟包埋切片，行HE染色，光學顯微鏡下觀察肺組織的病理學改變。
1.3.3 透射電子顯微鏡觀察AM
將AM團按常規方法制備電鏡超薄切片，于透射電鏡下觀察AM的形態。
1.3.4 流式細胞儀檢測AM凋亡情況
將前述獲得的AM以Annexin V/FITC和碘化丙啶（PI）雙染色法于流式細胞儀上樣，檢測各組AM凋亡情況。
1.3.5 免疫印記Western blot法檢測AM中FasL蛋白表達水平
應用胞質蛋白制備試劑盒提取AM胞質蛋白并測定濃度后，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。結果用計算機掃描，用圖像分析系統測定目的條帶與內參的光密度值，并取兩者的比值作半定量分析。
1.4 統計學方法
計量數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 肺組織病理學改變
結果見圖 1。由圖 1可見，對照組肺泡組織結構清晰，肺泡壁薄，肺泡內未見滲出液；SAP組肺間隔彌漫增厚，肺間質明顯充血、水腫，有大量中性粒細胞浸潤；GdCl3組肺組織改變與SAP組相比有所減輕，但仍有中性粒細胞浸潤，肺呈輕度水腫改變。
圖1
示各組肺組織的病理學改變（HE×200）。1A：對照組；1B：SAP組；1C：GdCl3組??圖 2 ??示正常AM和典型的早期凋亡AM。2A：正常AM（TEM×5 000）；2B：黃
2.2 透射電子顯微鏡觀察結果
GdCl3組AM可見典型早期凋亡形態學特征，即細胞核染色質邊集，在細胞核膜周邊聚集形成新月體；細胞體積縮小，細胞膜表面微絨毛和偽足減少或消失（圖 2）；凋亡晚期可見凋亡小體。對照組及SAP組均無典型細胞凋亡形態出現。
2.3 流式細胞儀檢測AM凋亡率結果
GdCl3組中AM凋亡率顯著高于SAP組和對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；對照組大鼠的AM凋亡率較低，但高于SAP組，而低于GdCl3組，其差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表 1。
表1
各組AM凋亡率級AM中FasL蛋白相對表達量檢測結果（2.4 AM中FasL蛋白表達水平檢測結果
GdCl3組與對照組及SAP組相比，AM中FasL蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.01），見圖 3及表 1）。AM凋亡率與AM中FasL蛋白的表達呈明顯的線性正相關關系（R2=0.766，P＜0.01）。
圖3
示各組AM中的FasL蛋白表達
3 討論
SAP是臨床常見危重疾病，病情進展迅速，早期容易合并多種器官功能障礙，死亡率高[4]。因此，早期預防和治療ALI對降低SAP的病死率及改善疾病的預后具有重要意義。
細胞凋亡在急性胰腺炎發病過程中具有特殊重要的作用，誘導腺泡細胞凋亡可減輕急性胰腺炎病情[5-8]。研究[9]表明，SAP發生后，AM大量活化而導致肺損傷；應用GdCl3處理AM，發現GdCl3能誘導SAP大鼠AM發生凋亡，抑制AM活化，減少AM分泌炎癥介質，進而減輕肺損傷。但GdCl3如何誘導AM發生凋亡，其機理較復雜，目前仍不十分清楚。如果能探明AM凋亡的機理，將會為SAP肺損傷的早期預防和治療提供有力的理論支持。
FasL是TNF家族Ⅱ型跨膜蛋白，分子質量為31×103，糖基化后分子質量為36×103～43×103，Fas與其配體FasL結合可誘導細胞發生凋亡。Fas/FasL系統是多種疾病的細胞凋亡介質，參與外周T淋巴細胞克隆的清除和活化的T淋巴細胞的凋亡，具有免疫下調的作用[10-11]。在SAP中，通過Fas/FasL系統促進T淋巴細胞凋亡，引起CD4+細胞水平的降低而導致免疫功能的損害[12]。
近年來有研究[13-15]表明，Fas/FasL系統活化可能參與了AM的凋亡。Kitsmura等[13]發現，在內毒素誘導的小鼠ALI后，Fas/FasL在AM的表達均明顯上調，且Fas/FasL表達的增強與AM凋亡的增加呈平行關系，提示Fas/FasL系統活化可能參與了AM凋亡的機理。Peng等[14]和Gallagher等[15-16]發現，Fas/FasL系統的激活可誘導急性胰腺炎肝臟Kupffer細胞發生凋亡，進而導致肝損傷。本實驗結果發現，SAP時AM胞漿中FasL蛋白相對表達量較低，AM凋亡減少，而給予GdCl3干預治療后，AM胞漿中FasL蛋白相對表達量明顯增高，AM凋亡明顯增多，且兩者之間存在正相關關系。這表明GdCl3可能通過FasL激活而啟動凋亡信號通路，促使AM凋亡。
Fas/FasL系統是啟動細胞凋亡的上游途徑之一，GdCl3是否同時誘導引起細胞凋亡上游途徑的其他蛋白發生活化，以及引起AM凋亡的下游途徑是什么，其誘導AM發生凋亡機理較復雜，尚需我們今后進一步研究驗證。
