引用本文： 高俊勇, 余少鴻, 趙永恒, 王文學, 周琪, 李梅章. PLK1及STK15基因在結腸癌細胞中的表達及其特異性抑制劑對結腸癌細胞增殖的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(6): 702-706. doi: 10.7507/1007-9424.20140168 復制
結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。近年來研究[1-5]表明，腫瘤細胞的耐藥、惡性程度以及預后均與腫瘤細胞的增殖能力顯著相關。同時，控制腫瘤細胞增殖的關鍵物質是腫瘤細胞周期調控蛋白，除了已知的細胞周期蛋白B（cyclinB）、細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）等外[6]，其他一些重要的基因也參與其中，如保羅樣激酶1（polo-like kinase 1，PLK1） 基因、絲氨酸/蘇氨酸激酶15（serine/threonine kinase 15，STK15）基因等，它們分別從不同途徑調節細胞分裂期事件的啟動與進程[7-9]。PLK1基因是細胞周期從G2末期進入M期的關鍵“分子開關”，其在G2末期及M期均呈高表達，與某些腫瘤的生物學行為及預后相關。STK15基因在多種腫瘤中呈過表達[9-10]，與腫瘤細胞的中心體擴增以及異倍體形成有關[11-12]。國內蘭斌等[13]應用RNA干擾技術阻斷STK15基因的表達后，發現其可抑制結腸癌細胞的生長及增加化療藥物的敏感性。Hannak等[14]發現，抑制STK15基因的表達可磷酸化p53蛋白，從而促進細胞周期進程。為研究PLK1及STK15基因及其蛋白在結腸癌細胞中的表達及其特異性抑制劑對結腸癌細胞增殖的影響，本研究選取了3種結腸癌細胞（HCT-116細胞、HT-29細胞及CACO-2細胞），以Hela細胞為對照，分別采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法和Western blot法檢測其PLK1和STK15 mRNA及其蛋白的表達水平，采用偶氮唑鹽（MTT）法檢測應用SBE13（PLK1蛋白特異性抑制劑）或VX-680（STK15蛋白特異性抑制劑）處理后結腸癌細胞的增殖活性，以了解抑制PLK1及STK15蛋白對結腸癌細胞增殖的影響。
1 資料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
人宮頸癌Hela細胞及人結腸癌HCT-116細胞、HT-29細胞和CACO-2細胞均由中國醫學科學院昆明生物研究所惠贈。STK15抗體及PLK1抗體（Epitomics公司，美國），Actin抗體、細胞裂解液（RIPA）及MTT細胞增殖檢測試劑盒（碧云天公司，中國），10%胎牛血清（Biological Industries公司，美國），Dulbecco改良細胞培養基（DMEM培養基，Thermo Scientific公司，美國），天根一步法逆轉錄PCR試劑盒（天根公司，中國）。全自動凝膠圖像分析系統（Gel Doc100，Bio-Rad公司，美國）、PCR基因擴增儀（Life ECO公司，美國）、酶標儀（RT6000，深圳雷杜公司，中國）。
1.2 方法
1.2.1 引物合成
PLK1基因、STK15基因和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。PLK1基因引物序列：順義鏈為5′-AAGAGGAGGAAAGCCCTGAC-3′，反義鏈為5′-TTCTTCCTCTCCCCGTCATA-3′（擴增長度為199 bp）；STK15基因引物序列：順義鏈為5′-TGGCCAGGCTCAGCGGG-3′，反義鏈為5′-GTTCTCTGCTCATCAA-3′（擴增長度為575 bp）；β-actin引物序列：順義鏈為5′-AGCAACCGGGAGCTGGTGG-3′，反義鏈為5′-CATTTCCGACTGAAGAGTG-3′（擴增長度為358 bp）。
1.2.2 RT-PCR法檢測PLK1及STK15 mRNA的
表達 3種結腸癌細胞（HCT-116、HT-29和CACO-2細胞）與人宮頸癌Hela細胞樣本均按照試劑盒說明書直接進行裂解，提取RNA，分別用β-actin、STK15基因和PLK1基因引物對提取的RNA樣本進行PCR擴增。本實驗采用RT-PCR一步法測定PLK1 mRNA和STK15 mRNA的表達水平，操作按試劑盒說明書進行。以β-actin為內參照，將PCR擴增產物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳（60 V、20 min），采用全自動凝膠圖像分析系統掃描定量，以PLK1 mRNA及STK15 mRNA分別與β-actin mRNA的比值表示其表達水平的高低。4種細胞均重復測量3次。
1.2.3 Western blot法檢測PLK1蛋白及STK15蛋白的表達
4種細胞均用含10%胎牛血清的10 cmDMEM培養基在5%CO2、37 ℃的培養箱中培養。待細胞生長到85%～90%密度后，用RIPA冰上裂解30 min，4 ℃離心（12 000 r/min，r=13.5 cm，10 min）后取上清液。于上清液中加入上樣緩沖液混勻，煮沸5 min。用10%丙烯酰胺上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和轉膜。樣品以脫脂奶粉液封閉1 h后，加入STK15及PLK1一抗（1︰1 000）孵育（5%CO2、37 ℃）過夜，再加入兔二抗（1︰1 000）孵育（5%CO2、37 ℃） 2 h后，檢測蛋白樣品結合的辣根過氧化物酶（HRP）信號。采用全自動凝膠圖像分析系統掃描定量，以PLK1蛋白及STK15蛋白分別與β-actin的比值表示其表達水平的高低。4種細胞均重復測量3次。
1.2.4 MTT法檢測細胞的增殖
MTT細胞增殖檢測試劑盒廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的檢測。MTT可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成結晶狀的深紫色產物甲瓚（formazan），將其完全溶解后通過酶標儀測定570 nm波長附近的吸光度值（A值）。細胞增殖越多、越快，則A值越高。將3種結腸癌細胞與人宮頸癌Hela細胞在96孔板里傳代；當細胞生長到70%密度后，4種細胞均各分為5組（每組3個復孔），分別給予DMEM培養液20 μL、10%二甲基亞砜（DMSO） 20 μL、SBE13（100 pmol/L） 20 μL、VX-680（100 nmol/L） 20 μL及SBE13+VX-680各10 μL進行處理。待藥物處理36 h后，加入MTT溶液10 mL，在培養箱（5%CO2、37 ℃）中孵育4 h后，用甲瓚溶解液溶解6 h（37 ℃），在570 nm下測定A值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 4種細胞中PLK1 mRNA及STK15 mRNA的表達結果
與Hela細胞比較，HCT-116細胞的PLK1 mRNA及STK15 mRNA的平均表達水平分別升高了15%及60%，HT-29細胞分別升高了15%及70%，CACO-2細胞分別升高了15%及50%，差異均具有統計學意義（P<0.05）；3種結腸癌細胞間PLK1 mRNA或STK15 mRNA的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 1和圖 2。
圖1
示4種細胞PLK1 mRNA和STK15 mRNA的瓊脂糖凝膠電泳結果。1：Hela細胞；2：HCT-116細胞；3：HT-29細胞；4：CACO-2細胞 ? ?圖 2 示4種細胞PLK1 mRNA和STK15 mRNA的表達結果。與其他3種細胞比較，* P<0.05 ? ?圖 3 示4種細胞PLK1蛋白和STK15蛋白的SDS-PAGE電泳結果。 1：Hela細胞；2：HCT-116細胞；3：HT-29細胞；4：CACO-2細胞 ? ?圖 4 示4種細胞PLK1蛋白和STK15蛋白的表達結果。與其他3種細胞比較，* P<0.05 ? ?圖 5 示Hela細胞的增殖活性結果，5組間比較差異無統計學意義（P>0.05） ? ?圖 6 示HCT-116細胞的增殖活性結果。與DMEM組比較，* P<0.05；與VX-680組比較，△P<0.05 ? ?圖 7 示HT-29細胞的增殖活性結果。與DMEM組比較，* P<0.05；與VX-680組比較，△P<0.05 ? ?圖 8 示CACO-2細胞的增殖活性結果。與DMEM組比較，* P<0.05
Figure1.
Electrophoresis results of PLK1 and STK15 mRNA in 4 kinds of cells．1：Hela cells；2：HCT-116 cells；3：HT-29 cells；4：CACO-2 cells ? ?Figure 2 Expressions of PLK1 and STK15 mRNA in 4 kinds of cells．Compared with other 3 kinds of cells，* P<0.05 ? ?Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis results of PLK1 protein and STK15 protein in 4 kinds of cells．1：Hela cells；2：HCT-116 cells；3：HT-29 cells；4：CACO-2 cells ? ?Figure 4 Expressions of PLK1 protein and STK15 protein in 4 kinds of cells．Compared with other 3 kinds of cells，*P<0.05 ? ?Figure 5 Proliferative activity results of Hela cells，there was no significant difference in 5 groups（P>0.05） ? ?Figure 6 Proliferative activity results of HCT-116 cells. Compared with DMEM group，* P<0.05；Compared with VX-680 group，△P<0.05 ? ?Figure 7 Proliferative activity results of HT-29 cells. Compared with DMEM group，* P<0.05；Compared with VX-680 group，△P<0.05 ? ?Figure 8 Proliferative activity results of CACO-2 cells. Compared with DMEM group，* P<0.05
2.2 4種細胞中PLK1蛋白及STK15蛋白的表達結果
與Hela細胞比較，HCT-116細胞的PLK1蛋白及STK15蛋白的平均表達水平分別升高了250%及100%，HT-29細胞分別升高了200%及100%，CACO-2細胞分別升高了170%及100%，差異均具有統計學意義（P<0.05）。HCT-116細胞的PLK1蛋白表達水平較HT-29細胞升高了25%，差異有統計學意義（P<0.05）；較CACO-2細胞升高了47%，差異有統計學意義（P<0.01）。HT-29和CACO-2細胞的PLK1蛋白比較差異無統計學意義（P>0.05）。3種結腸癌細胞間STK15蛋白的表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3和圖 4。
2.3 抑制PLK1蛋白及STK15蛋白表達對4種細胞增殖的影響
Hela細胞：5組細胞間A570值比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 5。
HCT-116細胞：DMSO組與DMEM組比較，HCT-116細胞的增殖能力無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）；應用VX-680進行處理后，其平均增殖能力較DMEM組降低了33%，差異具有統計學意義（P<0.01）；單獨應用SBE13對其增殖能力無明顯抑制（P>0.05），但應用SBE13+VX-680后，其增殖能力較DMEM組降低了17%，差異具有統計學意義（P<0.05）；VX-680組的平均增殖能力較SBE13組降低了22%，差異具有統計學意義（P<0.05）；SBE13+VX-680組與SBE13組的差異無統計學意義（P>0.05）；SBE13+VX-680組與VX-680組的差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
HT-29細胞：DMSO組與DMEM組比較，HT-29細胞的增殖能力無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）；應用VX-680進行處理后，其平均增殖能力較DMEM組降低了25%，差異具有統計學意義（P<0.05）；單獨應用SBE13對其增殖能力無明顯抑制（P>0.05），但應用SBE13+VX-680后，其增殖能力較DMEM組降低了22%，差異具有統計學意義（P<0.05）；與SBE13+VX-680組比較，SBE13組和VX-680組的差異均無統計學意義（P>0.05），但VX-680組的表達水平較SBE13組降低了14.2%（P<0.05）。見圖 7。
CACO-2細胞：DMSO組與DMEM組比較，CACO-2細胞的增殖能力無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）；應用VX-680、SBE13及SBE13+VX-680進行處理后，其平均增殖能力較DMEM組分別降低了16.7%、13.3%及13.3%，差異均具有統計學意義（P<0.05）；SBE13組、VX-680組及SBE13+VX-680組間增殖能力的差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
3 討論
3.1 本實驗細胞的選擇
Hela細胞是一種宮頸癌細胞，是實驗室培養最普遍的細胞，其可以無限增殖分裂，因此被廣泛應用于實驗對照。HT-29細胞是人高分化結腸癌細胞，易形成球形，用于觀察腫瘤細胞間細胞連接與免疫細胞間的作用及機理；HCT-116細胞是人來源結腸癌細胞，處于結腸癌分化早期階段，更接近于干細胞特性；CACO-2細胞是一種人克隆結腸腺癌細胞，其結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞。選擇這3種處于分化不同階段的結腸癌細胞，有助于了解該3種細胞的PLK1及STK15的表達水平，以了解其表達是否與細胞類型有關。
3.2 PLK1和STK15基因及其蛋白的臨床意義
結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤。PLK1和STK15 mRNA及其蛋白表達水平與結腸癌細胞的增殖有關，它們分別從不同途徑調節細胞周期的啟動[15-17]。STK15基因在乳腺癌及膀胱癌中呈過表達，與腫瘤細胞的中心體擴增及異倍體形成有關[18-19]。
PLK1蛋白是細胞周期從G2末期進入M期關鍵的“分子開關”，在G2末期及M期均呈高表達，其對于G2/M期監測點的過渡、中心體形成、紡錘體生成、細胞質分裂及cyclinB/cdk2復合體的細胞內轉位均不可或缺[20-24]。本實驗結果表明，3種結腸癌細胞中PLK1 mRNA及其蛋白的表達水平均較Hela細胞高，提示PLK1基因及其蛋白的表達可特異性促進結腸癌細胞的增殖。另外，SBE13是PLK1蛋白的特異性抑制劑，采用SBE13對CACO-2細胞進行處理后，可以抑制CACO-2細胞的生長，與國內應用RNA干擾技術及藥物阻斷PLK1蛋白的表達可抑制結腸癌細胞增殖的結果一致[25-26]。HCT-116、HT-29細胞應用SBE13進行處理后，并未能明顯抑制腫瘤細胞的生長，其機理有待進一步研究。
STK15蛋白是一類廣泛存在于真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與細胞G2期向M期的轉換，其導致中心體異常擴增、異倍體形成以及細胞向惡性轉化，并與腫瘤的生物學行為有關。本實驗結果表明，3種結腸癌細胞中STK15 mRNA及其蛋白的表達水平均較Hela細胞高，提示STK15基因及蛋白可特異性促進結腸癌細胞增殖。VX-680是STK15蛋白的特異性抑制劑，本實驗采用VX-680對3種結腸癌細胞進行處理后，發現其可明顯抑制腫瘤細胞的生長，與蘭斌等[13]的結果一致。
PLK1基因及STK15基因對于調節結腸癌細胞的G2/M期轉換、中心體成熟、雙極紡錘體形成與張力的維持不可或缺，一旦其功能受到抑制，可能使上述細胞的分裂機理受損，導致分裂停滯于G2末期或M前期。阻斷PLK1或STK15蛋白的表達有可能會抑制腫瘤細胞的生長。PLK1及STK15蛋白有望成為腫瘤治療的候選靶點。
結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。近年來研究[1-5]表明，腫瘤細胞的耐藥、惡性程度以及預后均與腫瘤細胞的增殖能力顯著相關。同時，控制腫瘤細胞增殖的關鍵物質是腫瘤細胞周期調控蛋白，除了已知的細胞周期蛋白B（cyclinB）、細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）等外[6]，其他一些重要的基因也參與其中，如保羅樣激酶1（polo-like kinase 1，PLK1） 基因、絲氨酸/蘇氨酸激酶15（serine/threonine kinase 15，STK15）基因等，它們分別從不同途徑調節細胞分裂期事件的啟動與進程[7-9]。PLK1基因是細胞周期從G2末期進入M期的關鍵“分子開關”，其在G2末期及M期均呈高表達，與某些腫瘤的生物學行為及預后相關。STK15基因在多種腫瘤中呈過表達[9-10]，與腫瘤細胞的中心體擴增以及異倍體形成有關[11-12]。國內蘭斌等[13]應用RNA干擾技術阻斷STK15基因的表達后，發現其可抑制結腸癌細胞的生長及增加化療藥物的敏感性。Hannak等[14]發現，抑制STK15基因的表達可磷酸化p53蛋白，從而促進細胞周期進程。為研究PLK1及STK15基因及其蛋白在結腸癌細胞中的表達及其特異性抑制劑對結腸癌細胞增殖的影響，本研究選取了3種結腸癌細胞（HCT-116細胞、HT-29細胞及CACO-2細胞），以Hela細胞為對照，分別采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法和Western blot法檢測其PLK1和STK15 mRNA及其蛋白的表達水平，采用偶氮唑鹽（MTT）法檢測應用SBE13（PLK1蛋白特異性抑制劑）或VX-680（STK15蛋白特異性抑制劑）處理后結腸癌細胞的增殖活性，以了解抑制PLK1及STK15蛋白對結腸癌細胞增殖的影響。
1 資料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
人宮頸癌Hela細胞及人結腸癌HCT-116細胞、HT-29細胞和CACO-2細胞均由中國醫學科學院昆明生物研究所惠贈。STK15抗體及PLK1抗體（Epitomics公司，美國），Actin抗體、細胞裂解液（RIPA）及MTT細胞增殖檢測試劑盒（碧云天公司，中國），10%胎牛血清（Biological Industries公司，美國），Dulbecco改良細胞培養基（DMEM培養基，Thermo Scientific公司，美國），天根一步法逆轉錄PCR試劑盒（天根公司，中國）。全自動凝膠圖像分析系統（Gel Doc100，Bio-Rad公司，美國）、PCR基因擴增儀（Life ECO公司，美國）、酶標儀（RT6000，深圳雷杜公司，中國）。
1.2 方法
1.2.1 引物合成
PLK1基因、STK15基因和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。PLK1基因引物序列：順義鏈為5′-AAGAGGAGGAAAGCCCTGAC-3′，反義鏈為5′-TTCTTCCTCTCCCCGTCATA-3′（擴增長度為199 bp）；STK15基因引物序列：順義鏈為5′-TGGCCAGGCTCAGCGGG-3′，反義鏈為5′-GTTCTCTGCTCATCAA-3′（擴增長度為575 bp）；β-actin引物序列：順義鏈為5′-AGCAACCGGGAGCTGGTGG-3′，反義鏈為5′-CATTTCCGACTGAAGAGTG-3′（擴增長度為358 bp）。
1.2.2 RT-PCR法檢測PLK1及STK15 mRNA的
表達 3種結腸癌細胞（HCT-116、HT-29和CACO-2細胞）與人宮頸癌Hela細胞樣本均按照試劑盒說明書直接進行裂解，提取RNA，分別用β-actin、STK15基因和PLK1基因引物對提取的RNA樣本進行PCR擴增。本實驗采用RT-PCR一步法測定PLK1 mRNA和STK15 mRNA的表達水平，操作按試劑盒說明書進行。以β-actin為內參照，將PCR擴增產物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳（60 V、20 min），采用全自動凝膠圖像分析系統掃描定量，以PLK1 mRNA及STK15 mRNA分別與β-actin mRNA的比值表示其表達水平的高低。4種細胞均重復測量3次。
1.2.3 Western blot法檢測PLK1蛋白及STK15蛋白的表達
4種細胞均用含10%胎牛血清的10 cmDMEM培養基在5%CO2、37 ℃的培養箱中培養。待細胞生長到85%～90%密度后，用RIPA冰上裂解30 min，4 ℃離心（12 000 r/min，r=13.5 cm，10 min）后取上清液。于上清液中加入上樣緩沖液混勻，煮沸5 min。用10%丙烯酰胺上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和轉膜。樣品以脫脂奶粉液封閉1 h后，加入STK15及PLK1一抗（1︰1 000）孵育（5%CO2、37 ℃）過夜，再加入兔二抗（1︰1 000）孵育（5%CO2、37 ℃） 2 h后，檢測蛋白樣品結合的辣根過氧化物酶（HRP）信號。采用全自動凝膠圖像分析系統掃描定量，以PLK1蛋白及STK15蛋白分別與β-actin的比值表示其表達水平的高低。4種細胞均重復測量3次。
1.2.4 MTT法檢測細胞的增殖
MTT細胞增殖檢測試劑盒廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的檢測。MTT可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成結晶狀的深紫色產物甲瓚（formazan），將其完全溶解后通過酶標儀測定570 nm波長附近的吸光度值（A值）。細胞增殖越多、越快，則A值越高。將3種結腸癌細胞與人宮頸癌Hela細胞在96孔板里傳代；當細胞生長到70%密度后，4種細胞均各分為5組（每組3個復孔），分別給予DMEM培養液20 μL、10%二甲基亞砜（DMSO） 20 μL、SBE13（100 pmol/L） 20 μL、VX-680（100 nmol/L） 20 μL及SBE13+VX-680各10 μL進行處理。待藥物處理36 h后，加入MTT溶液10 mL，在培養箱（5%CO2、37 ℃）中孵育4 h后，用甲瓚溶解液溶解6 h（37 ℃），在570 nm下測定A值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 4種細胞中PLK1 mRNA及STK15 mRNA的表達結果
與Hela細胞比較，HCT-116細胞的PLK1 mRNA及STK15 mRNA的平均表達水平分別升高了15%及60%，HT-29細胞分別升高了15%及70%，CACO-2細胞分別升高了15%及50%，差異均具有統計學意義（P<0.05）；3種結腸癌細胞間PLK1 mRNA或STK15 mRNA的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 1和圖 2。
圖1
示4種細胞PLK1 mRNA和STK15 mRNA的瓊脂糖凝膠電泳結果。1：Hela細胞；2：HCT-116細胞；3：HT-29細胞；4：CACO-2細胞 ? ?圖 2 示4種細胞PLK1 mRNA和STK15 mRNA的表達結果。與其他3種細胞比較，* P<0.05 ? ?圖 3 示4種細胞PLK1蛋白和STK15蛋白的SDS-PAGE電泳結果。 1：Hela細胞；2：HCT-116細胞；3：HT-29細胞；4：CACO-2細胞 ? ?圖 4 示4種細胞PLK1蛋白和STK15蛋白的表達結果。與其他3種細胞比較，* P<0.05 ? ?圖 5 示Hela細胞的增殖活性結果，5組間比較差異無統計學意義（P>0.05） ? ?圖 6 示HCT-116細胞的增殖活性結果。與DMEM組比較，* P<0.05；與VX-680組比較，△P<0.05 ? ?圖 7 示HT-29細胞的增殖活性結果。與DMEM組比較，* P<0.05；與VX-680組比較，△P<0.05 ? ?圖 8 示CACO-2細胞的增殖活性結果。與DMEM組比較，* P<0.05
Figure1.
Electrophoresis results of PLK1 and STK15 mRNA in 4 kinds of cells．1：Hela cells；2：HCT-116 cells；3：HT-29 cells；4：CACO-2 cells ? ?Figure 2 Expressions of PLK1 and STK15 mRNA in 4 kinds of cells．Compared with other 3 kinds of cells，* P<0.05 ? ?Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis results of PLK1 protein and STK15 protein in 4 kinds of cells．1：Hela cells；2：HCT-116 cells；3：HT-29 cells；4：CACO-2 cells ? ?Figure 4 Expressions of PLK1 protein and STK15 protein in 4 kinds of cells．Compared with other 3 kinds of cells，*P<0.05 ? ?Figure 5 Proliferative activity results of Hela cells，there was no significant difference in 5 groups（P>0.05） ? ?Figure 6 Proliferative activity results of HCT-116 cells. Compared with DMEM group，* P<0.05；Compared with VX-680 group，△P<0.05 ? ?Figure 7 Proliferative activity results of HT-29 cells. Compared with DMEM group，* P<0.05；Compared with VX-680 group，△P<0.05 ? ?Figure 8 Proliferative activity results of CACO-2 cells. Compared with DMEM group，* P<0.05
2.2 4種細胞中PLK1蛋白及STK15蛋白的表達結果
與Hela細胞比較，HCT-116細胞的PLK1蛋白及STK15蛋白的平均表達水平分別升高了250%及100%，HT-29細胞分別升高了200%及100%，CACO-2細胞分別升高了170%及100%，差異均具有統計學意義（P<0.05）。HCT-116細胞的PLK1蛋白表達水平較HT-29細胞升高了25%，差異有統計學意義（P<0.05）；較CACO-2細胞升高了47%，差異有統計學意義（P<0.01）。HT-29和CACO-2細胞的PLK1蛋白比較差異無統計學意義（P>0.05）。3種結腸癌細胞間STK15蛋白的表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3和圖 4。
2.3 抑制PLK1蛋白及STK15蛋白表達對4種細胞增殖的影響
Hela細胞：5組細胞間A570值比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 5。
HCT-116細胞：DMSO組與DMEM組比較，HCT-116細胞的增殖能力無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）；應用VX-680進行處理后，其平均增殖能力較DMEM組降低了33%，差異具有統計學意義（P<0.01）；單獨應用SBE13對其增殖能力無明顯抑制（P>0.05），但應用SBE13+VX-680后，其增殖能力較DMEM組降低了17%，差異具有統計學意義（P<0.05）；VX-680組的平均增殖能力較SBE13組降低了22%，差異具有統計學意義（P<0.05）；SBE13+VX-680組與SBE13組的差異無統計學意義（P>0.05）；SBE13+VX-680組與VX-680組的差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
HT-29細胞：DMSO組與DMEM組比較，HT-29細胞的增殖能力無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）；應用VX-680進行處理后，其平均增殖能力較DMEM組降低了25%，差異具有統計學意義（P<0.05）；單獨應用SBE13對其增殖能力無明顯抑制（P>0.05），但應用SBE13+VX-680后，其增殖能力較DMEM組降低了22%，差異具有統計學意義（P<0.05）；與SBE13+VX-680組比較，SBE13組和VX-680組的差異均無統計學意義（P>0.05），但VX-680組的表達水平較SBE13組降低了14.2%（P<0.05）。見圖 7。
CACO-2細胞：DMSO組與DMEM組比較，CACO-2細胞的增殖能力無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）；應用VX-680、SBE13及SBE13+VX-680進行處理后，其平均增殖能力較DMEM組分別降低了16.7%、13.3%及13.3%，差異均具有統計學意義（P<0.05）；SBE13組、VX-680組及SBE13+VX-680組間增殖能力的差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
3 討論
3.1 本實驗細胞的選擇
Hela細胞是一種宮頸癌細胞，是實驗室培養最普遍的細胞，其可以無限增殖分裂，因此被廣泛應用于實驗對照。HT-29細胞是人高分化結腸癌細胞，易形成球形，用于觀察腫瘤細胞間細胞連接與免疫細胞間的作用及機理；HCT-116細胞是人來源結腸癌細胞，處于結腸癌分化早期階段，更接近于干細胞特性；CACO-2細胞是一種人克隆結腸腺癌細胞，其結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞。選擇這3種處于分化不同階段的結腸癌細胞，有助于了解該3種細胞的PLK1及STK15的表達水平，以了解其表達是否與細胞類型有關。
3.2 PLK1和STK15基因及其蛋白的臨床意義
結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤。PLK1和STK15 mRNA及其蛋白表達水平與結腸癌細胞的增殖有關，它們分別從不同途徑調節細胞周期的啟動[15-17]。STK15基因在乳腺癌及膀胱癌中呈過表達，與腫瘤細胞的中心體擴增及異倍體形成有關[18-19]。
PLK1蛋白是細胞周期從G2末期進入M期關鍵的“分子開關”，在G2末期及M期均呈高表達，其對于G2/M期監測點的過渡、中心體形成、紡錘體生成、細胞質分裂及cyclinB/cdk2復合體的細胞內轉位均不可或缺[20-24]。本實驗結果表明，3種結腸癌細胞中PLK1 mRNA及其蛋白的表達水平均較Hela細胞高，提示PLK1基因及其蛋白的表達可特異性促進結腸癌細胞的增殖。另外，SBE13是PLK1蛋白的特異性抑制劑，采用SBE13對CACO-2細胞進行處理后，可以抑制CACO-2細胞的生長，與國內應用RNA干擾技術及藥物阻斷PLK1蛋白的表達可抑制結腸癌細胞增殖的結果一致[25-26]。HCT-116、HT-29細胞應用SBE13進行處理后，并未能明顯抑制腫瘤細胞的生長，其機理有待進一步研究。
STK15蛋白是一類廣泛存在于真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與細胞G2期向M期的轉換，其導致中心體異常擴增、異倍體形成以及細胞向惡性轉化，并與腫瘤的生物學行為有關。本實驗結果表明，3種結腸癌細胞中STK15 mRNA及其蛋白的表達水平均較Hela細胞高，提示STK15基因及蛋白可特異性促進結腸癌細胞增殖。VX-680是STK15蛋白的特異性抑制劑，本實驗采用VX-680對3種結腸癌細胞進行處理后，發現其可明顯抑制腫瘤細胞的生長，與蘭斌等[13]的結果一致。
PLK1基因及STK15基因對于調節結腸癌細胞的G2/M期轉換、中心體成熟、雙極紡錘體形成與張力的維持不可或缺，一旦其功能受到抑制，可能使上述細胞的分裂機理受損，導致分裂停滯于G2末期或M前期。阻斷PLK1或STK15蛋白的表達有可能會抑制腫瘤細胞的生長。PLK1及STK15蛋白有望成為腫瘤治療的候選靶點。
