引用本文： 高洪元, 田守金, 吳學勇. microRNA-31對AGS人胃癌細胞增殖、遷移及其LRH-1表達的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(6): 682-687. doi: 10.7507/1007-9424.20140164 復制
腫瘤已經成為人類生命和健康的首要殺手，其中胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。盡管目前治療胃癌的手段多樣，但總體療效仍不理想，亟待研究發現新的治療靶點及藥物。研究[1-6]表明，微小RNA（microRNA）在細胞增殖、分化、凋亡、基因調控及腫瘤的發生中均扮演重要的角色，因此關于microRNA對胃癌等腫瘤疾病治療作用的研究正成為一個新的熱點。大量研究[7-11]表明，microRNA-31（miR-31）在胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌及膀胱癌組織中的表達水平均明顯降低，其可抑制DNA復制及細胞周期。Zhang等[7]報道，miR-31可作為臨床診斷胃癌的生物標志物，但是miR-31在胃癌中的作用機理仍然還在研究中。成纖維細胞核受體（LRH-1/NR5A2）基因是近年來發現的在胃癌中高表達的重要基因[12]，是β-連環素信號通路中控制細胞增殖的重要轉錄因子，可促進胃細胞系的增殖[13]。通過Target Scan [14]、Pic Tar [15]和DIANA LAB [16]的靶點預測工具搜索，均可發現LRH-1（或NR5A2）基因為miR-31潛在的靶基因。因此，為進一步明確miR-31和LRH-1基因的關系，需對兩者進行深入研究。本研究擬通過體外胃癌細胞系AGS細胞實驗，研究miR-31對其增殖、遷移等細胞生物學行為的影響，并考察miR-31對重要致癌基因即LRH-1基因的抑制作用，為研究miR-31的調控機理打下基礎，進一步為體內試驗和臨床應用提供參考依據。
1 材料和方法
1.1 主要材料、試劑與設備
主要材料和試劑：人胃癌細胞系AGS和293T細胞（美國American Type Culture Collection中心），SGC-7901、BGC-823、MKN45和MKN28細胞系（上海克里克生物醫藥科技有限公司），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），高糖DMEM培養基（美國HyC-lone公司），RPMI 1640培養液（美國Gibco公司），細胞增殖和細胞毒性試劑盒（CCK-8試劑盒，美國Dojindo Laboratories公司），放射免疫沉淀測定（RIPA）細胞裂解液和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）均購自上海碧云天生物技術有限公司，miR-31（廣州銳博生物技術有限公司），雙亞麻油酸磷脂膽堿（DLPC，美國Sigma公司），LipofectamineTM2000轉染試劑盒和Trizol試劑（美國Invitrogen公司），Anne-xin V-FITC/PI雙染試劑盒（美國BD公司），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（廣州玉博生物科技有限公司），Transwell小室（美國Costa公司），質粒抽提試劑盒（德國QIAGEN公司），質粒載體pMIRREPORTLuciferase（美國Ambion公司），蛋白抽提液、BCA蛋白定量試劑盒及5×蛋白上樣緩沖液（美國Pierce公司），LRH-1抗體（美國Abcam公司），反轉錄試劑盒（日本Takara公司）。設備：SpectraMax Plus384酶標儀（美國Molecular Devices公司），FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD Biosciences公司），MZFLⅢ熒光顯微鏡（德國徠卡儀器有限公司），Prism? 7300 PCR儀（美國應用生物系統公司），TD-20/20熒光素酶報告基因檢測儀（美國Sunnyvale公司），nano-drop 2000分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司），ImageJ 2.1軟件（美國National Institutes of Health），Target Scan 6.2軟件（美國麻省理工大學白頭翁研究所）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
AGS、SGC-7901、BGC-823、MKN-45和MKN28細胞均用含有10% FBS的RPMI 1640培養液培養，293T細胞則用含有10% FBS的高糖DMEM培養基培養，均在37 ℃、5% CO2條件下（后同）于培養箱內培養（各培養4～5 d），取對數生長期細胞進行實驗。AGC細胞具有典型的腫瘤細胞形態與超微結構惡性表型[17-18]。目前，AGS細胞已在許多體外胃癌相關研究中使用[19-21]。通過研究miR-31和RUN44（內參）的臨界循環數（Ct值）在各種細胞系中（包括AGS、SGC-7901、BGC-823、MKN45和MKN28細胞系）的比值變化，最終表明AGS細胞系中的miR-31表達量較低（miR-31表達水平均值：AGS細胞系為0.50，SGC-7901細胞系為0.80，BGC-823細胞系為0.77，MKN45細胞系為1.22，MKN28細胞系為1.08）。故選取AGS細胞進行本實驗研究，以觀察miR-31表達的變化對細胞增殖等指標的影響。
1.2.2 細胞分組及轉染
AGS細胞經過0.25%胰蛋白酶消化傳代后，取對數生長期的細胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板。實驗分為3組：miR-31轉染組（MT組，轉染miR-31）、陰性對照組（NC組，轉染miR-31陰性對照序列即空脂質體）和空白對照組（BC組，僅加入磷酸鹽緩沖溶液PBS）。分別用250 μL無血清的RPMI 1640培養液稀釋10 μL脂質體轉染試劑（LipofectamineTM2000）及15 μL的相應轉染物（MT組為miR-31，NC組為空脂質體，BC組為PBS溶液），室溫靜置5 min后，加入相應的復孔中；其余操作按轉染試劑盒說明書進行。最后在培養箱內培養，供后續實驗使用。
1.2.3 miR-31表達水平的檢測和細胞增殖能力測定
將總RNA進行miRNA逆轉錄和實時PCR檢測，具體步驟同文獻[22]。以RUN44為內參，計算各組miR-31的Ct值與內參RUN44的比值。細胞增殖能力測定步驟參照CCK-8試劑盒說明書進行，且吸光度值（A值）與細胞數目呈正比。將轉染24 h后的AGS細胞（包括MT組，BC組和NC組）按6×103個/孔的密度接種于96孔培養板（100 μL/孔）中3～4 h，待細胞貼壁后加入100 μL RPMI 1640完全培養液和10 μL CCK-8試劑，于培養箱內培養2 h。采用酶標儀測定各孔溶液的A450值，測定時點分別為轉染后0、1、2、3和4 d（各時間點均做3個復孔）。
另取未轉染的AGS對數生長期細胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板。其中3個復孔加10%FBS的RPMI 1640培養液2 mL作空白對照（BK組），另3個復孔加入含DLPC（50 nmol/L）的細胞培養液2 mL作為抑制劑組（DLPC組），各自培養24 h。24 h后更換新的培養基繼續培養4 d，期間正常更換培養基。2組均于處理后0、1、2、3和4 d測定細胞增殖能力（方法同上）。
1.2.4 細胞凋亡和周期檢測
將3組轉染后的AGS細胞在37 ℃培養箱內培養48 h后，4 ℃離心（1 000 r/min，r=3 cm，5 min）收集細胞。采用AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒于流式細胞儀進行細胞凋亡及細胞周期檢測，操作按試劑盒說明書進行。以Annexin-V-FITC（+）/PI（－）為G1及S期凋亡細胞，Annexin-V-FITC（+）/PI（+）為G2期和M期凋亡細胞，每組測量3次（求均值）。
1.2.5 細胞遷移能力測定
3組細胞經轉染處理24 h后，在Transwell小室的中下室內加入500 μL含10% FBS的RPMI 1640培養液，上室內加入以無血清RPMI 1640培養液稀釋的細胞懸液250 μL（細胞濃度為1×l05個/mL）；在培養箱內培養48 h后，用棉簽擦掉上室細胞，以4%多聚甲醛固定，以0.1%結晶紫染色并室溫孵育10 min。取出小室，用PBS溶液清洗后于顯微鏡下計數。3組均在低倍鏡（200倍）下隨機取5個視野計數（求和），并比較3組間穿過小室的細胞數的差異。3組均重復實驗3次。
1.2.6 Western blot法檢測LRH-1蛋白的表達
3組轉染細胞分別進行細胞總蛋白提取。用PBS溶液沖洗6孔板上的細胞3次（每次1 min）；將RIPA細胞裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑混合（100︰1），分別加入3組細胞的3個復孔中（50 μL/孔）；將培養板置于冰上裂解30 min后反復吹打。收集細胞裂解液于離心管中，于4 ℃下離心（12 000 r/min，r=2 cm，10 min）。吸取上清液，用BCA法檢測蛋白質含量，符合要求后用5×蛋白上樣緩沖液以4︰1的比例混合，98 ℃水浴5 min后置于冰上2 min。取30 μg總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。在20 V恒壓下半干轉膜1 h，以5%脫脂牛奶封閉液封閉。采用5 mL封閉液稀釋鼠抗人LRH-1抗體（一抗，1︰500），加入孵育盒中，4 ℃下搖床（振幅15 mm）過夜。棄去一抗，以磷酸鹽緩沖封閉液（TBST）洗3次（10 min/次），加入以TBST稀釋的HRP標記的羊抗鼠抗體（二抗，1︰500），室溫孵育1 h。再以TBST液漂洗3次（10 min/次）。加入超敏曝光液（ECL）曝光，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參照，用ImageJ 2.1軟件分析灰度值。以LRH-1蛋白和GAPDH灰度值的比值表示LRH-1蛋白的相對表達水平。
1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測
應用Target Scan軟件分析后得出，LRH-1基因為miR-31的靶基因，再通過雙熒光素酶報告基因進一步驗證。攜帶LRH-1基因的3′端非翻譯區（3′-UTR）野生型載體（pGL3-LRH-1-3’-UTR-WT）及突變型載體（pGL3-LRH-1-3′-UTR-MT）均由廣州銳博生物科技有限公司合成。將293T細胞接種于96孔板中，分別轉染miR-31-LRH-1野生型載體、miR-31-LRH-1突變型載體、空野生型載體及空突變型載體（各種載體均做3個復孔），操作按LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行。24 h后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測相對熒光素酶活性（即海腎熒光素與螢火蟲熒光素的比值）。
1.3 統計學方法
采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料的統計分析方法采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 轉染后miR-31的表達
通過PCR法檢測miR-31的表達，在以RUN44為內參的情況下，未轉染miR-31的NC組和BC組其表達水平的均值分別為0.50和0.49，而轉染miR-31的MT組為1.18，高于NC組和BC組（P<0.05），提示MT組細胞轉染成功。
2.2 miR-31和LRH-1基因對AGS胃癌細胞增殖的影響
除0 d外，MT組的A450均值均明顯低于NC組和BC組（P<0.01）。至4 d實驗結束時，MT組A450的均值為1.31，而BC和NC組均在2.0以上（表 1）。0～4 d內，NC組和BC組間A450值的差距均不大（P>0.05）。
表1
5組AGS細胞不同時間點的A450值（n=3，為表明LRH-1基因和AGS細胞的增殖具有密切關系，本實驗采用DLPC（LRH-1基因抑制劑）對LRH-1基因的作用進行抑制。通過4 d的增殖實驗，結果表明，各時點DLPC組A450的均值低于BK組（P<0.05），提示DLPC組AGS細胞的增殖速度低于BK組，表明LRH-1基因在AGS細胞的增殖過程中發揮著重要作用。
2.3 miR-31對AGS胃癌細胞凋亡的影響
通過流式細胞儀（圖 1）的計算可以得出，MT組細胞的平均細胞凋亡率為39.5%，NC組和BC組分別為9.3%和10.0%。MT組的AGS細胞調亡率明顯高于NC組和BC組（P<0.01），表明通過轉染miR-31后其表達的實現起到了促進AGS細胞凋亡的作用。
圖1
示NC組、BC組及MT組細胞的流式細胞圖。1A：NC組；1B：BC組；1C：MT組
Figure1.
The flow cytometry graphs of AGS cells in NC，BC，and MT groups. 1A：NC groups；1B：BC group；1C：MT group
2.4 miR-31對AGS胃癌細胞周期的影響
AGS細胞經miR-31轉染后，其細胞周期受到影響。在轉染48 h后，MT組的G1+S期、單獨G1期及S期的細胞比例均高于BC組和NC組（P<0.05），而BC組和NC組間各細胞周期比例的差異不大（P>0.05），見表 2。
表2
NC組、BC組及MT組細胞的細胞周期構成（%，n=3，2.5 miR-31對AGS胃癌細胞遷移的影響
MT組Transwell小室中的遷移細胞數明顯較NC組和BC組少（圖 2），表明MT組的細胞遷移能力較低。比較穿過小室的平均細胞數發現（圖 3），MT組的細胞遷移數目約為BC組和NC組的1/3（P<0.05），而NC組和BC組之間的差距并不大，差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
示NC組、BC組及MT組細胞的Transwell小室觀察結果（結晶紫染色 ×200）。2A：NC組；2B：BC組；2C：MT組 ? ?圖 3 示NC組、BC組及MT組的遷移細胞數量。與MT組比較，* P<0.05 ? ?圖 4 示NC組、BC組及MT組LRH-1蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。1：NC組；2：BC組；3：MT組 ? ?圖 5 示NC組、BC組及MT組細胞LRH-1蛋白的表達結果。與MT組比較，* P<0.05
Figure2.
The observed results of Transwell in NC，BC，and MT group （crystal violet staining ×200）. 2A：NC group；2B：BC group；2C：MT group ? ?Figure 3 The number of migrated cells in NC，BC，and MT group. Compared with MT group，* P<0.05 ? ?Figure 4 The polyacry-
2.6 miR-31對LRH-1蛋白表達的影響
Western blot法的檢測結果表明，MT組細胞中LRH-1蛋白的平均表達水平下降（圖 4和圖 5），較NC組和BC組均低（P<0.01），而NC組和BC組間的差距不大（P>0.05）。
2.7 miR-31靶點驗證結果
雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，miR-31-LRH-1野生型載體組、miR-31-LRH-1突變型載體組、空野生型載體組及空突變型載體組細胞的熒光素酶活性的均值分別為0.40、0.81、0.76及0.81。miR-31-野生型載體組的熒光素酶活性較低（P<0.01），表明miR-31的確能有效結合LRH-1基因的3′-UTR端，LRH-1基因是miR-31的靶點。
3 討論
miR-31是在胃癌組織中特異性低表達的小RNA，其被認為是可以用于胃癌臨床診斷的標志物[7]。有研究[10]表明，miR-31的低表達和p53通路的干擾有關。若癌癥患者的p53信號通路受到嚴重干擾，或許miR-31將是有效的治療藥物。但是miR-31的作用特點、作用機理及其作用靶基因還在探索研究之中。
LRH-1基因不僅在膽固醇和膽酸的代謝平衡中起重要作用，而且可促進癌細胞的增殖和細胞周期。LRH-1基因和胰腺癌、胃癌和乳腺癌間均具有相關性，在這些癌癥中LRH-1基因的表達水平都異常升高[12-13, 23]。其可以通過調控細胞周期刺激小鼠胰腺癌細胞（LTPA）和小鼠肝細胞（FL83B）的增殖[24]。在氧化偶氮甲烷誘導的胰腺腫瘤小鼠的實驗[25]中，LRH-1基因表達的下調可降低癌癥的發生率和提高存活率。LRH-1基因也被認為是雌激素的靶基因，表現為雌激素誘導下可促進細胞增殖[26]。
在本實驗中，筆者首先探索了原本低表達miR-31的AGS細胞高表達miR-31后其增殖的變化，結果表明，高表達miR-31可顯著抑制AGS細胞的增殖。AGS細胞凋亡率檢測結果表明，高表達miR-31可顯著增加AGS細胞的凋亡。癌細胞的遷移是癌癥難以治愈的重要原因之一。為考察高表達miR-31對AGS細胞遷移的影響，本研究進行了Transwell小室實驗，結果表明，miR-31對AGS細胞的遷移具有明顯的抑制作用，進一步說明了miR-31可抑制AGS細胞在胃癌疾病進展中的轉移。
此外，為考察miR-31的作用機理，經過計算機模擬，本研究將miR-31的靶點鎖定在LRH-1基因上。通過Western blot方法和雙熒光素酶報告基因檢測，最終發現了miR-31可能通過抑制LRH-1蛋白的表達來發揮其對AGS細胞的作用。為證實miR-31是通過LRH-1基因來抑制AGS細胞增殖的，本研究又采用DLPC抑制劑對LRH-1基因進行特異性拮抗。實驗結果表明，LRH-1基因拮抗后AGS細胞的增殖受到很大影響，其增殖水平低于BK組。因此本實驗結果提示，高表達的miR-31可以通過抑制AGS細胞中LRH-1基因的表達，從而達到其抑制AGS細胞增殖的作用。
本實驗以人胃癌細胞AGS細胞系為研究對象，探討了轉染miR-31后AGS細胞的增殖、凋亡、遷移和對LRH-1基因表達的影響。結果表明，miR-31在人胃癌細胞中具有較強的抑制細胞增殖的作用，可明顯降低癌細胞的存活率，使G1+S期細胞所占的比例增加，并對細胞的遷移具有顯著的抑制作用，提示miR-31對胃癌細胞具有較強的殺傷力，可作為胃癌治療的潛在藥物。
腫瘤已經成為人類生命和健康的首要殺手，其中胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。盡管目前治療胃癌的手段多樣，但總體療效仍不理想，亟待研究發現新的治療靶點及藥物。研究[1-6]表明，微小RNA（microRNA）在細胞增殖、分化、凋亡、基因調控及腫瘤的發生中均扮演重要的角色，因此關于microRNA對胃癌等腫瘤疾病治療作用的研究正成為一個新的熱點。大量研究[7-11]表明，microRNA-31（miR-31）在胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌及膀胱癌組織中的表達水平均明顯降低，其可抑制DNA復制及細胞周期。Zhang等[7]報道，miR-31可作為臨床診斷胃癌的生物標志物，但是miR-31在胃癌中的作用機理仍然還在研究中。成纖維細胞核受體（LRH-1/NR5A2）基因是近年來發現的在胃癌中高表達的重要基因[12]，是β-連環素信號通路中控制細胞增殖的重要轉錄因子，可促進胃細胞系的增殖[13]。通過Target Scan [14]、Pic Tar [15]和DIANA LAB [16]的靶點預測工具搜索，均可發現LRH-1（或NR5A2）基因為miR-31潛在的靶基因。因此，為進一步明確miR-31和LRH-1基因的關系，需對兩者進行深入研究。本研究擬通過體外胃癌細胞系AGS細胞實驗，研究miR-31對其增殖、遷移等細胞生物學行為的影響，并考察miR-31對重要致癌基因即LRH-1基因的抑制作用，為研究miR-31的調控機理打下基礎，進一步為體內試驗和臨床應用提供參考依據。
1 材料和方法
1.1 主要材料、試劑與設備
主要材料和試劑：人胃癌細胞系AGS和293T細胞（美國American Type Culture Collection中心），SGC-7901、BGC-823、MKN45和MKN28細胞系（上海克里克生物醫藥科技有限公司），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），高糖DMEM培養基（美國HyC-lone公司），RPMI 1640培養液（美國Gibco公司），細胞增殖和細胞毒性試劑盒（CCK-8試劑盒，美國Dojindo Laboratories公司），放射免疫沉淀測定（RIPA）細胞裂解液和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）均購自上海碧云天生物技術有限公司，miR-31（廣州銳博生物技術有限公司），雙亞麻油酸磷脂膽堿（DLPC，美國Sigma公司），LipofectamineTM2000轉染試劑盒和Trizol試劑（美國Invitrogen公司），Anne-xin V-FITC/PI雙染試劑盒（美國BD公司），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（廣州玉博生物科技有限公司），Transwell小室（美國Costa公司），質粒抽提試劑盒（德國QIAGEN公司），質粒載體pMIRREPORTLuciferase（美國Ambion公司），蛋白抽提液、BCA蛋白定量試劑盒及5×蛋白上樣緩沖液（美國Pierce公司），LRH-1抗體（美國Abcam公司），反轉錄試劑盒（日本Takara公司）。設備：SpectraMax Plus384酶標儀（美國Molecular Devices公司），FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD Biosciences公司），MZFLⅢ熒光顯微鏡（德國徠卡儀器有限公司），Prism? 7300 PCR儀（美國應用生物系統公司），TD-20/20熒光素酶報告基因檢測儀（美國Sunnyvale公司），nano-drop 2000分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司），ImageJ 2.1軟件（美國National Institutes of Health），Target Scan 6.2軟件（美國麻省理工大學白頭翁研究所）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
AGS、SGC-7901、BGC-823、MKN-45和MKN28細胞均用含有10% FBS的RPMI 1640培養液培養，293T細胞則用含有10% FBS的高糖DMEM培養基培養，均在37 ℃、5% CO2條件下（后同）于培養箱內培養（各培養4～5 d），取對數生長期細胞進行實驗。AGC細胞具有典型的腫瘤細胞形態與超微結構惡性表型[17-18]。目前，AGS細胞已在許多體外胃癌相關研究中使用[19-21]。通過研究miR-31和RUN44（內參）的臨界循環數（Ct值）在各種細胞系中（包括AGS、SGC-7901、BGC-823、MKN45和MKN28細胞系）的比值變化，最終表明AGS細胞系中的miR-31表達量較低（miR-31表達水平均值：AGS細胞系為0.50，SGC-7901細胞系為0.80，BGC-823細胞系為0.77，MKN45細胞系為1.22，MKN28細胞系為1.08）。故選取AGS細胞進行本實驗研究，以觀察miR-31表達的變化對細胞增殖等指標的影響。
1.2.2 細胞分組及轉染
AGS細胞經過0.25%胰蛋白酶消化傳代后，取對數生長期的細胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板。實驗分為3組：miR-31轉染組（MT組，轉染miR-31）、陰性對照組（NC組，轉染miR-31陰性對照序列即空脂質體）和空白對照組（BC組，僅加入磷酸鹽緩沖溶液PBS）。分別用250 μL無血清的RPMI 1640培養液稀釋10 μL脂質體轉染試劑（LipofectamineTM2000）及15 μL的相應轉染物（MT組為miR-31，NC組為空脂質體，BC組為PBS溶液），室溫靜置5 min后，加入相應的復孔中；其余操作按轉染試劑盒說明書進行。最后在培養箱內培養，供后續實驗使用。
1.2.3 miR-31表達水平的檢測和細胞增殖能力測定
將總RNA進行miRNA逆轉錄和實時PCR檢測，具體步驟同文獻[22]。以RUN44為內參，計算各組miR-31的Ct值與內參RUN44的比值。細胞增殖能力測定步驟參照CCK-8試劑盒說明書進行，且吸光度值（A值）與細胞數目呈正比。將轉染24 h后的AGS細胞（包括MT組，BC組和NC組）按6×103個/孔的密度接種于96孔培養板（100 μL/孔）中3～4 h，待細胞貼壁后加入100 μL RPMI 1640完全培養液和10 μL CCK-8試劑，于培養箱內培養2 h。采用酶標儀測定各孔溶液的A450值，測定時點分別為轉染后0、1、2、3和4 d（各時間點均做3個復孔）。
另取未轉染的AGS對數生長期細胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板。其中3個復孔加10%FBS的RPMI 1640培養液2 mL作空白對照（BK組），另3個復孔加入含DLPC（50 nmol/L）的細胞培養液2 mL作為抑制劑組（DLPC組），各自培養24 h。24 h后更換新的培養基繼續培養4 d，期間正常更換培養基。2組均于處理后0、1、2、3和4 d測定細胞增殖能力（方法同上）。
1.2.4 細胞凋亡和周期檢測
將3組轉染后的AGS細胞在37 ℃培養箱內培養48 h后，4 ℃離心（1 000 r/min，r=3 cm，5 min）收集細胞。采用AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒于流式細胞儀進行細胞凋亡及細胞周期檢測，操作按試劑盒說明書進行。以Annexin-V-FITC（+）/PI（－）為G1及S期凋亡細胞，Annexin-V-FITC（+）/PI（+）為G2期和M期凋亡細胞，每組測量3次（求均值）。
1.2.5 細胞遷移能力測定
3組細胞經轉染處理24 h后，在Transwell小室的中下室內加入500 μL含10% FBS的RPMI 1640培養液，上室內加入以無血清RPMI 1640培養液稀釋的細胞懸液250 μL（細胞濃度為1×l05個/mL）；在培養箱內培養48 h后，用棉簽擦掉上室細胞，以4%多聚甲醛固定，以0.1%結晶紫染色并室溫孵育10 min。取出小室，用PBS溶液清洗后于顯微鏡下計數。3組均在低倍鏡（200倍）下隨機取5個視野計數（求和），并比較3組間穿過小室的細胞數的差異。3組均重復實驗3次。
1.2.6 Western blot法檢測LRH-1蛋白的表達
3組轉染細胞分別進行細胞總蛋白提取。用PBS溶液沖洗6孔板上的細胞3次（每次1 min）；將RIPA細胞裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑混合（100︰1），分別加入3組細胞的3個復孔中（50 μL/孔）；將培養板置于冰上裂解30 min后反復吹打。收集細胞裂解液于離心管中，于4 ℃下離心（12 000 r/min，r=2 cm，10 min）。吸取上清液，用BCA法檢測蛋白質含量，符合要求后用5×蛋白上樣緩沖液以4︰1的比例混合，98 ℃水浴5 min后置于冰上2 min。取30 μg總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。在20 V恒壓下半干轉膜1 h，以5%脫脂牛奶封閉液封閉。采用5 mL封閉液稀釋鼠抗人LRH-1抗體（一抗，1︰500），加入孵育盒中，4 ℃下搖床（振幅15 mm）過夜。棄去一抗，以磷酸鹽緩沖封閉液（TBST）洗3次（10 min/次），加入以TBST稀釋的HRP標記的羊抗鼠抗體（二抗，1︰500），室溫孵育1 h。再以TBST液漂洗3次（10 min/次）。加入超敏曝光液（ECL）曝光，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參照，用ImageJ 2.1軟件分析灰度值。以LRH-1蛋白和GAPDH灰度值的比值表示LRH-1蛋白的相對表達水平。
1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測
應用Target Scan軟件分析后得出，LRH-1基因為miR-31的靶基因，再通過雙熒光素酶報告基因進一步驗證。攜帶LRH-1基因的3′端非翻譯區（3′-UTR）野生型載體（pGL3-LRH-1-3’-UTR-WT）及突變型載體（pGL3-LRH-1-3′-UTR-MT）均由廣州銳博生物科技有限公司合成。將293T細胞接種于96孔板中，分別轉染miR-31-LRH-1野生型載體、miR-31-LRH-1突變型載體、空野生型載體及空突變型載體（各種載體均做3個復孔），操作按LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行。24 h后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測相對熒光素酶活性（即海腎熒光素與螢火蟲熒光素的比值）。
1.3 統計學方法
采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料的統計分析方法采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 轉染后miR-31的表達
通過PCR法檢測miR-31的表達，在以RUN44為內參的情況下，未轉染miR-31的NC組和BC組其表達水平的均值分別為0.50和0.49，而轉染miR-31的MT組為1.18，高于NC組和BC組（P<0.05），提示MT組細胞轉染成功。
2.2 miR-31和LRH-1基因對AGS胃癌細胞增殖的影響
除0 d外，MT組的A450均值均明顯低于NC組和BC組（P<0.01）。至4 d實驗結束時，MT組A450的均值為1.31，而BC和NC組均在2.0以上（表 1）。0～4 d內，NC組和BC組間A450值的差距均不大（P>0.05）。
表1
5組AGS細胞不同時間點的A450值（n=3，為表明LRH-1基因和AGS細胞的增殖具有密切關系，本實驗采用DLPC（LRH-1基因抑制劑）對LRH-1基因的作用進行抑制。通過4 d的增殖實驗，結果表明，各時點DLPC組A450的均值低于BK組（P<0.05），提示DLPC組AGS細胞的增殖速度低于BK組，表明LRH-1基因在AGS細胞的增殖過程中發揮著重要作用。
2.3 miR-31對AGS胃癌細胞凋亡的影響
通過流式細胞儀（圖 1）的計算可以得出，MT組細胞的平均細胞凋亡率為39.5%，NC組和BC組分別為9.3%和10.0%。MT組的AGS細胞調亡率明顯高于NC組和BC組（P<0.01），表明通過轉染miR-31后其表達的實現起到了促進AGS細胞凋亡的作用。
圖1
示NC組、BC組及MT組細胞的流式細胞圖。1A：NC組；1B：BC組；1C：MT組
Figure1.
The flow cytometry graphs of AGS cells in NC，BC，and MT groups. 1A：NC groups；1B：BC group；1C：MT group
2.4 miR-31對AGS胃癌細胞周期的影響
AGS細胞經miR-31轉染后，其細胞周期受到影響。在轉染48 h后，MT組的G1+S期、單獨G1期及S期的細胞比例均高于BC組和NC組（P<0.05），而BC組和NC組間各細胞周期比例的差異不大（P>0.05），見表 2。
表2
NC組、BC組及MT組細胞的細胞周期構成（%，n=3，2.5 miR-31對AGS胃癌細胞遷移的影響
MT組Transwell小室中的遷移細胞數明顯較NC組和BC組少（圖 2），表明MT組的細胞遷移能力較低。比較穿過小室的平均細胞數發現（圖 3），MT組的細胞遷移數目約為BC組和NC組的1/3（P<0.05），而NC組和BC組之間的差距并不大，差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
示NC組、BC組及MT組細胞的Transwell小室觀察結果（結晶紫染色 ×200）。2A：NC組；2B：BC組；2C：MT組 ? ?圖 3 示NC組、BC組及MT組的遷移細胞數量。與MT組比較，* P<0.05 ? ?圖 4 示NC組、BC組及MT組LRH-1蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。1：NC組；2：BC組；3：MT組 ? ?圖 5 示NC組、BC組及MT組細胞LRH-1蛋白的表達結果。與MT組比較，* P<0.05
Figure2.
The observed results of Transwell in NC，BC，and MT group （crystal violet staining ×200）. 2A：NC group；2B：BC group；2C：MT group ? ?Figure 3 The number of migrated cells in NC，BC，and MT group. Compared with MT group，* P<0.05 ? ?Figure 4 The polyacry-
2.6 miR-31對LRH-1蛋白表達的影響
Western blot法的檢測結果表明，MT組細胞中LRH-1蛋白的平均表達水平下降（圖 4和圖 5），較NC組和BC組均低（P<0.01），而NC組和BC組間的差距不大（P>0.05）。
2.7 miR-31靶點驗證結果
雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，miR-31-LRH-1野生型載體組、miR-31-LRH-1突變型載體組、空野生型載體組及空突變型載體組細胞的熒光素酶活性的均值分別為0.40、0.81、0.76及0.81。miR-31-野生型載體組的熒光素酶活性較低（P<0.01），表明miR-31的確能有效結合LRH-1基因的3′-UTR端，LRH-1基因是miR-31的靶點。
3 討論
miR-31是在胃癌組織中特異性低表達的小RNA，其被認為是可以用于胃癌臨床診斷的標志物[7]。有研究[10]表明，miR-31的低表達和p53通路的干擾有關。若癌癥患者的p53信號通路受到嚴重干擾，或許miR-31將是有效的治療藥物。但是miR-31的作用特點、作用機理及其作用靶基因還在探索研究之中。
LRH-1基因不僅在膽固醇和膽酸的代謝平衡中起重要作用，而且可促進癌細胞的增殖和細胞周期。LRH-1基因和胰腺癌、胃癌和乳腺癌間均具有相關性，在這些癌癥中LRH-1基因的表達水平都異常升高[12-13, 23]。其可以通過調控細胞周期刺激小鼠胰腺癌細胞（LTPA）和小鼠肝細胞（FL83B）的增殖[24]。在氧化偶氮甲烷誘導的胰腺腫瘤小鼠的實驗[25]中，LRH-1基因表達的下調可降低癌癥的發生率和提高存活率。LRH-1基因也被認為是雌激素的靶基因，表現為雌激素誘導下可促進細胞增殖[26]。
在本實驗中，筆者首先探索了原本低表達miR-31的AGS細胞高表達miR-31后其增殖的變化，結果表明，高表達miR-31可顯著抑制AGS細胞的增殖。AGS細胞凋亡率檢測結果表明，高表達miR-31可顯著增加AGS細胞的凋亡。癌細胞的遷移是癌癥難以治愈的重要原因之一。為考察高表達miR-31對AGS細胞遷移的影響，本研究進行了Transwell小室實驗，結果表明，miR-31對AGS細胞的遷移具有明顯的抑制作用，進一步說明了miR-31可抑制AGS細胞在胃癌疾病進展中的轉移。
此外，為考察miR-31的作用機理，經過計算機模擬，本研究將miR-31的靶點鎖定在LRH-1基因上。通過Western blot方法和雙熒光素酶報告基因檢測，最終發現了miR-31可能通過抑制LRH-1蛋白的表達來發揮其對AGS細胞的作用。為證實miR-31是通過LRH-1基因來抑制AGS細胞增殖的，本研究又采用DLPC抑制劑對LRH-1基因進行特異性拮抗。實驗結果表明，LRH-1基因拮抗后AGS細胞的增殖受到很大影響，其增殖水平低于BK組。因此本實驗結果提示，高表達的miR-31可以通過抑制AGS細胞中LRH-1基因的表達，從而達到其抑制AGS細胞增殖的作用。
本實驗以人胃癌細胞AGS細胞系為研究對象，探討了轉染miR-31后AGS細胞的增殖、凋亡、遷移和對LRH-1基因表達的影響。結果表明，miR-31在人胃癌細胞中具有較強的抑制細胞增殖的作用，可明顯降低癌細胞的存活率，使G1+S期細胞所占的比例增加，并對細胞的遷移具有顯著的抑制作用，提示miR-31對胃癌細胞具有較強的殺傷力，可作為胃癌治療的潛在藥物。
