引用本文： 韓建平, 陳鐘. 骨髓間充質干細胞經脾移植治療大鼠急性肝功能衰竭的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(6): 669-674. doi: 10.7507/1007-9424.20140162 復制
我國是肝病大國，肝功能衰竭是各種肝病患者的死亡原因之一。肝細胞移植（HTx）是治療暴發性肝功能衰竭（FHF）的一種有效的方法。肝移植動物模型及臨床應用均取得了一定的效果[1]，但其存在供體短缺、移植肝細胞增殖困難等問題。骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）強大的增殖能力及分化潛能為解決上述難題開辟了新的途徑，具有簡便易行、對受體影響小、應用靈活、價格相對低廉等優點。有關骨髓干細胞移植治療肝功能衰竭的研究[2]已取得了可喜的成果，但骨髓MSCs的移植部位、移植后是否進入肝實質、是否可分化為肝細胞、移植后受體肝功能的恢復等問題目前仍有爭議。本實驗通過成功分離、鑒定大鼠骨髓MSCs后，進行急性肝功能衰竭（ALF）大鼠模型的脾內移植，于移植后檢測肝功能指標以研究移植細胞是否發揮肝細胞功能，并取受體大鼠肝臟檢測是否有移植細胞遷移，以為更好地利用骨髓MSCs治療肝功能衰竭奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和設備
選用6周齡健康雄性清潔級SD大鼠1只（體質量150 g）用于獲取骨髓MSCs；另選用8周齡健康雌性清潔級SD大鼠24只，體質量150～200 g，用于制備ALF模型。實驗動物均由南通大學實驗動物中心提供。主要試劑：胎牛血清購自杭州四季青公司，CD44、CD29及CD34兔抗大鼠購自武漢博士德公司，DMEM培養液為美國GIBCO公司產品，實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司，PV-9000即用型二步法（非生物素）檢測試劑盒購自北京海誠遠宏科技有限公司，丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測定試劑盒（速率法）、白蛋白（ALB）測定試劑盒（溴甲酚綠法）及總膽紅素（TBIL）測定試劑盒（鋇酸鹽法）均購自中生北控生物科技股份有限公司。主要實驗儀器：2323-2 CO2培養箱（美國Shel Lab公司），ckx41倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司），7500fast型qPCR儀（美國Applied biosystems公司），日立7180型全自動生化分析儀（美國應用生物系統中國公司）。
1.2 方法
1.2.1 大鼠骨髓MSCs的獲取、培養和傳代
采用頸椎脫臼法處死1只雄性大鼠，在無菌條件下剝離出脛骨及股骨，剪去兩端，以DMEM基礎培養液沖出骨髓，以5.0 mL注射器反復抽吸獲得的骨髓，經200目篩網過濾制成單細胞懸液（此處密度可大可小，懸起細胞即可）。將單細胞懸液置水平離心機中離心（1 000 r/min，r=10.7 cm，5 min），棄上清液。MSCs的培養方法參照趙瑛[3]的方法并適當改進。將細胞懸液以4×105個/cm2的密度接種于DMEM完全培養液中（含有青霉素0.1 U/L，鏈霉素0.1 μg/L，10%胎牛血清），置于5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養箱中培養。3 d后全量換液，以后每2天或3天全量換液1次。換液前后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態及生長情況。當細胞鋪滿細胞培養瓶底、達80%～90%融合時，傾棄舊培養液，以DMEM基礎培養液或PBS液洗滌2次，每次30 s。加入0.25%胰蛋白酶+0.02%二乙胺四乙酸（EDTA）混合液1.0 mL （體積比為1︰1），于37 ℃條件下孵育2～3 min，待細胞收縮變圓、部分開始懸浮時，以10%胎牛血清終止胰蛋白酶的作用。用吸管反復吹打后收集細胞懸液并離心（1 000 r/min，r=10.7 cm，5 min），棄去上清液。用含10%胎牛血清的完全培養液重懸，調整細胞密度至1×106個/mL，接種于培養瓶中，進行傳代培養，以用于細胞移植。
1.2.2 大鼠骨髓MSCs的表面抗原鑒定
取第4代MSCs制成單細胞懸液（密度為1×106個/mL），接種到鋪有纖維連接蛋白包被的蓋玻片的6孔板中，隔日換液1次。至第5天時取出蓋玻片，將細胞爬片沖洗干凈后，室溫下用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS液沖洗3次，每次2 min；加入0.3%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100），室溫下靜置10 min，再用PBS液沖洗3次，每次2 min；滴加10%封閉羊血清（液體覆蓋蓋玻片即可），37 ℃下孵育30 min；分別滴加CD44、CD29及CD34抗體（稀釋濃度均為1︰100），同時用PBS液作為一抗設置陰性對照（未設陽性對照），37 ℃條件下孵育1 h；加非生物素二抗，37 ℃孵育60 min；以PBS溶液沖洗3次，每次2 min。最后行DAB顯色、沖洗及封片后鏡檢。
1.2.3 ALF模型的建立及骨髓MSCs移植
取24只健康的8周齡雌性SD大鼠，按900 mg/kg D-氨基半乳糖行腹腔注射，同時按10 μg/kg于尾靜脈注入腫瘤壞死因子-α （TNF-α），再隨機（抽簽法）分成2組，即實驗組及空白對照組，每組12只。實驗組大鼠于建模24 h后在無菌條件下開腹，于脾臟實質植入0.5 mL （2×107個/mL）雄性MSCs懸液。空白對照組大鼠于脾內注射0.5 mL生理鹽水，其余操作同實驗組。于移植前后觀察大鼠的一般情況，至處死大鼠時結束觀察。
1.2.4 實時定量PCR法檢測肝臟Y性別決定區基因（SRY基因）的表達
移植后4周處死2組存活大鼠，采用實時定量PCR法檢測大鼠肝臟中SRY基因的表達。RNA抽提采用Trizol法提取，操作按Trizol試劑說明書進行。測定RNA的濃度和純度，要求吸光度（A）值達到A260/A280≥1.80。將RNA逆轉錄為cDNA，步驟按逆轉錄試劑盒說明書進行。以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR引物見表 1。PCR擴增采用20.0 μL體系：超純水13.0 μL、10×pcr buffer 2.0 μL，Mg2+ 2.0 μL （25 mmol/L），脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）0.5 μL （25 mmol/L），上下游引物各0.5 μL （10 μmol/L），Taqman探針0.3 μL（20 μmol/L），Taq酶0.2 μL （5 U/mL），cDNA模板1.0 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環后終止反應。SRY基因的表達水平采用2-△△Ct法計算，其中Ct為循環閾值。本實驗重復測量了3次。
表1
PCR過程中所使用的引物
Table1.
PCR primers which were used in the process
1.2.5 肝臟組織病理學檢查
將造模48 h后剛死亡的大鼠及移植后4周存活大鼠的肝臟取下，均于肝最大右葉相同部位取一小塊肝組織，約1.5 cm×1.5 cm×0.4 cm大，以10%中性緩沖甲醛液固定7～48 h，石蠟包埋，4 μm厚切片，行HE染色。
1.2.6 移植前后檢測肝功能
2組大鼠均于移植前，移植后72 h、1周及2周用毛細管沿眼底靜脈叢采血約2.0 mL，離心（3 500 r/min，r=19.0 cm，10 min），取血清0.1 mL。在全自動生化分析檢測儀上檢測ALT、TBIL及ALB水平。
1.3 統計學方法
計量數據采用均數±標準差（
2 結果
2.1 骨髓MSCs的培養情況
骨髓單個核細胞接種于培養瓶后，鏡下可見細胞呈圓形，大小不一，懸浮于培養液中。24 h后部分細胞開始貼壁，呈圓形，少部分伸出偽足而呈多角形。72 h換液后，可見少量梭形、星形及多角形細胞分散貼壁生長，呈逗號狀或短棒狀（圖 1A）；6～7 d左右可見放射狀排列的細胞集落，集落大小不一，細胞核較大、核仁清晰可見。12～14 d時細胞呈80%～90%融合，細胞的突起變長，排列呈漩渦狀。傳代細胞比原代細胞貼壁快，24 h內已全部貼壁，逐步伸展為三角形及多角形，其增殖迅速，呈均勻分布生長，6～7 d時可鋪滿培養皿形成單層（圖 1B）。
圖1
示骨髓MSCs的培養結果（倒置相差顯微鏡 ×100）。1A：原代培養3 d；2：第1代培養1 d ? ?圖 2 示第4代骨髓MSCs表面抗原的免疫組化染色鑒定結果（SP ×100）。2A：CD29呈陽性表達；2B：CD44呈陽性表達；2C：CD34呈陰性表達；2D：陰性對照組未見著色 ? ?圖 3 示大鼠肝臟的病理學觀察結果（HE ×100）。3A：空白對照組移植后48 h；3B：實驗組移植后4周；3C和3D：空白對照組移植后4周
Figure1.
Culture results of MSCs （Inverted phase contrast microscope ×100）. 1A：The third day during primary culture；1B：The first day during the first generation ? ?Figure 2 The identification of surface antigen of MSCs in the fourth generation by immumohistochemical staining （SP ×100）.2A：Positive expression of CD29 was observed in MSCs of rat；2B：Positive expression of CD44 was observed in MSCs of rat；2C：Negative expression of CD34 was observed in MSCs of rat；2D：No positive expression was found in negative control group ? ?Figure 3 HE staining results of liver tissues of rats （HE ×100）. 3A：48 hours after model establishment of blank control group；3B：4 weeks after transplantation in experimental group；3C and 3D：4 weeks after transplantation in blank control group
2.2 骨髓MSCs表面抗原的鑒定
免疫組化染色結果顯示，第4代骨髓MSCs中CD29和CD44呈陽性表達，陽性細胞表現為胞漿呈棕色至棕褐色，在細胞核周圍最明顯；而CD34未見陽性表達。陰性對照均未見著色（圖 2）。
2.3 骨髓MSCs移植前后大鼠的一般情況觀察
2組大鼠在注射藥物后均出現中毒性肝損害，于注射藥物24 h開始表現為精神萎靡、食欲減退及尿色變黃。注射藥物后48 h出現活動減少、嗜睡、少飲少食及尿色深黃。移植前2組大鼠均未出現死亡，移植后72 h內2組均出現死亡，其中實驗組死亡7只，空白對照組死亡9只。ALF大鼠在注射藥物后若能夠存活過3 d，一般不會再發生死亡。3 d后2組大鼠的活動逐漸增加，進食量增多，小便顏色變淡。實驗組和空白對照組在移植72 h及以后分別存活5只和3只大鼠，存活率分別為41.7%和25.0%，2組比較差異有統計學意義（χ2=48.00，P<0.05），實驗組較高。
2.4 2組大鼠肝臟SRY基因的表達結果
移植4周后，實驗組大鼠肝臟中能夠檢測到SRY雄性基因的表達 〔（3.36±1.16）×10-6〕；而在空白對照組大鼠肝臟中未能夠檢測到SRY雄性基因的表達。
2.5 肝臟組織學病理HE染色
空白對照組造模48 h時，大部分肝小葉結構消失，肝組織呈大片狀壞死伴出血，網狀支架塌陷，大量的中性粒細胞浸潤（圖 3A）。移植后4周，實驗組的肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝竇結構較規整，肝細胞核呈圓形（圖 3B）；空白對照組的肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列不明顯，肝細胞體積增大，肝竇結構不規整，肝組織結構紊亂，纖維化組織明顯，呈假小葉形成傾向（圖 3C和圖 3D）。
2.6 骨髓MSCs移植前后大鼠肝功能的變化
2組大鼠骨髓MSCs移植前后的ALT、TBIL及ALB水平檢測結果見表 2。由表 2可見，2組大鼠移植前的ALT、TBIL及ALB水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。移植后與空白對照組比較，實驗組各時點的ALT和TBIL水平均較低（P<0.05）；移植后1周和2周，實驗組的ALB水平均高于空白對照組（P<0.05），而移植后72 h的差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
2組大鼠骨髓MSCs移植前后ALT、TBIL及ALB水平檢測結果（3 討論
在細胞移植治療ALF中，MSCs已顯示出強大的優勢，主要表現在以下4個方面：①MSCs具備增殖和分化的潛能，能夠分化為肝樣細胞[4-8]；②一般成年個體均具備MSCs的利用條件；③MSCs的免疫原性較弱；④MSCs來源廣泛，收集容易，體外可大量增殖，在臨床上具有巨大的應用潛能[9-10]。MSCs的移植部位選擇爭議較大，主要有肝實質、脾實質、門靜脈、周圍靜脈等。肝臟是較理想的移植部位，但會加重肝臟的繼發性損傷。脾臟屬于門靜脈系統，選擇脾實質進行移植，既可避免經門靜脈注射可能造成的血管栓塞，又可避免經外周靜脈注射發生向肝臟定植率不高的狀況。在本實驗中，筆者的親身體會是脾臟組織的韌性適宜，移植部位不會發生出血，也不會發生移植液溢出，是較合適的移植場所。
有效的標記細胞是進一步研究骨髓MSCs治療效果和探討其治療機理的基礎所在。目前常用的標記方法主要有4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）標記法、BrdU標記法、染色體標記法、特定基因標記法等[10-18]。本實驗將雄性大鼠的骨髓MSCs移植到雌性大鼠模型體內，采用實時定量PCR法檢測雌性大鼠肝臟內SRY基因的表達。此方法使骨髓MSCs在移植前無需體外特殊標記，細胞活力未受影響。本實驗從雌性大鼠肝臟中檢測到了SRY基因的表達，表明采用SRY基因作為示蹤是可行的，且是安全有效的。本實驗結果表明，MSCs在脾內移植后，受體肝臟內檢測到了SRY基因的表達，表明骨髓MSCs經脾移植后，能夠遷徙并定居于受損的肝臟內，從而可能進一步參與受損肝臟功能的修復。骨髓MSCs這一遷徙和附著的機理是什么呢?目前這一系列過程鮮為人知，可能是因為損傷的肝臟分泌某種細胞因子或通過其他機理促使骨髓MSCs向肝臟遷徙并定居，進而可能在ALF大鼠肝臟中轉化為有功能的肝細胞，促進了肝功能的恢復。Hatch等[19]研究循環骨髓細胞肝臟種植的機理時發現，當肝臟嚴重受損時，存活的肝細胞分泌間質衍生因子1 （SDF1），而進入肝臟的骨髓細胞表達此因子的受體即趨化因子受體4 （CXCR4），推測此因子在骨髓細胞遷徙并定居于肝臟的過程中起重要作用。研究[20-21]表明，受損的肝臟能釋放一些化學物質來招募骨髓MSCs向肝臟遷徙并定居。眾所周知，肝功能衰竭發生時，體內的免疫環境也發生了變化。洪冬玲等[22]在研究異體MSCs在小鼠體內的蹤跡時發現，肝臟等免疫器官在受到致敏影響時，其對遷徙的骨髓MSCs具有一定的吸附作用，從而阻止了正常狀態下MSCs向骨髓的歸巢。
本實驗結果顯示，在肝功能衰竭的情況下，將骨髓MSCs移植于脾內，實驗組的病理學改變輕于空白對照組，而且該組血清生化指標較空白對照組有明顯改善，ALB水平在移植后1周明顯增加，表明骨髓MSCs移植對ALF有明顯的治療作用。其可能的機理是：①移植的的骨髓MSCs在ALF內環境作用下，逐漸向肝樣細胞分化，發揮了部分肝細胞的功能。②骨髓MSCs可能分泌某些細胞因子參與受損肝臟內環境的調節，刺激肝細胞再生[23-24]。研究[25-27]發現，肝臟功能在受到損害時能夠使骨髓MSCs產生多種細胞因子，如血管內皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子（HGF）等，促使血管再生及肝功能損傷的修復。其中HGF是生物活性最廣泛的生長因子之一[28-29]。它最早是于1984年由日本的中村敏一教授從大鼠血漿中分離得到的，其結構實質是含728個氨基酸的肝素結合糖蛋白[30]。它能夠啟動肝再生，刺激肝細胞進行有絲分裂，在肝組織損傷修復中發揮著重要作用[31]。
綜上所述，骨髓MSCs移植治療ALF是一個非常復雜而有序的過程，對其在臨床應用方面的研究也僅處于起步階段。隨著人們對骨髓MSCs的不斷認識，以及對肝再生機理的進一步深入研究，骨髓MSCs治療ALF有望取得突破性的進展。
我國是肝病大國，肝功能衰竭是各種肝病患者的死亡原因之一。肝細胞移植（HTx）是治療暴發性肝功能衰竭（FHF）的一種有效的方法。肝移植動物模型及臨床應用均取得了一定的效果[1]，但其存在供體短缺、移植肝細胞增殖困難等問題。骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）強大的增殖能力及分化潛能為解決上述難題開辟了新的途徑，具有簡便易行、對受體影響小、應用靈活、價格相對低廉等優點。有關骨髓干細胞移植治療肝功能衰竭的研究[2]已取得了可喜的成果，但骨髓MSCs的移植部位、移植后是否進入肝實質、是否可分化為肝細胞、移植后受體肝功能的恢復等問題目前仍有爭議。本實驗通過成功分離、鑒定大鼠骨髓MSCs后，進行急性肝功能衰竭（ALF）大鼠模型的脾內移植，于移植后檢測肝功能指標以研究移植細胞是否發揮肝細胞功能，并取受體大鼠肝臟檢測是否有移植細胞遷移，以為更好地利用骨髓MSCs治療肝功能衰竭奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和設備
選用6周齡健康雄性清潔級SD大鼠1只（體質量150 g）用于獲取骨髓MSCs；另選用8周齡健康雌性清潔級SD大鼠24只，體質量150～200 g，用于制備ALF模型。實驗動物均由南通大學實驗動物中心提供。主要試劑：胎牛血清購自杭州四季青公司，CD44、CD29及CD34兔抗大鼠購自武漢博士德公司，DMEM培養液為美國GIBCO公司產品，實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司，PV-9000即用型二步法（非生物素）檢測試劑盒購自北京海誠遠宏科技有限公司，丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測定試劑盒（速率法）、白蛋白（ALB）測定試劑盒（溴甲酚綠法）及總膽紅素（TBIL）測定試劑盒（鋇酸鹽法）均購自中生北控生物科技股份有限公司。主要實驗儀器：2323-2 CO2培養箱（美國Shel Lab公司），ckx41倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司），7500fast型qPCR儀（美國Applied biosystems公司），日立7180型全自動生化分析儀（美國應用生物系統中國公司）。
1.2 方法
1.2.1 大鼠骨髓MSCs的獲取、培養和傳代
采用頸椎脫臼法處死1只雄性大鼠，在無菌條件下剝離出脛骨及股骨，剪去兩端，以DMEM基礎培養液沖出骨髓，以5.0 mL注射器反復抽吸獲得的骨髓，經200目篩網過濾制成單細胞懸液（此處密度可大可小，懸起細胞即可）。將單細胞懸液置水平離心機中離心（1 000 r/min，r=10.7 cm，5 min），棄上清液。MSCs的培養方法參照趙瑛[3]的方法并適當改進。將細胞懸液以4×105個/cm2的密度接種于DMEM完全培養液中（含有青霉素0.1 U/L，鏈霉素0.1 μg/L，10%胎牛血清），置于5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養箱中培養。3 d后全量換液，以后每2天或3天全量換液1次。換液前后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態及生長情況。當細胞鋪滿細胞培養瓶底、達80%～90%融合時，傾棄舊培養液，以DMEM基礎培養液或PBS液洗滌2次，每次30 s。加入0.25%胰蛋白酶+0.02%二乙胺四乙酸（EDTA）混合液1.0 mL （體積比為1︰1），于37 ℃條件下孵育2～3 min，待細胞收縮變圓、部分開始懸浮時，以10%胎牛血清終止胰蛋白酶的作用。用吸管反復吹打后收集細胞懸液并離心（1 000 r/min，r=10.7 cm，5 min），棄去上清液。用含10%胎牛血清的完全培養液重懸，調整細胞密度至1×106個/mL，接種于培養瓶中，進行傳代培養，以用于細胞移植。
1.2.2 大鼠骨髓MSCs的表面抗原鑒定
取第4代MSCs制成單細胞懸液（密度為1×106個/mL），接種到鋪有纖維連接蛋白包被的蓋玻片的6孔板中，隔日換液1次。至第5天時取出蓋玻片，將細胞爬片沖洗干凈后，室溫下用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS液沖洗3次，每次2 min；加入0.3%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100），室溫下靜置10 min，再用PBS液沖洗3次，每次2 min；滴加10%封閉羊血清（液體覆蓋蓋玻片即可），37 ℃下孵育30 min；分別滴加CD44、CD29及CD34抗體（稀釋濃度均為1︰100），同時用PBS液作為一抗設置陰性對照（未設陽性對照），37 ℃條件下孵育1 h；加非生物素二抗，37 ℃孵育60 min；以PBS溶液沖洗3次，每次2 min。最后行DAB顯色、沖洗及封片后鏡檢。
1.2.3 ALF模型的建立及骨髓MSCs移植
取24只健康的8周齡雌性SD大鼠，按900 mg/kg D-氨基半乳糖行腹腔注射，同時按10 μg/kg于尾靜脈注入腫瘤壞死因子-α （TNF-α），再隨機（抽簽法）分成2組，即實驗組及空白對照組，每組12只。實驗組大鼠于建模24 h后在無菌條件下開腹，于脾臟實質植入0.5 mL （2×107個/mL）雄性MSCs懸液。空白對照組大鼠于脾內注射0.5 mL生理鹽水，其余操作同實驗組。于移植前后觀察大鼠的一般情況，至處死大鼠時結束觀察。
1.2.4 實時定量PCR法檢測肝臟Y性別決定區基因（SRY基因）的表達
移植后4周處死2組存活大鼠，采用實時定量PCR法檢測大鼠肝臟中SRY基因的表達。RNA抽提采用Trizol法提取，操作按Trizol試劑說明書進行。測定RNA的濃度和純度，要求吸光度（A）值達到A260/A280≥1.80。將RNA逆轉錄為cDNA，步驟按逆轉錄試劑盒說明書進行。以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR引物見表 1。PCR擴增采用20.0 μL體系：超純水13.0 μL、10×pcr buffer 2.0 μL，Mg2+ 2.0 μL （25 mmol/L），脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）0.5 μL （25 mmol/L），上下游引物各0.5 μL （10 μmol/L），Taqman探針0.3 μL（20 μmol/L），Taq酶0.2 μL （5 U/mL），cDNA模板1.0 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環后終止反應。SRY基因的表達水平采用2-△△Ct法計算，其中Ct為循環閾值。本實驗重復測量了3次。
表1
PCR過程中所使用的引物
Table1.
PCR primers which were used in the process
1.2.5 肝臟組織病理學檢查
將造模48 h后剛死亡的大鼠及移植后4周存活大鼠的肝臟取下，均于肝最大右葉相同部位取一小塊肝組織，約1.5 cm×1.5 cm×0.4 cm大，以10%中性緩沖甲醛液固定7～48 h，石蠟包埋，4 μm厚切片，行HE染色。
1.2.6 移植前后檢測肝功能
2組大鼠均于移植前，移植后72 h、1周及2周用毛細管沿眼底靜脈叢采血約2.0 mL，離心（3 500 r/min，r=19.0 cm，10 min），取血清0.1 mL。在全自動生化分析檢測儀上檢測ALT、TBIL及ALB水平。
1.3 統計學方法
計量數據采用均數±標準差（
2 結果
2.1 骨髓MSCs的培養情況
骨髓單個核細胞接種于培養瓶后，鏡下可見細胞呈圓形，大小不一，懸浮于培養液中。24 h后部分細胞開始貼壁，呈圓形，少部分伸出偽足而呈多角形。72 h換液后，可見少量梭形、星形及多角形細胞分散貼壁生長，呈逗號狀或短棒狀（圖 1A）；6～7 d左右可見放射狀排列的細胞集落，集落大小不一，細胞核較大、核仁清晰可見。12～14 d時細胞呈80%～90%融合，細胞的突起變長，排列呈漩渦狀。傳代細胞比原代細胞貼壁快，24 h內已全部貼壁，逐步伸展為三角形及多角形，其增殖迅速，呈均勻分布生長，6～7 d時可鋪滿培養皿形成單層（圖 1B）。
圖1
示骨髓MSCs的培養結果（倒置相差顯微鏡 ×100）。1A：原代培養3 d；2：第1代培養1 d ? ?圖 2 示第4代骨髓MSCs表面抗原的免疫組化染色鑒定結果（SP ×100）。2A：CD29呈陽性表達；2B：CD44呈陽性表達；2C：CD34呈陰性表達；2D：陰性對照組未見著色 ? ?圖 3 示大鼠肝臟的病理學觀察結果（HE ×100）。3A：空白對照組移植后48 h；3B：實驗組移植后4周；3C和3D：空白對照組移植后4周
Figure1.
Culture results of MSCs （Inverted phase contrast microscope ×100）. 1A：The third day during primary culture；1B：The first day during the first generation ? ?Figure 2 The identification of surface antigen of MSCs in the fourth generation by immumohistochemical staining （SP ×100）.2A：Positive expression of CD29 was observed in MSCs of rat；2B：Positive expression of CD44 was observed in MSCs of rat；2C：Negative expression of CD34 was observed in MSCs of rat；2D：No positive expression was found in negative control group ? ?Figure 3 HE staining results of liver tissues of rats （HE ×100）. 3A：48 hours after model establishment of blank control group；3B：4 weeks after transplantation in experimental group；3C and 3D：4 weeks after transplantation in blank control group
2.2 骨髓MSCs表面抗原的鑒定
免疫組化染色結果顯示，第4代骨髓MSCs中CD29和CD44呈陽性表達，陽性細胞表現為胞漿呈棕色至棕褐色，在細胞核周圍最明顯；而CD34未見陽性表達。陰性對照均未見著色（圖 2）。
2.3 骨髓MSCs移植前后大鼠的一般情況觀察
2組大鼠在注射藥物后均出現中毒性肝損害，于注射藥物24 h開始表現為精神萎靡、食欲減退及尿色變黃。注射藥物后48 h出現活動減少、嗜睡、少飲少食及尿色深黃。移植前2組大鼠均未出現死亡，移植后72 h內2組均出現死亡，其中實驗組死亡7只，空白對照組死亡9只。ALF大鼠在注射藥物后若能夠存活過3 d，一般不會再發生死亡。3 d后2組大鼠的活動逐漸增加，進食量增多，小便顏色變淡。實驗組和空白對照組在移植72 h及以后分別存活5只和3只大鼠，存活率分別為41.7%和25.0%，2組比較差異有統計學意義（χ2=48.00，P<0.05），實驗組較高。
2.4 2組大鼠肝臟SRY基因的表達結果
移植4周后，實驗組大鼠肝臟中能夠檢測到SRY雄性基因的表達 〔（3.36±1.16）×10-6〕；而在空白對照組大鼠肝臟中未能夠檢測到SRY雄性基因的表達。
2.5 肝臟組織學病理HE染色
空白對照組造模48 h時，大部分肝小葉結構消失，肝組織呈大片狀壞死伴出血，網狀支架塌陷，大量的中性粒細胞浸潤（圖 3A）。移植后4周，實驗組的肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝竇結構較規整，肝細胞核呈圓形（圖 3B）；空白對照組的肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列不明顯，肝細胞體積增大，肝竇結構不規整，肝組織結構紊亂，纖維化組織明顯，呈假小葉形成傾向（圖 3C和圖 3D）。
2.6 骨髓MSCs移植前后大鼠肝功能的變化
2組大鼠骨髓MSCs移植前后的ALT、TBIL及ALB水平檢測結果見表 2。由表 2可見，2組大鼠移植前的ALT、TBIL及ALB水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。移植后與空白對照組比較，實驗組各時點的ALT和TBIL水平均較低（P<0.05）；移植后1周和2周，實驗組的ALB水平均高于空白對照組（P<0.05），而移植后72 h的差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
2組大鼠骨髓MSCs移植前后ALT、TBIL及ALB水平檢測結果（3 討論
在細胞移植治療ALF中，MSCs已顯示出強大的優勢，主要表現在以下4個方面：①MSCs具備增殖和分化的潛能，能夠分化為肝樣細胞[4-8]；②一般成年個體均具備MSCs的利用條件；③MSCs的免疫原性較弱；④MSCs來源廣泛，收集容易，體外可大量增殖，在臨床上具有巨大的應用潛能[9-10]。MSCs的移植部位選擇爭議較大，主要有肝實質、脾實質、門靜脈、周圍靜脈等。肝臟是較理想的移植部位，但會加重肝臟的繼發性損傷。脾臟屬于門靜脈系統，選擇脾實質進行移植，既可避免經門靜脈注射可能造成的血管栓塞，又可避免經外周靜脈注射發生向肝臟定植率不高的狀況。在本實驗中，筆者的親身體會是脾臟組織的韌性適宜，移植部位不會發生出血，也不會發生移植液溢出，是較合適的移植場所。
有效的標記細胞是進一步研究骨髓MSCs治療效果和探討其治療機理的基礎所在。目前常用的標記方法主要有4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）標記法、BrdU標記法、染色體標記法、特定基因標記法等[10-18]。本實驗將雄性大鼠的骨髓MSCs移植到雌性大鼠模型體內，采用實時定量PCR法檢測雌性大鼠肝臟內SRY基因的表達。此方法使骨髓MSCs在移植前無需體外特殊標記，細胞活力未受影響。本實驗從雌性大鼠肝臟中檢測到了SRY基因的表達，表明采用SRY基因作為示蹤是可行的，且是安全有效的。本實驗結果表明，MSCs在脾內移植后，受體肝臟內檢測到了SRY基因的表達，表明骨髓MSCs經脾移植后，能夠遷徙并定居于受損的肝臟內，從而可能進一步參與受損肝臟功能的修復。骨髓MSCs這一遷徙和附著的機理是什么呢?目前這一系列過程鮮為人知，可能是因為損傷的肝臟分泌某種細胞因子或通過其他機理促使骨髓MSCs向肝臟遷徙并定居，進而可能在ALF大鼠肝臟中轉化為有功能的肝細胞，促進了肝功能的恢復。Hatch等[19]研究循環骨髓細胞肝臟種植的機理時發現，當肝臟嚴重受損時，存活的肝細胞分泌間質衍生因子1 （SDF1），而進入肝臟的骨髓細胞表達此因子的受體即趨化因子受體4 （CXCR4），推測此因子在骨髓細胞遷徙并定居于肝臟的過程中起重要作用。研究[20-21]表明，受損的肝臟能釋放一些化學物質來招募骨髓MSCs向肝臟遷徙并定居。眾所周知，肝功能衰竭發生時，體內的免疫環境也發生了變化。洪冬玲等[22]在研究異體MSCs在小鼠體內的蹤跡時發現，肝臟等免疫器官在受到致敏影響時，其對遷徙的骨髓MSCs具有一定的吸附作用，從而阻止了正常狀態下MSCs向骨髓的歸巢。
本實驗結果顯示，在肝功能衰竭的情況下，將骨髓MSCs移植于脾內，實驗組的病理學改變輕于空白對照組，而且該組血清生化指標較空白對照組有明顯改善，ALB水平在移植后1周明顯增加，表明骨髓MSCs移植對ALF有明顯的治療作用。其可能的機理是：①移植的的骨髓MSCs在ALF內環境作用下，逐漸向肝樣細胞分化，發揮了部分肝細胞的功能。②骨髓MSCs可能分泌某些細胞因子參與受損肝臟內環境的調節，刺激肝細胞再生[23-24]。研究[25-27]發現，肝臟功能在受到損害時能夠使骨髓MSCs產生多種細胞因子，如血管內皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子（HGF）等，促使血管再生及肝功能損傷的修復。其中HGF是生物活性最廣泛的生長因子之一[28-29]。它最早是于1984年由日本的中村敏一教授從大鼠血漿中分離得到的，其結構實質是含728個氨基酸的肝素結合糖蛋白[30]。它能夠啟動肝再生，刺激肝細胞進行有絲分裂，在肝組織損傷修復中發揮著重要作用[31]。
綜上所述，骨髓MSCs移植治療ALF是一個非常復雜而有序的過程，對其在臨床應用方面的研究也僅處于起步階段。隨著人們對骨髓MSCs的不斷認識，以及對肝再生機理的進一步深入研究，骨髓MSCs治療ALF有望取得突破性的進展。
