引用本文： 張夢澤, 葛春林, 張雨京. MyD88在重癥急性胰腺炎胰腺組織中表達及意義的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(3): 345-348. doi: 10.7507/1007-9424.20140080 復制
Toll樣受體（TLR）在胰腺炎發病機理中的作用已被承認[1]，但其下游蛋白即髓樣細胞分化蛋白88（MyD88）對胰腺炎的作用尚不明確。Koike等[2]發現，無論是否誘導或誘導方法是什么，在小鼠胰腺組織中都有MyD88的表達。本實驗通過構建重癥急性胰腺炎（SAP）小鼠模型，檢測其血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）[3]等的濃度，同時檢測胰腺組織中MyD88和核因子-κB（NF-κB）mRNA的表達水平，以探討MyD88在SAP發病機理中的作用。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要試劑和設備
SPF級Bal b/c小鼠48只，雌雄各24只，6～8周齡，體質量22～26 g，由中國醫科大學動物部提供。L-精氨酸（國藥集團化學試劑有限公司），EILSA試劑盒（武漢博士德生物公司），逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（南京金斯瑞生物科技公司提供），酶標儀（SUNRISE，瑞士Tecan公司），TP800 RT-PCR儀（日本Takara公司）。
1.2 動物分組及模型制備
將48只小鼠按雌雄1︰1分開后，分別按隨機數字表法隨機分為SAP組（32只）與正常對照組（16只）；再將2組小鼠隨機（隨機數字表）分為6、12、24及48 h組，SAP組每個亞組8只，正常對照組每個亞組4只。SAP組小鼠采用腹腔注射20% L-精氨酸的方法構建SAP模型，劑量為3.5 mg/g，分2次注射，首次注射為實驗當天上午8時，間隔1 h后注射第2次。正常對照組小鼠腹腔注射相等體積量的生理鹽水。
1.3 標本取材
在相應時點以1.5%戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，麻醉成功后以腹主動脈取血方法[4]處死小鼠。常規消毒后沿腹正中線剖開腹腔，輕柔操作并暴露腹主動脈，術者右手持1 mL注射器，針尖斜面向下25°～30°于向心端刺入，緩慢抽吸腹主動脈血1 mL，離心（3 500 r/min，r=9.85 cm，8 min）后取血清分裝，于-80℃條件下凍存。抽血后，SAP組于相應時點快速切取胰腺組織（約1 g）；正常對照組由于無明顯變化，僅于建模后6 h取胰腺組織（約0.5 g），組織均于-80℃條件下凍存。
1.4 觀察指標及檢測方法
①采用ELISA方法檢測外周血中的白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-10（IL-10）及TNF-α濃度，操作均按試劑盒說明書進行。②采用RT-PCR技術檢測胰腺組織中MyD88和NF-κB mRNA的表達。先采用Trizol一步法抽提組織中的總RNA，再用紫外分光光度儀測定A260 /A280（1.76～1.97），以瓊脂糖凝膠電泳法檢測28 s/18 s（1.69～1.96），結果基本符合要求。其他步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。目的基因MyD88基因、NF-κB基因及內參β-actin基因的引物序列見表 1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。采用相對定量法，利用內參基因β-actin為參照計算目的基因的相對表達量。③胰腺組織以甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，3～4μm厚切片，行HE染色，在顯微鏡下（400倍）觀察胰腺組織的病理學改變。
表1
RT-PCR的引物序列
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 2組小鼠胰腺組織的病理學改變
SAP組小鼠建模后，因小鼠體質較弱，于24 h時死亡1只，48 h時死亡1只。SAP各亞組小鼠處死后，大體可見腹腔臟器改變隨時間推移由輕向重過渡，6 h時僅比正常對照組小鼠的胰腺略有增大；而發展至24 h后腹腔內可見大量淡紅色液體，胰腺水腫壞死嚴重。顯微鏡下觀察正常對照組小鼠的胰腺組織結構清晰，無炎癥細胞浸潤。SAP-6 h組小鼠的胰腺腺泡結構尚完整，小葉間隔清晰，與正常對照組比較差異不明顯；12 h時表現為胰腺水腫、充血及炎癥細胞浸潤，小葉間隙略有增寬但結構完好；24 h時見胰腺小葉結構紊亂、水腫，周圍脂肪組織明顯充血、炎癥細胞浸潤；48 h時見腺泡腫脹，胰腺大片壞死，壞死區炎癥細胞浸潤，小葉缺失，部分腺泡呈孤島狀（圖 1）。
圖1
示SAP組和正常對照組小鼠胰腺組織的病理學檢查結果（HE ×400）。1A：正常對照組；1B：SAP-12 h組；1C：SAP-48 h組
2.2 2組小鼠的血清IL-1β、IL-10及TNF-α濃度和胰腺組織MyD88及NF-κB mRNA的表達結果
各時點SAP組小鼠的IL-1β、IL-10及TNF-α濃度均高于正常對照組（P＜0.05）。各時點SAP組與正常對照組（6 h組）相比較，其胰腺組織中MyD88 mRNA及NF-κB mRNA的表達水平均較高（P＜0.05）。通過對6 h組和12 h組、12 h組和24 h組、24 h組和48 h組的比較發現：①正常對照組的IL-1β、IL-10及TNF-α濃度各時點均基本穩定，變化不大（P＞0.05）。②SAP各亞組的IL-1β和IL-10水平除12 h組與24 h組比較差異均有統計學意義外（P＜0.05），余均無明顯差異（P＞0.05）；6 h組和12 h組、24 h組和48 h組的TNF-α濃度比較差異均有統計學意義（P＜0.05），12 h組與24 h組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；3對組間比較，MyD88 mRNA表達水平的差異均有統計學意義（P＜0.05）；NF-κB mRNA的表達水平除6 h組與12 h組比較差異有統計學意義外（P＜0.05），余均無明顯差異（P＞0.05）。見表 2。
表2
2組小鼠各時點檢測指標比較結果（2.3 MyD88 mRNA表達與其他指標的關系
將SAP組各亞組MyD88 mRNA的表達水平與IL-1β、IL-10、TNF-α的濃度以及NF-κB mRNA的表達水平進行相關性分析，結果發現，MyD88 mRNA的表達水平同其他指標均呈一致性同步變化，具有良好的相關性（P＜0.01）。見表 3。
表3
SAP組小鼠各時點MyD88 mRNA的表達水平與其他指標的相關性分析結果
3 討論
近年來的研究[5-7]表明，抑制IL-1β、TNF-α、IL-10等炎癥細胞因子的表達可以減輕胰腺炎的嚴重程度。國外研究[8-11]顯示，TLR通路在急性胰腺炎的發病機理中發揮作用，與野生型小鼠相比，幾乎所有的TLR缺陷小鼠，尤其是TLR4缺陷的小鼠，其胰腺炎的嚴重程度都明顯減輕。TLR通路激活信號通過MyD88的傳導，最終導致促炎細胞因子表達上調和多種機體防御蛋白的轉錄，如IL-1β、TNF-α等[12-13]。而作為TLR通路整體結構的“瓶頸”[14]——MyD88，對其在TLR通路中發揮的作用的具體研究較少。
本實驗在總結了以往研究的基礎上，檢測了胰腺組織中MyD88 mRNA與NF-κB mRNA的表達水平及血清相關炎癥因子的濃度，同時分析了MyD88 mRNA的表達水平與相關炎癥因子在急性胰腺炎發展中的相關性。結果顯示，在SAP組，12～24 h時IL-1β濃度增高（P＜0.05）；IL-10濃度在12 h時略微下降，24 h升高（P＜0.05）；TNF-α濃度在6～12 h以及24～48 h兩個時段改變明顯（P＜0.05）；MyD88 mRNA的表達水平在前3個時點隨時間的增加而增高（P＜0.05），而在48 h有所下降（P＜0.05）；NF-κB mRNA的表達水平在6～12 h時增高（P＜0.05），12 h后變動不明顯，在24～48 h呈現一個平臺期。病理學檢查結果提示，前3個時點的病理損傷逐漸加重，在時間上，這與MyD88 mRNA的表達水平逐步升高基本一致。而由于病理損傷是一個漸變的過程，在48 h后由于損傷因素仍然存在，所以病理學改變會繼續進展。MyD88 mRNA與NF-κB mRNA的表達水平及血清炎癥因子（IL-1β、TNF-α及IL-10）的濃度在各個時點上都存在相關性（P＜0.01），提示MyD88 mRNA的表達水平高低可能影響了與胰腺炎炎癥相關因子（NF-κB、IL-1β、TNF-α及IL-10）的表達與濃度，而這些因素的表達與濃度正是急性胰腺炎嚴重程度的決定因素。Neuh?fer等[15]的實驗研究表明，對正常和抑制了NF-κB表達的小鼠分別建立L-精氨酸誘導的急性胰腺炎模型后，抑制了NF-κB表達的小鼠比正常小鼠其炎癥因子（如IL-1β、TNF-α等）的表達水平低，這也間接證實了MyD88的作用。MyD88的變化影響了這些決定胰腺炎炎癥發生和發展的因素，從而對胰腺炎的發生和發展發揮一定的作用。因此，在急性胰腺炎的治療中可以以此為突破點，以控制炎癥的進展。但本實驗的觀察時間尚較短，在48 h之后的情況需要進一步研究。
Toll樣受體（TLR）在胰腺炎發病機理中的作用已被承認[1]，但其下游蛋白即髓樣細胞分化蛋白88（MyD88）對胰腺炎的作用尚不明確。Koike等[2]發現，無論是否誘導或誘導方法是什么，在小鼠胰腺組織中都有MyD88的表達。本實驗通過構建重癥急性胰腺炎（SAP）小鼠模型，檢測其血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）[3]等的濃度，同時檢測胰腺組織中MyD88和核因子-κB（NF-κB）mRNA的表達水平，以探討MyD88在SAP發病機理中的作用。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要試劑和設備
SPF級Bal b/c小鼠48只，雌雄各24只，6～8周齡，體質量22～26 g，由中國醫科大學動物部提供。L-精氨酸（國藥集團化學試劑有限公司），EILSA試劑盒（武漢博士德生物公司），逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（南京金斯瑞生物科技公司提供），酶標儀（SUNRISE，瑞士Tecan公司），TP800 RT-PCR儀（日本Takara公司）。
1.2 動物分組及模型制備
將48只小鼠按雌雄1︰1分開后，分別按隨機數字表法隨機分為SAP組（32只）與正常對照組（16只）；再將2組小鼠隨機（隨機數字表）分為6、12、24及48 h組，SAP組每個亞組8只，正常對照組每個亞組4只。SAP組小鼠采用腹腔注射20% L-精氨酸的方法構建SAP模型，劑量為3.5 mg/g，分2次注射，首次注射為實驗當天上午8時，間隔1 h后注射第2次。正常對照組小鼠腹腔注射相等體積量的生理鹽水。
1.3 標本取材
在相應時點以1.5%戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，麻醉成功后以腹主動脈取血方法[4]處死小鼠。常規消毒后沿腹正中線剖開腹腔，輕柔操作并暴露腹主動脈，術者右手持1 mL注射器，針尖斜面向下25°～30°于向心端刺入，緩慢抽吸腹主動脈血1 mL，離心（3 500 r/min，r=9.85 cm，8 min）后取血清分裝，于-80℃條件下凍存。抽血后，SAP組于相應時點快速切取胰腺組織（約1 g）；正常對照組由于無明顯變化，僅于建模后6 h取胰腺組織（約0.5 g），組織均于-80℃條件下凍存。
1.4 觀察指標及檢測方法
①采用ELISA方法檢測外周血中的白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-10（IL-10）及TNF-α濃度，操作均按試劑盒說明書進行。②采用RT-PCR技術檢測胰腺組織中MyD88和NF-κB mRNA的表達。先采用Trizol一步法抽提組織中的總RNA，再用紫外分光光度儀測定A260 /A280（1.76～1.97），以瓊脂糖凝膠電泳法檢測28 s/18 s（1.69～1.96），結果基本符合要求。其他步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。目的基因MyD88基因、NF-κB基因及內參β-actin基因的引物序列見表 1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。采用相對定量法，利用內參基因β-actin為參照計算目的基因的相對表達量。③胰腺組織以甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，3～4μm厚切片，行HE染色，在顯微鏡下（400倍）觀察胰腺組織的病理學改變。
表1
RT-PCR的引物序列
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 2組小鼠胰腺組織的病理學改變
SAP組小鼠建模后，因小鼠體質較弱，于24 h時死亡1只，48 h時死亡1只。SAP各亞組小鼠處死后，大體可見腹腔臟器改變隨時間推移由輕向重過渡，6 h時僅比正常對照組小鼠的胰腺略有增大；而發展至24 h后腹腔內可見大量淡紅色液體，胰腺水腫壞死嚴重。顯微鏡下觀察正常對照組小鼠的胰腺組織結構清晰，無炎癥細胞浸潤。SAP-6 h組小鼠的胰腺腺泡結構尚完整，小葉間隔清晰，與正常對照組比較差異不明顯；12 h時表現為胰腺水腫、充血及炎癥細胞浸潤，小葉間隙略有增寬但結構完好；24 h時見胰腺小葉結構紊亂、水腫，周圍脂肪組織明顯充血、炎癥細胞浸潤；48 h時見腺泡腫脹，胰腺大片壞死，壞死區炎癥細胞浸潤，小葉缺失，部分腺泡呈孤島狀（圖 1）。
圖1
示SAP組和正常對照組小鼠胰腺組織的病理學檢查結果（HE ×400）。1A：正常對照組；1B：SAP-12 h組；1C：SAP-48 h組
2.2 2組小鼠的血清IL-1β、IL-10及TNF-α濃度和胰腺組織MyD88及NF-κB mRNA的表達結果
各時點SAP組小鼠的IL-1β、IL-10及TNF-α濃度均高于正常對照組（P＜0.05）。各時點SAP組與正常對照組（6 h組）相比較，其胰腺組織中MyD88 mRNA及NF-κB mRNA的表達水平均較高（P＜0.05）。通過對6 h組和12 h組、12 h組和24 h組、24 h組和48 h組的比較發現：①正常對照組的IL-1β、IL-10及TNF-α濃度各時點均基本穩定，變化不大（P＞0.05）。②SAP各亞組的IL-1β和IL-10水平除12 h組與24 h組比較差異均有統計學意義外（P＜0.05），余均無明顯差異（P＞0.05）；6 h組和12 h組、24 h組和48 h組的TNF-α濃度比較差異均有統計學意義（P＜0.05），12 h組與24 h組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；3對組間比較，MyD88 mRNA表達水平的差異均有統計學意義（P＜0.05）；NF-κB mRNA的表達水平除6 h組與12 h組比較差異有統計學意義外（P＜0.05），余均無明顯差異（P＞0.05）。見表 2。
表2
2組小鼠各時點檢測指標比較結果（2.3 MyD88 mRNA表達與其他指標的關系
將SAP組各亞組MyD88 mRNA的表達水平與IL-1β、IL-10、TNF-α的濃度以及NF-κB mRNA的表達水平進行相關性分析，結果發現，MyD88 mRNA的表達水平同其他指標均呈一致性同步變化，具有良好的相關性（P＜0.01）。見表 3。
表3
SAP組小鼠各時點MyD88 mRNA的表達水平與其他指標的相關性分析結果
3 討論
近年來的研究[5-7]表明，抑制IL-1β、TNF-α、IL-10等炎癥細胞因子的表達可以減輕胰腺炎的嚴重程度。國外研究[8-11]顯示，TLR通路在急性胰腺炎的發病機理中發揮作用，與野生型小鼠相比，幾乎所有的TLR缺陷小鼠，尤其是TLR4缺陷的小鼠，其胰腺炎的嚴重程度都明顯減輕。TLR通路激活信號通過MyD88的傳導，最終導致促炎細胞因子表達上調和多種機體防御蛋白的轉錄，如IL-1β、TNF-α等[12-13]。而作為TLR通路整體結構的“瓶頸”[14]——MyD88，對其在TLR通路中發揮的作用的具體研究較少。
本實驗在總結了以往研究的基礎上，檢測了胰腺組織中MyD88 mRNA與NF-κB mRNA的表達水平及血清相關炎癥因子的濃度，同時分析了MyD88 mRNA的表達水平與相關炎癥因子在急性胰腺炎發展中的相關性。結果顯示，在SAP組，12～24 h時IL-1β濃度增高（P＜0.05）；IL-10濃度在12 h時略微下降，24 h升高（P＜0.05）；TNF-α濃度在6～12 h以及24～48 h兩個時段改變明顯（P＜0.05）；MyD88 mRNA的表達水平在前3個時點隨時間的增加而增高（P＜0.05），而在48 h有所下降（P＜0.05）；NF-κB mRNA的表達水平在6～12 h時增高（P＜0.05），12 h后變動不明顯，在24～48 h呈現一個平臺期。病理學檢查結果提示，前3個時點的病理損傷逐漸加重，在時間上，這與MyD88 mRNA的表達水平逐步升高基本一致。而由于病理損傷是一個漸變的過程，在48 h后由于損傷因素仍然存在，所以病理學改變會繼續進展。MyD88 mRNA與NF-κB mRNA的表達水平及血清炎癥因子（IL-1β、TNF-α及IL-10）的濃度在各個時點上都存在相關性（P＜0.01），提示MyD88 mRNA的表達水平高低可能影響了與胰腺炎炎癥相關因子（NF-κB、IL-1β、TNF-α及IL-10）的表達與濃度，而這些因素的表達與濃度正是急性胰腺炎嚴重程度的決定因素。Neuh?fer等[15]的實驗研究表明，對正常和抑制了NF-κB表達的小鼠分別建立L-精氨酸誘導的急性胰腺炎模型后，抑制了NF-κB表達的小鼠比正常小鼠其炎癥因子（如IL-1β、TNF-α等）的表達水平低，這也間接證實了MyD88的作用。MyD88的變化影響了這些決定胰腺炎炎癥發生和發展的因素，從而對胰腺炎的發生和發展發揮一定的作用。因此，在急性胰腺炎的治療中可以以此為突破點，以控制炎癥的進展。但本實驗的觀察時間尚較短，在48 h之后的情況需要進一步研究。
